COLO205

あなたの細胞の成功した培養:

*ECACCが供給する細胞株*を取り扱う前に、以下の重要な技術情報をお読みください。 この情報は、”カスタマーサポート”（ここをクリック）の下に、私たちのメインメニューからPDFとしても利用可能です。

冷凍細胞の保存

受領時に、凍結アンプルは、すぐに使用しない限り、遅滞なく気相液体窒素に直接移送する必要があります。 代わりとして-80°cのフリーザーを使用しないで下さい;これは実行可能性の損失で起因します。

領収書に凍結した細胞を処理する方法

冷凍ECACC供給細胞株の出荷を受け取った時点で、エンドユーザーが遅滞なく出荷に注意を払うことが重要です。 ドライアイスからアンプルを除去する前に、細胞株に付随する技術的助言を相談する必要があります。 受領後すぐに正しい処理は、エンドユーザーの実験室で細胞株を正常に確立するために重要です。

細胞株が注文される時点で、エンドユーザーはまた、新しい細胞株の培養条件を考慮し、細胞が到着したときに適切な培地が利用可能であることを確認す

セルカウントの重要性

あなたが蘇生し、細胞培養物を収穫するときに生細胞数を実行します。 培養中に細胞を確立できない最も一般的な理由の一つは、蘇生時に誤った生細胞播種密度を使用すること、すなわち細胞を播種することが低すぎる これは、生細胞数を実行し、推奨される播種密度に従うことによって回避することができる。

あなたが作業している特定の細胞株については、当社のウェブサイトのページの”説明”タブの下に提供される情報をお読みください。 その情報は、セルラインのデータシートにも記載されており、セルラインの出荷時にハードコピーとして提供されます。 播種密度は継代培養ルーチン情報に示されている。 蘇生直後に細胞を播種する場合は、与えられた播種密度範囲の中央から上端を使用します。

凍結細胞の蘇生

凍結したアンプルを慎重に扱うことが重要です。 まれに、アンプルは閉じ込められた残留液体窒素の膨張のために温暖化で爆発することがあります。

1. 微生物学的安全キャビネットでは、凍結したアンプルの帽子のまわりで70%アルコールで浸されるティッシュを握りなさい。 捕獲されるかもしれない残りの液体窒素を解放するために帽子を四分の一回転回して下さい。 キャップを締め直す。 アンプルを37℃の水浴に素早く移し、もしあれば1つまたは2つの小さな氷の結晶が残るまで（1-2分）。 細胞膜への損傷を最小にするために急速に雪解けすることは重要です。
注:アンプルを完全に浸さないでください。

2. 開封前に70％アルコールに浸した組織でアンプルを拭きます。

3. アンプルの全内容物を滅菌チューブ（例えば15mlの容量）にピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペットでピペット その後、適切な成分がすでに補充されている5mlの予め温められた培地をゆっくりと加えます。 細胞または同等の細胞計数法を計数するために、トリパンブルー染色、血球計および倒立顕微鏡を用いて生細胞密度を決定する。 細胞株のデータ入力に推奨される細胞播種密度を達成するために、適切な量の細胞懸濁液を移送する。

付着性細胞株の場合：培地の体積を調整し、必要に応じてフラスコのサイズを調整して、細胞株データシートで推奨される細胞播種密度を達成します。 凍結保護剤を除去するための前遠心分離ステップは、通常、最初の培地の変化が残留凍結保護剤を除去するので、必要ではない。 そうであれば、これはデータシートに指定されます。 細胞が継代培養されるのではなく、直ちに（例えば細胞ベースのアッセイのために）使用される場合、凍結保護剤を除去するために前遠心分離ステップを

懸濁液細胞株*の場合：凍結保護剤を除去するための事前遠心分離ステップが推奨される。 150x gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、適切な容積を使用して新鮮な培地に細胞ペレットを再懸濁し、正しい播種密度を達成する。

1. データシートで推奨されている温度とCO2レベルでフラスコをインキュベートします。 二酸化炭素によって与えられる定温器が使用されればフラスコは気体交換を可能にする出された帽子を備えているべきである。

凍結からのハイブリドーマ培養

凍結からハイブリドーマ培養物を回収する場合、成長が最初に予想よりも遅くなることは珍しくなく、生存率の低下が観察される可能性がある。 積極的に増殖する文化の確立には最大2週間かかることがあります。

蘇生時には、凍結保護剤を除去するための遠心分離ステップが不可欠である。 凍結したアンプルを37℃の水浴中で1-2分間急速に解凍する。 内容物を遠心分離機管に移し、予め温められた成長培地+の5-10mlをゆっくりと加える。 カウントのためのサンプルを削除します。 100x gで2-3分間遠心分離して、細胞をペレット化し、5-7×105細胞/mlの比較的高い密度で播種する。 培養フラスコを平らに置き、生存可能な増殖細胞が見られるまで定期的に観察する。

+多くの場合、ハイブリドーマ培養は、蘇生直後の培養確立の初期の重要な段階で20％FBSを補充した培地で再懸濁されることから利益を得ることができる。

細胞を凍結するための手順

ECACCは、予防措置として、受領後すぐに（2-4×106細胞/mlの間）細胞株の在庫を凍結することを推奨しています。

以下のガイドは、細胞株の調製および凍結保存のために提供される。

1. 日常的な継代培養に使用したのと同じ方法で、成長の対数期の細胞を収穫する。 付着性細胞株については、可能な限り80-90％のコンフルエンスに近い収穫を行う。

2. 標準的な手順は、データシートに特に明記されていない限り、すべての細胞株に対して90％血清+10％凍結保護剤を使用することです。 各アンプルのための1mlを許可して下さい。 ほとんどの細胞株は、20％血清および10％凍結保護剤を補充した適切な培養培地中で凍結することができる。 これは通常DMSOですが、ある特定の例でグリセロールは推薦されます。 DMSOが適切でない場合は、代替案が細胞株データシートに記載されます。

3. 例えば、１ ５ ０ｘｇを５分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。 細胞ペレットを適切な凍結培地に再懸濁し、2-4×106細胞/mlの間の最終細胞濃度を得、各アンプルに1mlをピペットでピペットする。

4. プログラム可能な速度制御のフリーザーか適したalternative1を使用して1-3oc/min間の冷却率で細胞を凍らせて下さい。 温度が少なくとも-130ocに達するとき、アンプルを気相液体窒素の貯蔵容器に移して下さい。