III型コラーゲンは、コラーゲンI線維形成および正常な心血管発達にとって重要である
結果と考察
ES(J-1)細胞(22)に、遺伝子のプロモーター領域とシグナルペプチドをコードする最初のエクソンを削除したCol3A1遺伝子ゲノムDNA断片を含むターゲティングベクターをトランスフェクトした(Fig. 1A）。 標的Ｅ ｓ細胞クローンを、サザンブロット分析によって同定し、胚盤胞注射に使用した（図１ ０Ａ）。 1B上）。 変異マウスは、二つの独立して標的化されたES細胞クローンから誘導され、サザンブロット分析によって同定された（図 1Bより低い）。 尾および皮膚コラーゲンのタンパク質分析により、ヘテロ接合変異マウスはIII型コラーゲンを約50％減少させるが、ホモ接合変異動物ではIII型コラーゲンは検出されなかったことが示された（Fig. 1C）。
変異動物は肥沃であったが、ヘテロ接合マウスのみが表現型的に正常であった。 ホモ接合変異マウスは、離乳年齢で5％の平均生存率を示し、ほとんどの死亡は出生後最初の48時間以内に発生した（表1）。 新生児致死率の正確な原因は、死んだ子犬が検査される前に共食いされ、生きた新生児ホモ接合変異体の光学顕微鏡的組織学的分析は、肉眼的異常を検出しなかったため、明らかではない。 成体ホモ接合変異マウスは、それらが同じ性別の野生型同腹仔よりも約15％小さいことを除いて正常に見えた（データは示されていない）。 ホモ接合変異マウスの平均寿命は、しかし、約6ヶ月または通常の寿命の五分の一であった。 剖検では、血管破裂がこれらのマウスの寿命短縮の主な原因であることが示された（表2）。 破裂部位は散発的であり，大血管と関連していた。 血管壁の脆弱性を引き起こす欠陥を見つけるために組織化学的分析を行った。 図1.1.1. 図2AおよびBは、正常な腹部大動脈の断面を示す。 大動脈の壁は、内膜および培地からなる（図１）。 および（図２Ａ、矢印）および外膜（図２Ａ、矢印）。 2AおよびB、矢頭）。 媒体は弾性繊維からなる（図１）。 および平滑筋細胞（図２Ｂ、大きな矢印）および平滑筋細胞（図２Ｂ、大きな矢印）を含む。 外膜は、大部分がｉ型コラーゲン原線維を含み、大動脈の拡張を制限する一方で、大動脈の弾性を提供する（図２Ｂ、小さい矢印）。 図1.1.1. ホモ接合性変異マウスからの腹部大動脈の解離性動脈瘤の断面を示す図である。 破裂は媒体（矢印）を交差させ、媒体と外膜（矢印）との間に血液で満たされたチャネル（星）をもたらし、大動脈の内腔を部分的に崩壊させた。 外膜は最終的に他の場所で破裂し、致命的な大動脈瘤を有するヒトの場合と同様に、血液が腹腔内に漏れた（20）。 弾性繊維および平滑筋細胞の全体的な配置（図。 （図２Ｄ）は対照のものと類似していた（図２Ｄ）。 2B）。 突然変異マウスの内膜における外膜および弾性線維と平滑筋細胞との間の細胞外マトリックス材料の強度および分布、およびより暗い染色（図 （図２Ｄ）は野生型対照のそれに匹敵した（図２Ｄ）。 2B）。 変異動物における心臓および中型動脈および小動脈の明らかな欠損は、光学顕微鏡下で観察されなかった（データは示されていない）。
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ホモ接合型Col3A1変異マウスの生存
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死んだホモ接合変異成体マウスからの剖検の結果
野生型およびCol3A1変異マウスの大動脈の断面のマッソンのトリクロム染色。 （Ａ）内膜と中膜（矢）と外膜（矢頭）からなる野生型大動脈。 内腔には血液細胞（星）があります。 （Ｂ）野生型大動脈の高倍率。 内膜の弾性線維（大きな矢印）と平滑筋細胞（小さな矢印）が見られます。 （Ｃ）変異型大動脈の解離性動脈瘤。 内膜と中膜（矢）が破裂し、中膜と外膜（矢頭）の間に血液（星）が充填された。 （Ｄ）変異大動脈の高倍率。
動脈瘤に加えて、変異マウスは頻繁な腸の拡大と死の結果として時折腸の破裂を示した（表2）。 ホモ接合性変異マウスの約60％が皮膚病変を示し、その中で最も重症のものは、肩領域に≧1cmの長さの開いた創傷として提示され、これは皮膚を完全に貫通し、皮下組織を露出させた（図10B）。 3). 傷は別々にケージに入れられた動物で観察されたので、動物間の戦いによるものではなかった。 皮膚、腸、および肝臓および肺を含む他の内臓の光学顕微鏡分析は、変異動物における明白な異常を検出しなかった（データは示されていない）。
その左肩に皮膚の傷を持つタイプIIIコラーゲン欠損マウス。
変異動物の構造欠陥を明らかにするために，大動脈および心臓の電子顕微鏡解析を行った。 図1.1.1. 図4は、平滑筋細胞間または平滑筋細胞と弾性線維との間に位置するコラーゲン原線維を示す（図4は、平滑筋細胞と弾性線維との間に位置するコラーゲン原 変異大動脈の培地中では存在しないか、または重度に減少した（図４Ａ、矢印）。 4B、矢印）。 最も驚くべきことに、コラーゲンの大部分がｉ型である外膜では、変異大動脈のコラーゲン原線維の直径は非常に可変であった（図４を比較して）。 る。 フィブリルをカウントし、これらのフィブリルの直径を外膜の所定の領域で測定したところ、変異体のフィブリルの数は野生型の約三分の一に減少し、変異体のフィブリルの平均直径は野生型マウスの約二倍であったことが分かった（図。 5). 大動脈と同様に、心外膜と心筋との間のコラーゲン線維は減少または欠損し、心外膜の微絨毛は変異マウスの心臓において未発達であった（データは示さ
野生型および変異マウスからの大動脈および皮膚の透過型電子顕微鏡分析。 （Ａ）コラーゲン原線維（矢印）は、野生型大動脈の培地中の平滑筋細胞（星）の周りにある。 十字でマークされた白い部分は弾性繊維です。 (B)コラーゲン線維は、変異大動脈の培地中の平滑筋細胞（矢印）の周りに欠落しています。 （Ｃ）野生型大動脈の外膜におけるコラーゲン線維の断面。 矢印は個々の小繊維を指します。 コラーゲン線維の直径は，野生型マウスのｄ．（Ｅ）皮膚切片における変異大動脈の線維（矢印）に比べて小さく，比較的均一であった。 コラーゲン線維（矢印）は直径が均一である。 （Ｆ）変異マウスの皮膚切片。 コラーゲン原線維は、多くの場合、対照原線維よりも厚い（矢印）または薄い（矢印）であり、直径が均一ではない。
野生型および変異型マウスの大動脈外膜におけるコラーゲン線維の直径の比較。 野生型または変異大動脈のいずれかの外膜における2μ m×2μ mの領域をランダムに選択し、この領域のすべてのフィブリルをそれらの直径について測定し、計数した。
心臓血管系に加えて、変異マウスの皮膚、腸、肝臓、および肺を電子顕微鏡で調べた。 大動脈の外膜と同様に、コラーゲンIは変異した皮膚に線維化する（図。 図4F、矢印および矢頭）は、野生型マウスのものと比較して、無秩序であり、直径が非常に可変であった（図4f、矢印および矢頭）。 4E、矢印）。 この変化は、変異マウスの肝臓および肺においても見られた（データは示されていない）。 さらに、コラーゲン線維は、変異腸の粘膜下層およびしょう膜において欠損または高度に減少していた（データは示されていない）ことは、これらの領域のコ
Col1A1、Col2A1、Col5A2、Col9A1遺伝子に標的変異を導入したこれまでの研究は、これらのコラーゲンの機能に重要な洞察をもたらしました（24-27）。 ここでは、III型コラーゲンは、心臓血管系、腸、皮膚などの臓器の開発の重要な部分である線維形成に重要な役割を持っていることを示しています。 III型コラーゲンの欠如は線維形成を妨げ、これらの器官の発達不良および機能不全をもたらした。 生理学的条件の下で、タイプIIIのコラーゲンは大動脈の媒体のようなティッシュのフィブリルの必要な部品だけでなく、タイプIのコラーゲンのfibrillogenesisの重 ＩＩＩ型コラーゲンはｉ型コラーゲン線維の直径を調節し，これは異なる組織または異なる発達段階の組織の生理学的要件を満たす機構として機能することを示唆した。 III型コラーゲン欠損マウスの表現型は、血管または腸の破裂（から死亡した人のEhlers–Danlos症候群IV型患者の臨床症状によく似ている20）。 したがって、これらの変異マウスは、この疾患を理解し、おそらく治療的アプローチをテストするための良好な動物モデルであるこ
