Gap junction protein Connexin-43is a direct transcriptional regulator of N-cadherin in vivo

胚操作

成人X.laevisは17℃で維持され、University College LondonのBiological Service Unitの規則に従って使用され、動物法で定められた英国内務省のガイドラインに従って使用された。1986年（昭和45年）4月1日に廃止された。 X.laevis胚を得て、以前に記載されたように段階化した46,47。 神経堤を特異的に標的とするために、胚は、胚溶解物を使用した場合を除いて、すべての実験のために片側の八細胞段階で動物の腹側割球に注入された。 この場合、胚は、二細胞期の胚の両方の動物側に注入された。 胚マイクロインジェクションは、48に従って行われた。 必要に応じて、フルオレセイン−デキストラン（Ｆｄｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄ１ ８ ２ １，２ ０ｎｇ）またはローダミン−デキストラン（Ｒｄｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄ１ ８ ２ ４，２ ０ｎｇ）をトレーサーとして使用した。 X.laevis Cx43に対するオリゴモルフォリン（Cx43Mo1;8-24ng,5′-T T C C T A AGGCACTCCAGTCACCCAT-3′,Cx43Mo2; ８〜２ ４ｎｇ、５’−ＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＧＡ−３’）およびＢＴＦ３（ＢＴＦ３ＭＯ、４ ０ｎｇ、５’−ＡＡＣＧＧＡＣＣＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＣＣＴ−３’）を合成し、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣによって提供した。 標準対照モルホリノの等モル濃度（ＣＴＬＭＯ：３’−ＡＴＡＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣ−５’）を使用した。 モルフォリノの量は八細胞期はいの一方の側に注入された量に対応し、他方の側は内部対照として使用された。 胚を胚溶解物の収集のために使用した場合、それらは、両方の動物割球に二細胞段階で注入され、言及された用量の二重を使用した。 内因性cx43mRNA上のCx43Mosの効率をテストするために、我々はウェスタンブロット分析を行った。 Ｃｘ４ ３Ｍｏｓは、両方とも、内因性Ｃｘ４ ３ＦｌおよびＣｘ４ ３Ｉｓｏのタンパク質レベルを効率的に低下させた（図３）。 3a、b）。 ＢＴＦ３ＭＯ効率を検証するために、本発明者らは、神経堤細胞の免疫染色によって、ＣＴＬＭＯと比較してＢＴＦ３ＭＯ細胞におけるｂｔｆ３のレベルの低下を示したｂｔｆ３タ 3a）。

In situハイブリダイゼーションは、前述のように実施した49,50。 簡単に言えば、胚はMEMPFAに固定され、ジゴキシゲニン標識プローブと一晩ハイブリダイゼーションに続いて、AP抗体とインキュベートし、AP活性はNBT/BCP基質を用い ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを、ＦＯＸＤ３ ４ ８ｓｎａｉｌ２ ５ １、ｔｗｉｓｔ５ ２、ｎ−カドヘリン５ ３、Ｃ３ ５ ３、ｂｔｆ３（Ｘｅｎｂａｓｅ：Ｘｌ０ ７ ５Ｉ２ ２）、およびｓｏｘ１ ０ ５ ４、ｓｏｘ９ ５ ４のために調製した。 Ｃ３（１μ ｇ／ｍｌ）、ｓｎａｉｌ２（０.８μ ｇ／ｍｌ）、ＦｏｘＤ３（２μ ｇ／ｍｌ）、ｓｏｘ１ ０（１μ ｇ／ｍｌ）、ｓｏｘ９（１μ ｇ／ｍｌ）、およびｔｗｉｓｔ（０.７μ ｇ／ｍｌ）を使用して、神経堤誘導、ｔｗｉｓｔ（０.８μ ｇ／ｍｌ）およびＴｗｉｓｔ（０.９μ ｇ／ｍｌ）を評価した。神経堤遊走のためのn-カドヘリン（1μ g/mL）、発現レベルおよびbtf3（0.7μ g/mL）発現パターンを評価するためのn-カドヘリン（1μ g/mL）。 全マウント免疫染色は、前述のようにＣ Ｘ４ ３抗体（１：１ ０ ０ ０、Ｓｉｇｍａ、Ｃ６ ２ １ ９）を用いて実施した。 簡単に説明すると、胚をＭＥＰＭＦＡに固定し、記載された希釈液で抗体と共に一晩インキュベートした。

動物キャップ外植片は、標準的な技術48、56を用いてアフリカツメガエルblastulas（ステージ8）から解剖し、上記のようにin situ-hybridizationのために調製しました。 動物ｃａｐアッセイのために、５ ０ ０ｐｇ ｍＲＮＡを、２細胞期の胚の２つの割球の動物側に注入した。 ISHの分析は、各独立した実験のための条件ごとに20-25胚に対して行われました。

神経堤の操作とイメージング

神経堤の移植は、以前に報告されたように行われた57。 簡単に言えば、段階18蛍光標識胚から採取した神経堤は、眉ナイフで解剖し、標識されていない宿主胚に移植された。 In vitro実験のために、頭蓋神経堤外植片は、標準的なtechnique58、59を使用してステージ18で解剖され、以前に記載されているようにフィブロネクチン（シグマ、F1141）コーテ 単一細胞アッセイのために、神経堤細胞は、Ca2+/Mg2+フリー Danilchick medium53で簡単に解離しました。 各条件について、蛍光標識されたＮＣを移植した１ ０個の胚を実験ごとに分析した。

免疫染色は、抗N-カドヘリン（1：50、ラットIgG、クローンMNCD2、DSHB）、抗E-カドヘリン（1）を用いて、以前に記載されているように神経堤外植片に対して行われた54:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. In vitro神経堤遊走のイメージングは、previously53,60に記載されているようにタイムラプス映画撮影を用いて行われた。 簡単に言えば、神経堤細胞は、フィブロネクチンでコーティングされたプラスチックまたはガラスのペトリ皿で培養し、in vitro培養の一時間後にタイムラプスマイクロコピーを開始しました。 細胞の運動性と移動のために、電動ステージと10×/0.30NAドライレンズを備えた複合顕微鏡（浜松デジタルカメラ付きEclipse80i Nikon顕微鏡または簡単なPCIプログ ＮＣ培養物を上記のように調製した。 細胞形態イメージングのために、63×/0.90NA水浸対物レンズを備え、LAS–AFソフトウェアによって制御されたTCS SP8顕微鏡を使用した。 ４ＮＡ油浸対物レンズおよびＬＡＳ−Ａ Ｆソフトウェアによって制御されたＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ Ｅ共焦点顕微鏡を使用して、固定細胞を撮像した。

構築物の局在化または内因性IFレベルについて、実験ごとに各条件について10〜15個のNccを分析した。

細胞遊走および細胞形態分析

走化性アッセイは、1μ g/mL精製ヒト間質細胞由来因子-1（Sigma、SRP3276）でコーティングされたヘパリンアクリルビーズ（Sigma、H5263）を用いた標準的な手順61に従って行った。 細胞の運動性および走化性を、前に記載したように、Ｉｍａｇｅｊ（＜２ ９ ９ ９＞）分析ツールを用いて分析した５ ３、６ ０。 手短に言えば、個々の細胞は、ＩｍａｇｅｊのＭａｎｕａｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｐｌｕｇｉｎを使用して手動で追跡され、データは、ＩｍａｇｅｊのＣｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｐｌｕｇｉｎを使用して収集され、分析された。 細胞形態は、円度指数（完全な円=1）を展開することによって評価され、ImageJ分析ツールによって推定された。 細胞分散をDelaunay triangulation algorithm(ImageJ)を用いて分析し、前に記載したように平均外植三角形面積としてプロットした。 細胞突出領域は、4分の時間間隔で二つの連続した時間枠から派生した成長領域を測定外植片のエッジで神経堤細胞で分析した。 細胞走化性および細胞分散の分析のために、10-15個の外植片を、それぞれの独立した実験の条件ごとに分析した。 細胞の運動性については、細胞形態および細胞突起15-25Nccは、実験ごとの条件ごとに分析した。

分子生物学、プラスミド、試薬

cDNA合成のために、各独立した実験の条件ごとにX.laevisから10-15胚ステージ23-24または10-15動物キャップステージ8から全RNAを単離し、各実験内で三つの技術的なレプリカを使用した25。 Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.テンプレートとして1109）。 完全長Ｃ Ｘ４ ３（Ｃｘ４ ３Ｆｌ、ａ ａ１−３ ７ ９）、Ｃｘ４ ３カルボキシ末端切断構築物（Ｃｘ４ ３Ｔｒｕｎｃ、ａ Ａ１−２ １ ２）およびＣｘ４ ３−２ ０ｋ構築物（Ｃｘ４ ３Ｔａｉｌ、ａ ａ２ １ ３−３ ７ ９）を、ＰＣＳ２＋またはＰＣＳ２−ＥＧＦＰベクターの５’Ｂａｍｈｉ／３’Ｘｈｏｉ ＰＣＳ２−ＥＧＦＰベクターは、多田雅博士によって親切に提供された。 Cx43Tailの誘導性構築物は、Cx43-20ktail（aa219-379）をヒトGR（aa512-777）のリガンド結合ドメインに融合させることによって調製した。 Ｃｘ４ ３−２ ０ｋを、ＰＣＳ２＋およびＰＣＳ２−ＥＧＦＰの５’Ｅｃｏｒｉ／３’ＡｃｉおよびＧＲにクローニングした。 ＢＴＦ３構築物をＸを用いて合成した。 ｃＤＮＡクローンからのｌａｅｖｉｓ配列（Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ Ｘ Ｌ． ＢＴＦ３ＦＬ（ａ ａ１−１ ６ ２）を、ＰＣＳ２＋またはＰＣＳ２−ＥＧＦＰの５’Ｅｃｏｒｉ／３’Ｘｈｏｉにクローニングした。 ＮＬＳ領域ＲＲＫＫＫを欠くＢＴＦ３欠失構築物（ＢＴＦ３−ＤＮＬＳ、ａ ａ１−１ ５ ８）を、ＰＣＳ２＋の５’Ｂａｍｈｉ／３’Ｃｌａｉにクローニングした。 Ｂｉｆｃ実験のために（図１）。 図４Ｂ、ｃ）、Ｃｘ４ ３ＴａｉｌおよびＣｘ４ ３Ｔｒｕｎｃを、ＰＣＳ２−ＶＣ１ ５ ５の５’Ｂａｍｈｉ／３’Ｂａｍｈｉにクローニングした。 ＢＴＦ３ＦＬを、ＰＣＳ２−Ｖｎ９Ｍの５’Ｂａｍｈｉ／３’Ｂａｍｈｉにクローニングした。Ｂｉｆｃベクターは、Ｊａｍｅｓ Ｃ． 全ての構築物配列は、自動ＤＮＡ配列決定（Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）によって検証される。 When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); Δ Σ213Cx43(800pg/胚,63)。

蛍光構築物のすべての分析は、背景蛍光を正規化し、必要に応じて全細胞領域蛍光を正規化することによって評価した。

以下の試薬を使用した: 培養液に、フルフェナム酸（ＮＣ外植培養用５ ０μ Ｍ−胚処理用１ ０ ０μ Ｍ、Ｓｉｇｍａ、Ｆ９ ０ ０ ５）、メクロフェナム酸（ＮＣ外植培養用５ ０μ Ｍ−胚処理用１ ０ ０μ Ｍ、Ｓｉｇｍａ、Ｍ４ ５ ３ １）、アクチノマイシンＤ（２ ０μ Ｍ、Ｓｉｇｍａ、Ａ１ ４ １ ０）、ＣＨＸ（１ ０μ Ｍ、Ｓｉｇｍａ、Ｃ７ ６ ９ ８）14−15および神経堤遊走胚段階（ステージ23）まで維持された。 誘導性キメラの漏出の可能性を制御するために，はいの兄弟バッチをデキサメタゾンなしで培養し，ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために処理した。 カップリング試験（ギャップ接合チャネル活性の試験）のために、10-15Nccは、実験ごとの条件ごとに分析しました。

免疫沈降、分画、およびウェスタンブロッティング

各条件について、実験ごとに胚溶解物の調製に10-15個の胚を使用しました。 全胚を、プロテアーゼ阻害剤（Roche、11836153001）およびホスファターゼ阻害剤（Roche、04906837001）を加えた溶解緩衝液（20mM Tris、100mM NaCl、0.01％Triton-X、pH8.0）中で均質化した後、ウェスタンブロット用に調製した54,64。 ウェスタンブロットの場合、以下の抗体を使用した: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); 簡単に説明すると、細胞を溶解緩衝液中に懸濁し、４℃で２ ０，０ ０ ０×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、希釈緩衝液で体積を調整した。 ビーズを希釈緩衝液中で平衡化し、再懸濁した細胞溶解物と混合した。 混合物を磁気的に精製し、ウェスタンブロット用に調製した。 X.laevis胚の核画分単離は、変更64、65と差動遠心分離プロトコルを使用して行われました。 簡単に説明すると、２ ２Ｇの針および２ ０μ ｌの均質化緩衝液（Ｈ Ｂ）を使用して、段階１ ８Ｘ．ｌａｅｖｉｓ胚溶解物を調製する。: 胚あたり２ ５ ０ｍ Ｍスクロース、２ ０ｍ Ｍ Ｈｅｐｅｓ、１ ０ｍ Ｍ Ｋｃｌ、１ｍ Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍ Ｍ ＥＧＴＡ、１ｍ Ｍ ＤＴＴ、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤）。 全ての試料を２ ５ ０×ｇで５分間遠心分離し、胚の破片を除去した。 上清を回収した後、それを３つの異なる管に分配し、３つの異なる速度（４ ０ ０×ｇ、６ ０ ０×ｇ）で５分間紡糸して、細胞核を単離した。 核後の上清をさらなる処理のために保持した。 核ペレットを緩衝液Ｈ Ｇ中でもう一度洗浄し、適切な速度（４ ０ ０×ｇ、６ ０ ０×ｇ）で遠心分離した。 次いで、核ペレットをＨ Ｂ中の４ ０μ ｌの１ ０％グリセロール／０.１％ＳＤＳ／１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中に再懸濁した。 各試料に適量の試料緩衝液を添加し，アクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析のために試料を処理した。 負荷誤差を回避するために、前54、64に記載されているように剥離した後、同じ膜を負荷制御に対してブロットした。

ウェスタンブロットのデータはImageJ解析ツールを使用して解析した。 画像強度を正規化し、負荷制御に対する目的のタンパク質の比（すなわち、負荷制御に対する目的のタンパク質の比）を標準化した。、Mapkまたはα-チューブリン）を算出し、平均比をプロットした。 なお、クロップされていないブロットは、補足図として含まれている（補足図。 5–7).＜１ ６ ９ １＞＜５ ９ ４＞細胞培養物＜６ ７ １ ５＞＜８ ８ ５ ０＞Ｈｅｌａ細胞（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏ ｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＤＳＭＺ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１ ０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中で、３ ７℃、１ ０％ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養し、Ｒｏｔｉｆｅｃｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を＜１ ６ ９ １＞＜８ ８ ５ ０＞アフリカツメガエル胚性線維芽細胞（Ｘｔｃ、Ａｎａ Ｌｏｓａｄａからの贈り物）を、１ ０％ウシ胎児血清を添加した６ ７％ＤＭＥＭ／Ｈ２Ｏ中、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、２ ５℃で培養し、ｖｉａｆｅｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ） 形質移入のためのプラスミドは示されたとおりであり、１ ０〜２ ０個のＨｅｌａまたはＸＴＣ細胞を、実験ごとに各条件について分析した。＜１ ６ ９ １＞＜８ ８ ５ ０＞ｓｉＲＮＡ実験では、ＢＴＦ３を標的とする３つのｓｉＲＮＡの組み合わせを上記のようにトランスフェクトした。 標準ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａからのｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ）を対照として使用した。 ＢＴＦ３に対するこれらの市販ｓｉＲＮＡのカタログ番号は、Ｓａｓｉ＿Ｈ Ｓ０ １＿０ ０ １ ２ ４ ５ ６ ７；Ｓａｓｉ＿Ｈ Ｓ０ ２＿０ ０ ３ ０ ８ ３ ３ ７；Ｓａｓｉ＿Ｈ Ｓ０ １＿０ ０ １ ２ ４ ５ ６ ６である。 細胞をトランスフェクションの48時間後に収集し、qPCR、ウェスタンブロット、または免疫組織化学実験のために処理した。 それぞれのセクションで説明したように。

すべての細胞株をマイコプラズマ汚染について試験した。

免疫組織化学およびファロイジン染色

タンパク質検出のために、哺乳類細胞または神経堤外植片を4％ホルムアルデヒド0.2％PBS-T（PBS+0.2％Triton X-100）に10分間固定し、10％NGSで1時間ブロックした。 一次抗体を４℃で１ ０％ＮＧＳ中でインキュベートした。 ５μ ｇ／ｍｌの抗Ｎ−カドヘリン（ＭＮＣＤ２Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈ Ｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、および１ ０％ＮＧＳ中で１：１ ０ ０の抗Ｃｘ４ ３（Ｓｉｇｍａ、Ｃ６ ２ １ ９）を使用し、４℃でインキュベートした。350で10%ngs. ＤＡＰＩを１：１ ０ ０ ０で希釈し、二次抗体と混合した。

質量分析

質量分析のためのフラグタグ付きCx43テールの共免疫沈降のために細胞を溶解し、溶解物を抗HAと一晩インキュベートし、4℃で平衡高親和性ビード、免疫沈降物を洗浄し、溶出した27。 続いて、0.1MグリシンpH2.5での酸溶出の、溶出物のpHは、0.5MトリスでpH8.0に調整された。 タンパク質消化のために、試料を２μ ｇのトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）と共に一晩インキュベートし、続いて０を添加した。ペプチドを、Ｃ−１ ８ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｓｔａｇｅ ｔｉｐｓ（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、ＵＳＡ）上で脱塩し、真空中で乾燥させ、分析まで−２ ０℃で保存した。 乾燥したペプチド混合物を3μ lの30％ギ酸中で回収し、水で希釈して23μ lにした。 消化液５μ ｌをナノＬＣシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ４ ２ ５ ２Ｄ Ｎａｎｏ−ＬＣ；Ｓｃｉｅｘ，ＵＳＡ）上に注入し、ペプチドを、社内で調製したＣ−１ ８カラム（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ Ｃ１ ８−ＡＱ，１． １％のギ酸）から５ ５％の溶離液Ｂ（６ ０％のアクテニトリル、０.１％のギ酸）までの直線勾配中で１ ２ ０分間、１ ０ ０％溶離液Ａ（０.１％のギ酸）から５ ５％溶離液Ｂ（６ ０％のアクテニトリル、０.１％のギ酸） ＬＣシステムを通気カラムとして設定し、試料を負荷し、４ ０ ０ｎｌ／ｍｉｎの流量で脱塩し、分離を２ ０ ０ｎｌ／ｍｉｎの流量で行った。 ナノＬＣシステムを質量分析計（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｈ Ｆ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にハイフネーションし、これをデータ依存モードで操作した。 ２（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）およびＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＬＣ−ＭＳ Ｖ４． データ解釈は、MaxQuant V1.6.1.0およびPerseus V1.6.1.3(MPI of Biochemistry,Germany)を用いて行った。

カップリングアッセイ

ギャップ接合細胞内通信を色素カップリングアッセイを用いて試験した。 ここでは、蛍光色素Ｃａｌｃｅｉｎ−Ａ Ｍ（Ｓｉｇｍａ、１ ７ ７ ８ ３）を用いた。 注入されていない胚から解剖された神経堤集団は、約10分間、または色素がすべての細胞にロードされるまで、色素カルセイン-AMとインキュベートした。 核マーカーを注射した胚からの別の神経堤集団（nRFP mRNA注射、上記参照）を別々に解剖した。 二つの集団は、カルシウムとマグネシウムの非存在下で解離した後、それらを混合し、試験管中で1時間14℃でインキュベートした。 穏やかな遠心分離機に続いて、神経堤外植片を同様のサイズの片に切断し、上記のように培養し、次いで撮影した。 ギャップ接合のチャネル活性を試験するために、ギャップ接合遮断薬；メクロフェナム酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍ４ ５ ３ １）およびフルフェナム酸（Ｓｉｇｍａ、Ｆ９ ０ ０ ５）を使用した。 細胞通信は、核マーカーを有する細胞の総数に対するトレーサー、核マーカーおよびカルセインの両方を表示する細胞の数の比を推定することによって評価した。

統計分析

サンプルサイズの推定は、以前に発表された研究に従うことによって行われ、特定の統計的方法は使用されなかった。 実験は無作為化されておらず、実験の性質上、著者らは実験および結果分析の両方の間に割り当てを盲目にしなかった。 生存可能な胚および外植片のみを分析した。 Mis注入胚は、in situハイブリダイゼーション実験のために含まれていませんでした。 正確な注入は、線形トレーサの注入によって決定された。 我々の実験パラメータは、実行可能な、適切に注入された胚が選択された後、ランダムに測定されました。

分割表66を用いてパーセンテージの比較を行った。 データセットの正常性を、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖの検定、ｄ’ＡｇｏｓｔｉｎｏおよびＰｅａｒｓｏｎの検定、およびＰｒｉｓｍ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用したＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋの検定を使用して試験した。 正規分布に従うデータセットを、ＥｘｃｅｌまたはＰｒｉｓｍ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（両側不等分散）またはＤＵＮＮＥＴＴの多重比較後検定によるＡ ＮＯＶＡと比較した。 正規分布に従わなかったデータセットは、ExcelまたはPrism6を使用して、Mann Whitneyの検定またはノンパラメトリックANOVA（Kruskal Wallis with Dunn’s multiple comparis post-test）を使用して比較しました。 相互比較は、Ａ ＮＯＶＡの全体的なｐ値が０． すべての図の凡例では、N=独立した実験の数;n=合計サンプルサイズ。

laevis n-cadherin部分プロモーター同定

アフリカツメガエルn-cadの基本的なプロモーターを同定するために、我々は以下の戦略を使用しました。 ニワトリおよび哺乳動物のn-カドヘリン遺伝子由来の塩基性プロモーター領域は、翻訳開始部位に関して-3000–1bpの位置内の5′-UTR領域で記載されている41,67。 Ｘ．ｌａｅｖｉｓゲノムプロジェクトリソース（＜４ ５ ９ ５＞）を用いて、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ ｎ−カドヘリン遺伝子の５’−ＵＴＲに２ ８ ０ ０ｂｐの領域を同定した（補足図４）。 4). 我々のデータは、Cx43Tail、BTF-3、およびPol IIが複合体を形成することを示しているので、我々は、我々が分離した領域内の潜在的にアクティブなタタボックスを検索 私たちのin silico分析は、翻訳開始部位（補足図）に対して、位置-166から-618bpの間のタタボックスリッチ領域を明らかにした。 4). 最後に、我々はこの領域全体で200bpの断片を増幅するために重なり合うプライマーを設計します。 プライマー配列は、チップセクションに記載されており、それらの結合領域は、補足図に強調表示されています。 4.

クロマチン免疫沈降（ChIP）

クロマチン免疫沈降（ChiP）については、X.laevis embryos69,70の標準的な手順に従った。 それぞれの独立した実験のために我々は二つの技術的なレプリカと条件ごとに250-300アフリカツメガエル胚を使用しました。 手短に言えば、neurula段階X.laevis胚を15分間固定し、3μ gのPol II抗体（Diagenode、C15100055）またはGFPチップグレード抗体（Abcam、ab290）を使用した。 DNA抽出のために、我々は標準的なprotocol69,70に従った。 要素解析リソースを使用して、Xの推定タタボックスを検索しました。 laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′-GCCAAGTTTTCCCCTTTGTTGT-3′,

P8F:5′-GGAAGCAAATGCTTTTTTCTGTC-3′,

Ｐ８Ｒ：５’−ＡＧＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＧ−３’＜１ ６ ９ １＞＜８ ８ ５ ０＞およびそれらの相対的結合部位を補足図１ １に示す。 チップ実験を以下のように定量した：各条件に対するバンド強度の正規化比を平均化し、Ｉｇｇ対照に対する倍増加を計算し、倍濃縮としてプロットした。 バンド強度はImageJゲル解析プラグインを使用して登録しました。 切断されていないゲルは、補足図に示されている。