알파 세차 지식 기반
- 표적/시료 유형
- 세체 분석 조건
- 알파 세체 분석
- 세체 분석
- 세체 분석
면책 조항:연구용으로만 사용됩니다. 이 응용 프로그램은 1998 년에 설립되었으며 1998 년에 설립되었습니다. 킷 사용을 위해서는 유효한 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 구독이 필요합니다.
이 CETSA®방법 자체
Q:CETSA®?
: 세포질 열 교대 분석실험은 살아있는 세포 또는 중단한 세포에서 화합물의 표적 교전(테)의 양을 정하는 것을 허용하는 방법입니다. 이 분석 원리는 화합물의 결합 후에 발생하는 표적 단백질의 열 변성 프로파일의 변화에 기초한다. 상기 세차계 분석법은 시험 화합물로 세포를 배양하고,그 다음에 화합물-처리된 세포를 가열한 다음,나머지 용해성 표적 단백질을 측정함으로써 수행된다.
큐:열 이동은 무엇입니까
: 단백질을 가열하면 단백질이 변성되는 온도(때로는 녹는 점이라고도 함)가 발생합니다. 이 용융 온도는 주어진 조건(산도,압력,염)에 대한 물리적 특성 및 상수입니다. 단백질과 상호 작용하는 화합물은 용융 온도(열 이동)를 변경합니다. 단백질 내의 주어진 결합 부위를 위해 열 교대의 크기는 다른 화합물 농도(복용량 응답)에 측정될 수 있습니다. 체 외 열 시프트 분석에 몇 가지 유사 하지만 핵심 기술 세미 소트 노프 등 알에 의해 처음 설명 했다. (1991). 이 방법에서 용융 및 전개 단백질은 시프로 오렌지를 결합 할 수있는 소수성 표면을 노출시킵니다. 이 염료의 형광은 물 속에서 담금질되므로 이러한 소수성 표면에 대한 결합은이를 역전시키고 단백질이 완전히 펼쳐질 때 형광이 최고조에 달합니다. 열 교대 분석실험의 이 유형은 높게 순화한 단백질에만 적용될 수 있고 낮은 풍부 종을 위해 이것은 전면 표정 체계가 충분한 총계를 생성할 것을 요구된다는 것을 의미할지도 모릅니다.
: 이들은 가열 이벤트를 전달하는 데 사용되며 형광 변화를 측정 할 수 있습니다
나노 템퍼–샘플을 가열하고 형광을 측정하는 전용 기기를 제조하는 회사입니다. 이 기능은 수동으로 셔터 스피드를 설정할 수 있도록 해줍니다
질문:목표 참여를 측정하는 것이 중요한 이유는 무엇입니까?
에이:화합물이 실제로 원하는 표적과 상호 작용한다는 확인이 없으면 약물 개발자들은 잘못된 방향으로 움직이는 귀중한 시간과 자원을 잃을 수 있습니다. 그런 이유로,화합물의 표적 교전의 확인은 약물 발견에서 근본으로 오랫동안 간주되었습니다. 이러한 분석 결과 만들 수 대상에 대 한 화합물의 친 화성의 직접 비교를 사용,같은 리드 생성 및 최적화의 모든 단계에서 사전에 어떤 화합물을 선택 하는 필수적인 측정 이다. 대상 참여 선호도 상관 될 수 있기 때문에 연구자 선호도 값이 가장 높은 화합물을 선택할 수 있습니다. 따라서 약물 발견 과정의 각 단계에서 올바른 화합물 우선 순위를 보장하는 데 매우 유용한 조치입니다.
질문:다른 열 이동 분석 기술과 다른 점은 무엇입니까?
답:표적참여(예:표면 플라즈몬 공명,형광분극 및 열변속)를 평가하기 위한 다양한 방법이 있다. 그러나 이러한 모든 방법을 사용할 수 있는 정제 된 단백질에 의존 하 고만 적용할 수 있습니다 체 외,파생 된 선호도 값을 의미 하지 않을 수 있습니다 실제 선호도 또는 살아있는 세포에서 바인딩 가능성의 예측. 관련 세포 맥락에서 열 이동 분석 실험을 실행할 수 있는,어디 단백질은 그것의 기본 환경에,그것의 자연적인 파트너 단백질의 존재,그것의 보조 인자 및 기질의 생리 적 농도,훨씬 더 관련 데이터를 수율,더 나은 동물 모델 및 임상 시험으로 번역 됩니다..
세포 열 이동 분석은 표준 열 이동 분석과 동일한 생물 물리학 적 원리에 기초한 방법이지만(즉,특정 단백질이 설정 온도에서 변성 될 것이다)전개의 특정 온도를 직접 측정하는 것이 아니라 단백질에 화합물의 존재가 설정 온도로 가열 한 후 존재하는 가용성 단백질의 양에 영향을 미칠 것이라는 사실에 의존한다. 이와 같이,세차사는 본질적으로 특정 가열 이벤트 후에 수행되는 총 단백질 분석이다. 다른 표적 교전 효능을 가진 화합물은 가열 이벤트에서 살아남은 단백질의 상대적인 양을 변화시킬 것입니다. 분석실험은 실제적인 녹는 사건 보다는 오히려 이 잔여 단백질을 측정하기 때문에,세포와 용해물과 같은 더 복잡한 생체내 시스템에 적용될 수 있습니다(그리고 몇몇 세차에서 제 2 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 제 3 형식과 또한,세사 제 2 차 단백질(즉,그 용융 온도를 감소)불안정하게 화합물을 식별 할 수 있으며,이는 다른 열 이동 방법보다 직선적이다.
큐: 알파 세차사는 다른 세포 열 이동 분석 기술 또는 다른 세포 표적 참여 분석과 어떻게 다릅니 까?
에이:위에서 언급 한 바와 같이,세차사 제 2 차 단백질 분석은 기본적으로 열 충격 후에 수행 된 총 단백질 분석이다. 알파 세차사는 이중 항체 근접 기반 검출 시스템을 사용합니다. 다른 방법은 표적 단백질을 변경해서 항체 근거한 시스템의 사용을 피합니다:
- 프로 메가 나노 루시 페라 제 열 이동 분석(날츠):표적 단백질에 융합 된 나노 루시 페라 제(재조합 발현 단백질); 나노룩 효소 태그를 가진 단백질 표적이 응집되면,루시퍼라제 신호가 감소할 것이다.
- 프로메가 나노브렛 표적 결합 분석:루시퍼라제 융합 태그가 라벨이 붙은 추적자 화합물과 결합되어,루시퍼라제에 근접할 때 생물 발광 공명 에너지 전달을 유도한다(브렛). 같은 주머니에 결합 화합물은 추적을 대체하고 브렛 신호가 감소합니다. 이것은 열 충격 방법이 아닙니다.
- 디스코벅스 인셀 펄스:효소 단편의 보완 기술 기반 : 표적 단백질은 작은 효소 공여체 단편과 융합된다. 추가 된 리포터 단백질은 활성 효소를 재구성하기 위해이 단편에 결합하여 기질을 가수 분해하고 단백질 풍부 정량화를 허용하는 화학 발광 신호를 생성합니다. 열 변성 후에,단백질은 단백질 표적에 그것의 파트너에게 더 큰 루시퍼라제 분대의 접근을 집계하고 제한할 것입니다.
이들”재조합 세포 결합”또는”재조합 표적 결합”시스템과 알파 세포 결합”시스템 간의 주요 차이점은 이들이 네이티브 및 수정되지 않은 세포에 적용될 수 없다는 것이다. 이 부정적인 결과의 번호를 가지고:
- 새로운 항체 쌍을 개발하는 비용과 그 이후의 우물 당 비용은 단순히 단일 세포주를 형질화하는 것보다 높을 수 있지만,모든 발견 프로그램이 다양한 모델 세포주로 테스트되기를 원할 가능성이 있으며,각 형질감염은 자체 비용과 함께 제공되며 후속 세포주를 복제하는 데 몇 주가 더 걸릴 것입니다.
- 태그가 지정된 단백질을 생성하는 것은 항상 세포에 생리 학적 결과를 초래할 것이며 태그가 지정된 단백질은(1)과발현 될 수있다(잘못된 화학 양론 대. (2)올바른 세포 구획에 위치하지 않거나(3)주요 파트너 단백질과 관련이 없으며(4)네이티브 단백질과 다른 용융 행동을 할 수 있습니다. 화합물의 명백한 효력이 환자의 조직에 있는 그것의 진짜 행동을 반영하지 않을지도 모르다 의미. 이러한 문제는 임시 형질 감염 시스템에서 확대 될 수 있습니다.
- 루시퍼라제 억제제는 위양성 안타를 초래할 수 있습니다.
- 납 최적화의 후기 단계에서 더 복잡하고 생리적으로 더 관련성이 높은 세포 모델(1 차,기본 세포주 및 조직)이 필요할 때 태그가 지정된 단백질 접근법은 단순히 적용 할 수 없습니다.
질문:어떤 정보를 제공합니까?
A:CETSA®제공하는 고유한 측정값의 화합물의 대상에 존재’고 생각할 수 있습의 대상으로 가능합니다. 이 점유는 표적을 관여시키는 화합물 능력과 올바른 위치에 존재하는 화합물의 능력 모두에 의해 영향을받을 것입니다(즉, 올바른 세포 구획에서 올바른 용해도,투과성,대사 안정성 및 가용성이 있습니까?) 비 세포 대상 참여 분석 실험 자주 정제 된 재조합으로 표현 된 대상 단백질을 사용 하 여 높은 인공 환경에서 단백질의 동작에만 상관 관계 선호도의 측정을 제공 합니다.
질문:세차사(세차사)가 특별 행정구 분석 연구에 사용될 수 있습니까?
A:없는 출판 예 아직 어디 CETSA®사용되었습에 대한 화합물이 최적화입니다. 그러나,특별 행정구 분석 및 적중 확인을 위해 사용될 잠재력과 적용 가능성은 쇼 등에 의해 명확하게 입증되었다. 일반적으로 사용되는 생화학 적 및 세포 기반 분석 데이터(쇼 외.2015)와 세차기 분석 데이터의 비교에 의해. 10.1177/2472555218813332). 이 간행물은 두 가지 단백질 표적에 대한 선별,적중 확인 및 특별 행정구 생성을 위해 세타 사의 부가가치를 보여줍니다.
타겟/샘플 유형
질문:지금까지 얼마나 많은 타겟이 검증되었습니까?
: 핵,미토콘드리아,세포질 및 원형질막 국소화를 가진 표적을 포함하여 30 개 이상의 표적이 성공적으로 검증되었습니다.
100 개 이상의 대상은 지금까지 세차에서 검증되었습니다.
한 번에 6000~7000 개의 타겟에 대한 정보를 생성한다.
질문:모든 표적 단백질은 세차에서 테스트 될 수 있습니까?
아르 자형:일부 표적은”맹인”입니다. 합성 바인딩은 그들의 열 안정성을 바꾸지 않을 것입니다. 이것은 단백질에 다중 도메인이 있고 화합물이 하나의 도메인에만 결합 될 때 발생할 수 있으며,이 단일 도메인의 안정화가 전 세계적으로 전체 단백질의 열 안정성에 영향을 미치지 않는 경우 발생할 수 있습니다. 일반적인 온도 범위에서 용융되지 않는 몇 가지 단백질이 있습니다.
펠라고는 질량 분석 판독값이 있는 프로젝트의 열 안정성 데이터가 포함된 대규모 데이터베이스에 접속할 수 있으며,이 정보는 펠라고가 알파 세타 세타 분석 결과를 개발하기 전에 단백질 표적의”세타 세타 세타 비탈리티”를 평가할 때 고려된다. 이러한 정보를 요청 펠라고에 문의하시기 바랍니다.2015 년 11 월 1 일(토)~2015 년 12 월 1 일(일)~2015 년 12 월 1 일(일)
답:일부 예제들은 다음과 같이 테스트되었다. 최근 출판물에서 아스트라 제네 카(카와 카르 외 화학 생물학 2019)세차사 고전 분석실험은 단백질 표적을 포함한 막 결합 단백질 세트에 대해 확립되었습니다. 항체 검출을 위한 항체의 가용성이 제한적일 수 있습니다. 또한,자간전증의 일체형 막 국소화는 예측할 수 없는 용융 거동을 초래할 수 있습니다.
질문:어떤 유형의 샘플을 테스트 할 수 있습니까?
: 의 사례가 있 CETSA®분석을 사용하여 다양한 종류의 행렬을 포함하여 불후의 세포 라인,primary cells,iPS cells,환자 파생 PBMCs,spheroids,핵 분수에서 배양된 세포 ex-vivo 취급 조직,조직에서 vivo 에서 동물학,세균,효모,zebrafish 및 곤충입니다.
큐:가열 단계 후에 샘플을 동결시킬 수 있습니까?
에이:이 가능하지만,이 동결 과정은 일부 단백질을 변성 할 수 있으므로 사례 별 검증이 필요합니다.
큐:내 세포는 일부 단백질(예를 들면. 샘플 준비를 피하기 위해 특별한주의가 필요합니까?
에이:우리는 코팅 된 플레이트에서 배양 된 세포에 문제가 발생하지 않았습니다.
CETSA®분석 결과 조건에
Q:What are 일반적인 알파 CETSA®분석 결과 최적화를 포인트입니까?
에이:처음부터 시작하는 경우 면역 측정법을 먼저 개발하고 최적화해야합니다. 그것은 매우 민감한 알파 분석법을 개발하는 데 중요하고 가치있는 투자입니다. 세포질 분석실험이 검출될 필요가 있는 단백질의 부분을 파괴하고 있기 때문에,전형적으로 세포질 분석실험에서 다른 세포 근거한 분석실험과 비교된 세포질 분석실험에서 더 많은 세포/우물이 필요합니다. 진행 방법에 대한 알파 분석 개발을위한 퍼키넬머 가이드 및 유용한 힌트를 참조하십시오.
그런 다음 세차사 제 2 차 분석 최적화 포인트는 다음과 같습니다.:
- 세포 밀도 적정
- 세포 용해 완충액 선택
- 시험 화합물로 세포의 배양 시간
- 시험 화합물로 세포의 배양 온도
- 용융 및 이동 곡선 설정
- 등온선량-반응 실험을 위한 온도 선택
- 워크플로 및 자동화 설정
질문:왜 다른 셀 용해 버퍼가 제공되고 다른 셀 용해 버퍼를 사용하면 어떤 영향이 있습니까?
: 용해 완충기는 분석실험의 몇몇 양상에 대하여 중요합니다. 그 역할은 여러 가지입니다:세포를 용해시키고 항체 인식을 방해 할 수있는 파트너 단백질로부터 표적 단백질을 잠재적으로 자유롭게하여 표적을 항체에 의한 검출에 사용할 수있게한다;분석 결과를 안정적으로 만들기 위해 표적 단백질을 안정화시킨다.; 다른 면역 측정법이 다른 최적 조건을 가질 수 있고,다른 단백질 표적과 다른 세포 유형이 최적의 분석 성능에 대한 다른 요구 사항을 가질 수 있기 때문에,우리는 5 개의 다른 세포 용해 완충제를 사용할 수 있도록하고 있습니다. 이들은 다양한 세포 용해 조건을 제공합니다. 그러나 이것은 추가 구성 요소가 추가 분석 성능을 향상시키기 위해 추가 세제 유형과 같은 특정 경우에 추가 될 수 있음을 의미하지는 않습니다.
질문:세포 용해 완충액에 프로테아제 억제제가 있습니까?
에이:세포 용해 버퍼 1,4 및 5 는 일부 2 가 양이온 킬레이터를 포함하는데,이는 이들의 활성을 위해 이러한 2 가 양이온을 필요로 하는 프로테아제를 억제할 것으로 예상된다(예를 들어 매트릭스 메탈로프로테이나제). 이 외에도,다른 프로테아제 억제제는 세포 용해 완충액 내에 포함되지 않으며,이는 일반적으로 알파 세포 용해 분석법의 수행을 위해 필요하지 않기 때문이다. 그러나 특정 세포 유형 또는 조직 샘플의 경우 루 펩틴과 같은 전형적인 단백질 분해 효소 억제제를 추가 할 수 있습니다.
큐:전형적인 용융 온도는 무엇입니까?
에이:용융 온도는 표적 단백질 집단의 절반이 변성된 온도로 정의된다(즉,알파 신호의 절반이 손실된 알파 세차에서). 막 관련 단백질과 같은 일부 단백질은 일반적으로 더 안정적이며 더 높은 용융 온도를 가질 수 있습니다. 상기 용융 온도를 갖는 단백질에 대한 데이터는 세포가 가열 될 때 막 투과성 및 세포 무결성이 교란된다는 사실로부터 영향을받을 수 있으며,이로 인해 분석 결과의 생리 학적 중요성에 영향을 미친다.
우리의 경험에서 녹는 온도 대상 특정 이며 분석 매트릭스 및 사용 된 용 해 버퍼의 따라 달라 집니다.
질문:손상되지 않은 세포와 파괴 된 세포로 작업 할 때 초월체가 동일 할 것으로 예상됩니까?
에이:반드시,세포를 파괴 할 때,단백질을 안정화 단백질-단백질 상호 작용이 손실 될 수 있습니다,이는 그대로 세포에 비해 변화 용융 온도로 이어질 수 있습니다. 예를 들어,알파 세차사(예:알파 세차사)를 참조하십시오.
질문:화합물 테스트를 위해 어떤 가열 온도를 선택해야합니까?
: 안정화되는 화합물을 위해 가장 과민한 분석실험을 줄 것으로 예상되기 때문에,가장 큰 분석실험 창을 가진 저온을 선정하기 위하여 추천됩니다. 불안정하게 하는 화합물을 위해 가장 큰 분석실험 창을 가진 가장 높은 온도를 선정하기 위하여 추천됩니다. 65 이상의 온도는 세포 투과성에 영향을 미치고 데이터의 중요성을 감소시킬 수 있습니다.
질문:세차사 고전(웨스턴 블롯)과 알파 세차사에서 동일한 용융 온도를 기대해야합니까?
:반드시: 명백한 녹는 온도는 검출 방법이 다르기 때문에,두 방법 사이에서 변화할 수 있습니다.
질문:샘플 가열 시간을 엄격하게 제어하는 것이 중요합니까?
답변:예 가열 시간이 길어지면 용량-반응 곡선이 오른쪽으로 이동하므로 제어하는 것이 매우 중요합니다(체류 시간에 대한 설명 아래 참조). 표준 가열 시간은 3 분입니다.
짧은 체류 시간을 갖는 화합물(즉,높은 해리율 일정한 코프; 체류 시간이 1/코프와 같음)은 긴 체류 시간을 갖는 화합물에 비해 가열 될 때 표적으로부터 더 빨리 해리 될 것이다. 이러한 이유로 가열 시간이 증가함에 따라 값이 증가 할 것으로 예상됩니다. (2018)세포 내 약물 결합 및 세포 열 이동 분석을 이용한 동역학의 정량적 해석. 생화학 57:6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. 이론적으로,가열 시간을 변화시킴으로써 표적에서 다른 화합물의 체류 시간을 검출하는 것이 가능할 수 있지만,이 수행 된 것에 대해 아직 발표 된 보고서는 없다.
질문:이 매뉴얼은 얼음에서 냉각하거나 열 충격 후 25 에서 3 분 동안 냉각하도록 지시합니다. 이 냉각 단계가 중요하며 냉각 시간을 엄격하게 제어하는 것이 중요합니까?
:냉각 샘플 빠르게 보장 열 충격 단계 잘 제어. 단순히 온도가 확실히 다른 우물에 다른 냉각 속도를 생산하고 시스템에 전달 열 충격의 양에 영향을 미칠 것 남의 도움 냉각 할 수 있도록. 냉각 단계는 가열 단계만큼 중요하지는 않지만 신속하고 일관되게 수행되어야합니다.
질문:퍼키넬머”바이오마커”와”확실한”(비세타차 비세타차)키트를 사용하여 세타차 비세타차 분석을 수행할 수 있습니까?
답변:이론적으로 모든 총 단백질 분석법은 각 시스템을 최적화하고 검증해야 하지만,총 단백질 분석법은 다음 프로토콜에 사용하기에 적합할 수 있다. 그러나,세차사 제 2 방법은 특허를 받았으며,펠라고 바이오사이언스의 허가가 필요할 것이다. 또한,지정된 대상 키트의 사용 만 퍼키 넬 머에 의해 지원됩니다. 도구 상자 키트의 사용은 펠라고 바이오사이언스에 의해 지원되며 라이센스 소지자만 사용할 수 있습니다.
질문:샘플을 가열하는 데 사용되는 판에서 알파 신호를 직접 읽을 수 있습니까?
: 이는 파이펫팅 단계 수,샘플 소비량 및 자동화 용이성 측면에서 이점을 제공할 수 있지만,샘플 처리에서 검출에 이르는 전체 공정에 인쇄 회로 기판 플레이트를 사용할 가능성은 아직 입증되지 않았습니다. 플레이트 판독기에 의해 처리 될 수 있도록 올바른 치수가 없습니다. 잘-투-잘 크로스 토크는 또한 이러한 회로 기판 플레이트에서 문제가 될 수 있습니다.
질문:열 대신 화학적 변성(예:요소 또는 구아니딘 사용)을 사용할 수 있습니까?
: 열 충격을 전달 하기 위해 온도 사용 하 여의 장점은 샘플 사이 일정 하 고 잘 제어 된 시간 프레임에 제한 될 가능성이 높은 제어 방식으로 이루어집니다. 화학 변성 과정은 순화한 단백질 추출물에서 작동할지도 모릅니다;그러나 복잡한 세포 환경에서는,세포 양에 있는 변이,완충 기능,지질 내용 등은 전부 다른 세포 선이 어떤 주어진 단백질든지를 위한 다른 변성 특성을 표시한다는 것을 의미하게 확률이 높습니다.
변성(가열 시간)이 중요하므로 화학적 변성을 사용하는 경우 제어하기가 매우 어려울 수 있습니다. 또한 열은 실제 세포 맥락에서 테스트 할 수 있도록 세포를 방해하지 않고 적용 할 수 있습니다. 이것은 세포가 변성 대리인에 표적 접근을 허용하기 위하여 중단되어야 하기 때문에,화학 변성의 케이스가 아닐텐데,그러므로 세포내 농도,단백질 협회 등등을 잃기.. 그러므로 우리는 화학 변성에 의하여 열 충격을 대체하는 추천하지 않습니다.
알파 세차사
: 단일 클론 항체가 필요하거나 폴리 클론 항체도 사용할 수 있습니까?
에이:물론 항체의 품질에 따라 단일 클론 또는 다 클론 항체를 모두 사용할 수 있습니다. 단일 클론 항체는 항체를 사용하는 다른 검출 방법과 마찬가지로 안정한 시약 공급 측면에서 이점을 제공합니다.
큐:폴리 클로 날 항체를 사용할 때,다음 로트는 세차에서 동일한 방식으로 작동 할 것인가?
: 우리의 경험에 비추어 볼 때,우리는 다 클론 항체의 다음 로트가 이전 로트와 비교하여 세타 항체 분석법에서 다르게 행동 한 상황에 결코 직면하지 않았습니다. 그러나,세차사 제 2 항체 분석실험은 다클론 항체의 다음 로트로 재검증될 필요가 있습니다.
큐:항체 선택에 대한 다른 권장 사항이 있습니까?
에이:가능한 경우,항체는 표적 단백질의 다른 에피토프를 커버하도록 선택되어야한다,알파 세차에서 작동 할 적합한 항체 쌍을 찾을 수있는 기회를 극대화하기 위해.
더 가파른 곡선(더 높은 언덕 경사)및 더 적은 배경을 산출하는 항체 쌍은 통상 더 특정한 신호를 제공하기 때문에 바람직하다. 낮은 언덕 경사는 다시 접힌 단백질을 인식하는 항체 쌍의 능력의 표시 일 수 있습니다.
질문:알파 세차사는 내인성 표적 단백질에 대한 항체만 또는 내인성 표적 단백질과 결합된 소분자에 대한 항체입니까?
에이:지금까지 개발 된 키트를 기반으로 항체는 단백질 표적에만 반대합니다.
큐: 나는 검출 항체 친화력이 단백질을 대상으로 결합 및 결합되지 않은 작은 분자 사이에 다를 것으로 예상 할 수 있습니까?
에이:에피토프 부위에서 단백질 접힘에 영향을 미치는 작은 분자는 실제로 항체 결합을 변화시킬 위험이 있습니다. 이 현상을”에피 터번스”라고하며 항체 기반의 제한 일 수 있습니다. 이 경우 단백질이 항체 검출 단계 전에 완전히 변성되기 때문에 전형은 일반적으로 세차장 고전 분석 형식(웨스턴 블로 팅)에서 관찰되지 않습니다.
질문:도구 상자 키트와 함께 사용할 수 있습니까?
: 실제로,안티-래빗 및 안티-마우스 비드 상의 항체는 이그에 특이 적이며,다른 항체 부류를 인식하지 못할 것이다(즉,이가,이그엠 등은 선택되어서는 안 된다).
질문:알파 셋사 셋사 클래식(웨스턴 블로 팅)과 비교하여 알파 셋사 클래식(웨스턴 블로 팅)을 사용할 때 이점이 있습니까?
에이:알파 세차검사 분석 및 처리량 및 자동화 고려의 더 큰 감도 옆에,세차검사 고전적인 방법에서 막 단백질을 분석하는 데 가능한 어려움으로 인해,알파 세차검사 분석 및 자동화 고려 사항은 분리 단계가 필요하지 않으므로 이러한 표적에 대해 더 잘 수행 할 수 있습니다.
CETSA®데이터 분석 및 해석을
Q:What 긍정중에서 얻을 수 있습니 CETSA®?
에이:일부 단백질의 열 안정성은 복합 처리 후 영향을받을 수 있습니다,그들은 직접 시험 화합물에 의해 결합되지 않은 경우에도. 이러한 간접적 인 효과는 예를 들어 단백질 인산화,파트너 단백질에 의한 단백질 모집 또는 세포의 산화 환원 상태의 일반적인 변화의 결과 일 수 있습니다. 실행 CETSA®분석에서 동시에 그대로 세포에 세포를 파괴할 수 있습 사이의 차별 직접 및 간접적인 효과 같은 간접적인 효과가 예상되지 않습니다면 세포가 중단 및 대사 프로세스가 중지되었습니다.
화합물 분석 상호 참조는 화합물이 비교적 높은 농도로 검출 단계에 존재하기 때문에 알파 세차에서 발생할 수 있습니다. 이것은 잘못된 결과를 줄 수 있으며 이러한 화합물을 식별하기 위해 카운터 화면을 수행하는 것이 중요합니다.
질문:목표 불안정을 어떻게 해석 할 수 있습니까?
: 불안정화는 표적 단백질을 안정시키고 있던 단백질 복합물의 화합물 바인딩에 의해 붕괴에서 유래할 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면,막 단백질은 일반적으로 용융 온도가 높고 화합물 바인딩에 의해 안정화되는 것보다 오히려 불안정합니다. 키나아제를 위해,그것은 또한 물림쇠의 진지변환에서 유래할 수 있었습니다. 이러한 경우,손상되지 않은 세포(생리 학적 세포 농도)와 파괴 된 세포(세포 손실)에서 수행 될 때 세포 분석 결과를 비교하는 것이 유용 할 수 있습니다. 우리는 가역적 억제제가 표적을 안정화시키는 동안 비가역적 억제제가 표적을 불안정하게 만드는 것을 관찰했다.
질문:에피 터번스 효과를 피할 수있는 방법이 있습니까?
에이:0.01%와 같은 소량의 세제를 첨가하면 에피 터번스 현상을 방지 할 수 있습니다. 한 가지 설명은 신진대사가 화합물의 존재하에서 조차 항체에 접근을 제공하고 있다 일 수 있었다. 일부 세포 용해 버퍼는 소량의 세포 용해 버퍼를 포함하므로 다른 용해 버퍼보다 전형성을 피할 수 있습니다. 경우에 따라 추가해야 할 수도 있음을 배제 할 수 없습니다.
이러한 에피토버스효과가 세타차 분석실험에 한정되는 것이 아니라,임의의 면역화학적검정에서도 발생할 수 있다는 점에 유의하여야 한다.
질문:카운터 화면/내 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장 세차장
에이:세차에서,화합물이 표적 단백질 안정화 자체에 작용하는지,또는 검출 방법에 간섭하는지 판단 할 수있는 간단한 방법이있다.: 비교는(1)세포에 화합물을 첨가 한 다음,배양 및 열처리를 수행하고(2)세포를 먼저 가열하고 그 후에 만 화합물을 첨가하는 것 사이에서 이루어질 수 있습니다. 화합물 활성이 시험 1 에서만 발견되면,그것은 표적에서 진정으로 활성이다. 화합물 활성이 1 과 2 에서 발견되면,그것이 어떻게 든 검출 기술을 방해한다는 것을 보여줍니다(잠재적 인 알파 간섭 목록은 퍼키 넬 머 단백질-단백질 상호 작용 가이드 참조).
질문:세차에서 어떤 위음성 히트를 얻을 수 있습니까?
: 화합물이 세포질 문맥에 있는 표적을 도달하지 않는 경우에,생화확적인 분석실험에서 양성으로 나타날 수 있고,아직도 세포질 문맥에서 음성일 수 있습니다. 이것은 거짓 네거티브가 아니라 화합물이 실제 세포 조건 하에서 표적에 접근 할 수 없다는 사실을 반영하는 것입니다.이 방법은 방법의 강력함의 일부입니다.
질문:세차차 값이 기능적 분석과 어떻게 비교됩니까/열 편이 진폭의 의미가 있습니까?
: 이 분석법은 단백질 인산화,이온 농도,캠프 및 기타 신호 전달 마커 또는 고 함량 스크리닝에서의 표현형 분석과 같은 일반적인 기능 분석법과 매우 다르므로 데이터가 그에 따라 해석되어야합니다.
열편이의 진폭은 화합물 친화도의 척도가 아니다.
이 값은 특정 분석 조건(온도,가열 시간,…)에 따라 다릅니다. 이것은 예를 들어 자극 시간에 특정한 기능적 분석과 다르지 않습니다.
질문:세차에서 길항제 대 작용제를 구별 할 수 있습니까?
에이:일반적으로 이것은 세차에서 추출 된 정보가 아닙니다. (2018)과학 보고서|(2018)8:163/도이:10.1038/41598-017-18650-엑스. 길항제는 세차장 분석실험에 있는 직접 효력이 없는 그러나,세차장 분석실험에 있는 작용제의 효력의 경쟁자로 검출될 수 있던 그러나,단지 작용제가 개발된 세차장 분석실험에 있는 안드로겐 수용체를 안정시킬 수 있었다는 것을 보고합니다. 따라서,이 특별한 경우에 세차사 제 2 차 분석법은 안드로겐 수용체 작용제와 길항제를 구별할 수 있었다. 이것은 어떤 표적든지를 위해 이것이 가능하다는 것을 의미하지 않습니다,세차사 제 1 차 분석실험이 직접 작용제 및 길항제 둘 다를 검출하는 수많은 예가 있기 때문에.
큐: 화합물의 독성을 검출하는데 사용될 수 있습니까?
에이:세포에 일부 독성 영향을 미치는 화합물은 일부 단백질의 수준 변화(분해 및/또는 전사 효과를 통해)및 일부 단백질의 열 안정성 변화(번역 후 변형 또는 세포의 산화 환원 상태의 일반적인 변화를 통해)로 이어질 것으로 예상됩니다. 펠라고는 다른 유형의 독성에 연결될 수 있는”세차장 지문”을 생성할 수 있는 가능성을 모색하고 있다. 이것은 또한 약물이 독성을 피하기 위해 공격해서는 안 대상에 대한 지식을 생성 할 수 있습니다. 만약 특정 표적이 독성과 연관되어 있는 것처럼 보인다면,알파 세차사의 사용은 제약산업에서 선택되는 방법이 될 수 있다.
질문:하우스 키핑 단백질을 세차사의 정상화에 사용할 수 있습니까?
답변:정규화는 일반적으로 세제곱미터에서 필요하지 않습니다. 그러나 일부 경우,예를 들어 조직 샘플로 작업 할 때,데이터 포인트 당 결합 된 물질의 양은 상당히 다를 수 있으며 정규화가 필요할 수 있습니다. 18 의 분자량으로 서부도말에서 쉽게 검출할 수 있다. GAPDH 것이 권장되지 않으로 인해 낮은 녹는 온도(55°C),그것을 만들하지 가능한 컨트롤을 위해 목표와 높은 녹는 온도.
코필린을 정상화하고 싶다면,코필린을 시도할 수 있다(전체 코필린에 대한 알파리사 확실한 울트라 키트가 있고,예비 코필린 데이터에는 아직 완전히 검증된 키트가 없다)
