シロイヌナズナcmt3クロモメチラーゼ変異ブロック非CGメチル化と内因性遺伝子のサイレンシング | Jiotower

結果と議論

WS PAI遺伝子のメチル化とサイレンシングを制御する因子を同定するために、我々は、メチル化された一重項PAI2遺伝子のサイレンシングは、紫外（UV）下の青色蛍光植物表現型の強度によって可視化することができるWS、pai1c251yの変異体を単離した。）ライト（bartee and bender2001）。 Pai1c251y株では、PAI酵素活性の唯一の潜在的な源は、ミスセンス変異によって不自由されているPAI1遺伝子、および沈黙されているPAI2遺伝子です。 このPAIの不足のために、緊張は黄色緑の葉の色素形成、減らされたサイズ、高められたbushinessおよび減らされた豊饒を表示することと同様、蛍光トリプトファン しかし、ＰＡＩ２サイレンシングを緩和する第２部位突然変異は、ＰＡＩ欠損表現型を抑制する（Ｂａｒｔｅｅ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ２ ０ ０ １）。 したがって、我々はpai1c251y株を変異させ、抑制された弱い蛍光表現型を持つ苗をスクリーニングした。 二次スクリーンとして，メチル化感受性制限酵素を用いたサザンブロット分析によるＰＡＩメチル化を試験した。 具体的には、我々は、配列5′-CCGG-3’を認識するイソスキゾマー HpaIIとMspIでメチル化をアッセイしました。 HpaIIは内側（CG）と外側（CNG）の両方のシトシンのメチル化に敏感であるが、MspIは外側のシトシンのメチル化にのみ敏感である。 これらの酵素は、各ＷＳ ＰＡＩ遺伝子座で１回切断され、各遺伝子のメチル化の密度およびパターンの両方を明らかにする（Ｂｅｎｄｅｒ ａｎｄ ｆｉｎｋ１ ９ ９ ５；Ｌｕｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ． １ ９ ９ ９；Ｍｅｌｑｕｉｓｔ ｅ ｔ ａ ｌ． 1999).

このスクリーニング戦略から、我々はCMT3遺伝子における11の機能喪失対立遺伝子を単離した（下記および材料および方法を参照）。 Pai1c251y背景のcmt3変異体は、初期の苗の発達において強く減少した蛍光を示し、成体植物において部分的に減少した蛍光を示し、大きさの増加、ブッシュ性の減少、および肥沃度の増加を示した（図10a）。 （図1）。1).1). これらの中間蛍光ｃｍｔ３単離株は、検出可能な頻度で、残留ＰＡＩ２メチル化の喪失の診断である非蛍光に戻らなかった（Ｂｅｎｄｅｒ ａｎｄ Ｆｉｎｋ１ ９ ９ ５）。 それらは、親のpai1c251yと比較したPAI遺伝子について、HpaIIによる部分的に増加した切断およびMspIによる強く増加した切断を示した（図10A）。 （図1）。2A）。2A）。 切断パターンは、cmt3変異体が最もPAI遺伝子のCNGメチル化の維持に影響を受けていたことを示唆した。 Cmt3変異体はまた、高度に反復ゲノム配列のメチル化に影響を与えるかどうかを決定するために、我々は180bp動原体関連リピート（CEN）配列にプローブでHpaII/MspIサザンブロッ 1993). このプローブは、Ｈｐａｉｉ切断に対する効果はほとんど示されなかったが、Ｐａｉ遺伝子について観察されたパターンと一致して、Ｍｓｐｉ切断を増加させた（図１ ０Ａ）。 （図1）。2B）。2B）。 増加したＭｓｐｉ切断の同様のパターンもまた、反復ｒＤＮＡで観察された（データは示されていない）。 テストされた11cmt3対立遺伝子のすべては、これらのアッセイで同一のメチル化パターンを持っていた。 さらに、ｃｍｔ３対立遺伝子がｐａｉ１Ｃ２ ５ １Ｙ対立遺伝子から野生型ＷＳ背景に分離されたとき、それらはまた、これらのアッセイにおいて同一のメチル化パター （図1）。2).2). ＰＡＩおよびＣＥＮメチル化パターンは、特徴づけられたｄｄｍ１およびｍｅｔ１メチル化欠損突然変異によって誘導されるパターンとは異なっていた（図１）。 （図1）。２；２；ＢａｒｔｅｅおよびＢｅｎｄｅｒ２ ０ ０ １）。

より正確にcmt3変異体の背景におけるメチル化パターンを決定するために、我々は重亜硫酸ナトリウム変異誘発を使用して、代表的なcmt3対立遺伝子のPAI1とPAI2プロモーター領域におけるメチル化パターンのゲノムシーケンシングを行った（Frommer et al. 1992). この分析により、メチル化シトシンの大部分（ＰＡＩ１では８ ７％、ＰＡＩ２では７ ０％）がＣＧ残基で発生したことが明らかになった（図１ ０Ａ）。 （図1）。3;3;テーブルTable1）。1). 野生型ＷＳ ＰＡＩ１プロモーターと比較して（Ｌｕｆｆ ｅ ｔ ａ ｌ． １ ９ ９ ９；表１）、１）では、ＣＧメチル化は３ ４％減少し、ＣＮＧメチル化は排除され、非対称メチル化は９ ３％減少し、ＰＡＩ２プロモーターでは、ＣＧメチル化は８％減少し、ＣＮＧメチル化は９ ２％減少し、非ＣＧメチル化は７ ５％減少した。 従って、CMT3機能の損失はCNGおよび非対称的なメチル化の維持に対する強い効果およびCGのメチル化の維持に対するより弱い効果をもたらします。 これらの結果は、シロイヌナズナCMT3およびトウモロコシZMET2が様々なゲノム部位でのCNGメチル化の維持に重要であるという報告と一致している（Lindroth et al. 2001;Papa et al. 2001）、しかし、彼らはさらに、CMT3がPAI遺伝子の非対称メチル化の維持にも重要であることを示している。 この結果は、CMT3が直接対称と非対称のメチル化の両方を制御するか、cmt3変異体の背景における対称メチル化の減少は、二次的な結果として減少した不斉メチル化を引き起こすことのいずれかを意味する。 Pai2レポーター遺伝子のプロモーターと最初のエクソン（≧370bp）のメチル化配列は16の分散CGモチーフのみを含むため、非CGメチル化の損失は、遺伝子のこの領域を有意に低メチル化する（Fig. （図1）。3)、3)、サプレッサー変異体における強化されたPAI2発現を説明する。

ＰＡＩ１Ｃ２ ５ １Ｙ ｃｍｔ３サプレッサー単離株中のｃｍｔ３変異遺伝子座は、ＷＳに見られるように密にメチル化されたＰＡＩ遺伝子の同様の配置を有する多型株Ｎ Ｄ−０との交 1999). Pai1c251yとcmt3の両方のホモ接合性の弱い蛍光表現型診断とf2子孫は、UV光の下で目視検査によって同定され、親サプレッサー分離株で観察された これらの基準を満たすF2植物のマッピング集団は、抑制された表現型にリンクされているゲノム遺伝子座のスコアに使用されました。 マッピング分析は、染色体1の下腕上の単一の遺伝子座へのリンケージを明らかにした。 CMT3推定シトシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子はこの遺伝子座にマップするので、我々は候補としてこの遺伝子に焦点を当てました。 各マッピング集団内で、我々はCMT3遺伝子の100kb以内にある多型マーカーへの完全なリンケージを発見した。 CMT3遺伝子が実際にメチル化サプレッサー変異のサイトであったことを確認するために、我々はクローン化し、11変異体分離株から遺伝子を配列決定した。 配列決定は、各分離体におけるCMT3コード配列の単一の塩基の変化を明らかにした。 変異対立遺伝子の三つは、重亜硫酸塩配列決定のために使用される代表的なcmt3g456d対立遺伝子を含むメチルトランスフェラーゼ触媒ドメインで絶対に保存されたアミノ酸に影響を与えた。 別の対立遺伝子は、タンパク質を早期に終了させると予測された。 二つの対立遺伝子はスプライス接合変異を作成しました。 残りの5つの対立遺伝子は、CMT遺伝子の間で高度に保存されているメチルトランスフェラーゼモチーフIVとタンパク質のC末端との間のアミノ酸に影響を与えた(図1)。 （図1）。4).4).

ＣＭＴ３遺伝子が変異遺伝子座であることをさらに確認するために、本発明者らは、ＣＭＴ３遺伝子の野生型ＷＳゲノムクローンでＰＡＩ１Ｃ２ ５ １Ｙ ｃｍｔ３単離株を形質転換した。 形質転換苗は、pai1c251y株のものと同様に、強く蛍光性であった（図。 （図1）。1).1). Ｔ２世代でサザンブロット分析によってアッセイされた形質転換株は、元のＰＡＩ１Ｃ２ ５ １Ｙ株で観察されたレベルへのＰＡＩ２遺伝子の再メチル化を示した（ したがって、クローン化されたCMT3遺伝子は、変異メチル化欠陥を補完することができます。 対照として、代表的なＰＡＩ１Ｃ２ ５ １Ｙ Ｃｍｔ３Ｇ４ ５ ６Ｄ変異体も、ＣＭＴ２遺伝子の野生型Ｗ ｓゲノムクローンで形質転換した。 ＣＭＴ２形質転換体苗は、非形質転換親株のものと同様に、弱く蛍光性であった（図１ ０Ａ）。 （図1）。1)、1)、およびPAI2の検出可能な再メチル化を表示しませんでした。 この分析は、CMT2がCMT3関数を置き換えることができないことを示しています。 この点に関して、ＣＭＴ２は、主にそのＮ末端配列においてＣＭＴ３とは異なることに注目することは興味深い（図１ ０Ａ）。 （図1）。44).

以前に特徴づけられたメチル化欠損シロイヌナズナ株は、SWI2/SNF2クロマチンリモデリング因子関連遺伝子DDM1のいずれかに欠陥を有する（Jeddeloh et al. １ ９ ９ ９）またはＤｎｍｔ１関連ＭＥＴ１シトシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子は進行性発達異常を示す（Ｆｉｎｎｅｇａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． １ ９ ９ ６；Ｋａｋｕｔａｎｉ ｅ ｔ ａ ｌ． １ ９ ９ ６；Ｒｏｎｅｍｕｓ ｅ ｔ ａ ｌ． 1996). 六世代近交系pai1c251y cmt3と二世代近交系cmt3株の我々の予備分析は、形態学的変化の明らかな分離を明らかにしなかった。 Ｃｍｔ３と他のメチル化欠損変異体との間のこの差は、ＣＧメチル化がｄｄｍ１またはｍｅｔ１よりもｃｍｔ３において高い程度に保持されるという事実を反映してい （図1）。２；２；ＢａｒｔｅｅおよびＢｅｎｄｅｒ２ ０ ０ １）。 シロイヌナズナのゲノム中の内因性メチル化部位の多くは、CENリピートのようなものであるため（Fig. （図1）。2;2;Vongs et al. １ ９ ９ ３；Ｌｉｎｄｒｏｔｈ ｅ ｔ ａ ｌ． ２ ０ ０ １）、およびＦＷＡホメオドメイン遺伝子のプロモーター（Ｓｏｐｐｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ２ ０ ０ ０；Ｌｉｎｄｒｏｔｈ ｅ ｔ ａ ｌ． 2001）、主にCGメチル化を運ぶ、cmt3変異は、これらの遺伝子座に強く影響を与えることは期待されないであろう。 代わりに、CMT3は、pai遺伝子などの特定のゲノム領域にメチル化の余分な層を追加する強化メチラーゼとして最も可能性が高く、メチル化密度の増加はサイレンシングの増加につながる。 具体的なモデルは、MET1のような他の機能によって提供されるCGメチル化の基底層がCMT3のガイドとして役立つ可能性があり、CMT3は余分なCGおよび非CGメチル化で基底層を飾るだろうということである。 標的領域へのCMT3募集は、ユニークなN末端配列によって媒介される相互作用と一緒に、クロモドメインモチーフ（HenikoffとComai1998）とクロマチンタンパク質の相互作用

Neurospora crassaやAscobolus immersusなどの真菌は非CGメチル化を維持できるため(Selker et al. １ ９ ９ ３；Ｇｏｙｏｎ ｅ ｔ ａ ｌ． 1994年）、これらの生物はCMT遺伝子をコードする可能性がある。 逆に、ヒトやマウスなどの動物は非CGメチル化を欠いているため、これらの生物は、現在の配列データベースの分析からの場合のように、CMT遺伝子を欠いていると予測されている。 動物ゲノムにおけるCMT様メチラーゼの明らかな欠如（Finnegan and Kovac2000）は、動物がクロマチン状態を強化するための代替メカニズムを進化させたことを示唆している。