오탄당 포스페이트 및 방향족 경로로부터 선택된 유전자의 구성적 발현은 대장균 균주의 고-글루코오스 배치 배양에서 시키믹산 수율을 증가시킨다

대장균 균주의 고-글루코오스 배치 배양에서 시키믹산 수율을 증가시킨다

사용 된 합성 오페론의 구성 적 표현을 위해 설계된 플라스미드 우리의 실험실에서 발표되지 않은 증거는 실험실에서 진화 균주 방향족 화합물의 생산이 단단 경로로 탄소 플럭스를 캐닝에 관여하는 유전자의 전사 유도가 발효의 시작 부분에서 발생하는 경우 높은 수준을 달성 할 수 있음을 나타냅니다. 이 관찰을 고려하여,비활성 아록 및 아롤 유전자를 운반하는 12 의 아록 생산을 최적화하기위한 새로운 전략이 개발되었습니다(그림 1). 이 전략 설계 및 6 개의 주요 유전자의 강력 하 고 안정적인 발현에 대 한 플라스미드의 건설 합성 오페론의 형태로 배열,단일 트 렉 발기인에 의해 독점적으로 제어 포함. 또한,본 발명에 따른 플라스미드 안정성이 증가된 파 궤적을 가지고 있는 단일 플라스미드를 벡터로서 활용하였다(그림 2).

오페론의 초기 부분은 클로닝 스캐 폴드로 사용된 플라스미드 피브린트-티센티미드의 폴리링커에 순차적 증폭 및 제 4 부호화 서열(아로,트케타,아로,아로)의 결찰에 의해 구성되었다(방법 참조). 그 후,4-유전자 구조는 2 개의 더 많은 유전자와 함께 하이브리드 플라스미드로 옮겨졌고,12 킬로바이트 플라스미드에 함유 된 8 킬로바이트 오페론으로 이어졌다(그림 2). 그 결과,플라스미드는 라시크 유전자가 없는 플라스미드 12 아록-아롤-균주로 변형되어,관심있는 유전자의 구성적 발현을 가능하게 하였다(표 1). 이 변형은 1990 년대 초반부터 시작되었으며,1990 년대 초반까지 계속되었습니다. 이 경우,유전자 변형은 유전자에 의해 생성 된 유전자에 의해 생성 된 변형에 의해 생성된다. 그 결과,플라스미드 및 플라스미드 균주(표 1)가 각각 26 및 36 으로 명명되었다.

그림 2 에서는 합성 오페론을 구성하는 코딩 시퀀스의 공간적 배열을 보여 줍니다. 아로 브는 오페론의 첫 번째 유전자이며,여러 증거들이 그 낮은 발현이 방향족 화합물의 생산을 제한하는 단계 중 하나임을 나타내기 때문이다. 또한,이 유전자는 제 1 방향족 화합물(그림 1)인 답을 형성하기 위해 펩 합성 및 응축에 관여한다. 아로드 및 아로 유전자도 포함되었다. 또한,이 플라스미드는 첫 번째 효소를 코딩하는 유전자 유전자를 운반합니다(그림 1). 이 유전자를 포함하기로 한 결정은 다음과 같은 관찰을 기반으로했습니다: 1)과발현의 과발현은 탄소원으로서 글루코오스에서 자라는 플라스미드 대사 부하로 인한 성장률 손실을 실질적으로 회복하였다;2)스트레인 12 는 글루코오스 6-포스페이트(글루코오스 6-포스페이트)노드에서 특히 저탄소 플럭스 분할을 나타낸다는 것이 보고되었다. 따라서,이 유전자의 과발현은 효소 시키 메이트 탈수소 효소에 의해 촉매 양으로 요구되는 나드프 가용성을 증가시켜야하고,상기로부터 유래 된 균주에서 뉴클레오티드 및 아미노산 생합성으로 더 많은 방향 전환에 의해 잠재적 인 성장 영향을 완화 할 수있다. 그러나,이 보고서에 제시 된 실험 활용된 유전자의 특정 효과 해 부 하는 것을 목표로 하지 않았다 하지만 대신 오페론으로 그들 모두를 표현의 결과 특성화 하고자 했다.

모든 유전자의 효율적인 번역을 촉진 하기 위해 각 코딩 시퀀스 번역 시작 사이트의 상류 8 혈압에 있는 합의 샤인-달가르노 시퀀스를 도입 하는 지정 된 프라이머를 사용 하 여 증폭 했다. 생성 된 오페론의 뉴클레오티드 서열은 추가 파일 1 에 제시되어있다.본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따른 또한,상기 제제로서,비어있는 플라스미드를 포함하는 동일한 균주(아로 6 오페론 제외),아르 2 및 아르 3 이 또한 포함되었다.

아록 및 아롤의 변이체에 대해 예상한 바와 같이 모든 경우에 사스가 축적되었음에도 불구하고,프트라카로 6 을 함유한 균주는 빈 플라스미드를 함유한 균주보다 높은 사스 농도에 도달하였다(그림 3). 또한,이 역가는 26 보다 2 배 더 높았다. 높은 아세테이트 농도 및 사의 생산에 체포와 관련 된 문화의 약 18 시간 후 스트레인 아르 26 에서 감소 관찰 되었다. 그 결과,아세트산(아세트산)의 소비량은 무시할 수 있었다(그림 3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3). 이 결과는 인공 오페론에 존재하는 유전자가 기능적이며 문화의 시작부터 사의 생산을 촉진한다는 것을 보여줍니다. 그들의 제정현 감소하는 특정 성장율(μ)25%에 pykF+배경,그리고 소폭 증가에 pykF-변하지 않았다,그러나 중요한 변경을 일으키는 원인이 될 최대 바이오매스 생산(Xmax)변종에 비해서 빈 플라스미드(그림 3a). 이러한 성장 조건 하에서 오 페 론 발현 균주,픽 픽 유전자의 불활 화는 픽 픽의 생산을 증가,아세테이트의 축적을 제거 하 고 꾸준한 글리코겐 소비를 허용.

본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 1)성장;2)생산;3)소비; d)아세테이트 생산;e)Glc 소비와 SA 생산의 AR26 및 AR36 에 fermentors. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

이 두 균주 모두 산도 및 용존 산소 장력(점)의 제어 조건 하에서 1 리터 배치 발효기에서 배양되었다. 또한 바이오매스 생성량을 증가시키기 위해 바이오매스의 초기 농도를 100 그램/리터로 높이고,바이오매스 생성량을 15 그램/리터로 증가시켰다.이러한 조건 하에서 균주는 60 시간 내에 42 그램/리터의 사스를 생성하였고,모든 글루코시스를 소모하고,12 그램/리터의 아세테이트를 축적하였다. 대조적으로,후 47h 긴장 AR26 생산 최대의 13g/L SA 하지 않았다,배기 Glc,축적 29g/L 의 아세테이트(그림 3e 및 표 2). 발효기에 있는 통제되는 조건에 관계 없이,산도가 7 에 유지되고 점이 항상 20%보다는 더 높았었던 곳에,두 균주의 생산 단면도는 동요 플라스크에서 관찰된 행동을 닮았습니다,아세트산 및 더 적은 아세트산 생산과 더불어. 두 균주에 의해 달성 된 글로벌 체적 글루코오스 소비율이 유사하더라도,생산성,수율 및 역가는 2 배 이상 높았다.

그것은 놀라운 아세테이트 및 사 생산에 큰 차이 진화 대장균 균주에 구성 식 시스템을 사용 하 여 승점 및 피크의 결합 된 불활성의 장점을 보여 주는 하나의 유전자를 방해 하 여 관찰 되었다. 사 생산에서 관찰 된 개선에 대 한 계정에 오 테 론 인코딩된 효소의 초기 및 지속적인 식 그들의 세포내 농도에서 높은 변동을 방지 하는 문화에 걸쳐 해당 중간체의 꾸준한 소비를 유지할 수 있는 것이 좋습니다. 피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산-피루브산 그러나,우리는 측정 된 세포 내 대사 산물 농도의 부재에서 이러한 발언은 투기 인정.1 리터 발효기에서의 운동 및 화학량론적 성능의 추가 특성화를 위해 선택되었다. 이러한 목적을 달성하기 위해,사의 생산은 세 가지 다른 높은 기판 배양 조건으로 시험 하였다. 각 사례에 대해 성장,글리코겐 및 부산물을 측정하여 생산성과 수확량을 비교할 수있었습니다.

첫째,50g/L Glc15g/L 의 너희에게 이용(Figure4a). 성장 처음 10 시간 동안 발생,0.53 시간-1 의 건조 세포 무게의 6.3 그램/리터를 생성 합니다. 이 조건 하에서,24 그램/리터의 사스 생산량은 발효 개시 이후 발생하였고,사스 소진까지 지속되었지만,특정 사스 소비율(사스)과 특정 사스 생산성(사스)은 지수 상에서 더 높았다(표 3). 2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일(표 3). 또한,발효작용이 끝날 때 상청액에는 발효작용이 존재하였다(그림 5). 이러한 조건 하에서,발효 과정 동안 사실상 아세테이트가 생산되지 않았으며,32 시간 후에 1.5 그램/리터의 최대 농도에 도달했다(그림 4 에이).

3 개의 다른 기질 농도와 1 리터 생물 반응기에서 재배 균주의 발효 프로필. a)50g/L Glc15g/L 너희;b)100g/L Glc15g/L 너희;c)100g/L Glc30g/L 너희가 있습니다. 초산:열린 삼각형;바이오 매스 농도:역 삼각형. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

3 개의 다른 기질 농도를 사용 하 여 균주의 1 리터 발효기 문화에서 검출 된 사 경로의 방향족 부산물. a)50g/L Glc15g/L 너희;b)100g/L Glc15g/L 너희;c)100g/L Glc30g/L 너희가 있습니다. 다이아몬드: 또한,이 약물은 다른 약물과 함께 사용할 수 있으며,이러한 약물은 다른 약물과 함께 사용할 수 있습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

100 그램/리터 및 15 그램/리터 너희로 제 2 배치 실험을 개시 하였다. 이러한 조건 하에서 재배된 36 은 60 시간 동안 약 42 그램/리터의 사스를 생산하였다(그림 4 비). 이 경우,약 100 그램/리터의 포도당을 섭취하고 사의 최대 농도를 달성 한 후,균주는 12 그램/리터의 아세테이트를 생성했다. 또한,본 발명의 실시예에 따라,상기 제 1 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라, 이 실험은 동일한 너희 농도를 사용할 때 거의 두 배의 시간에 두 배의 글루코오스 양이 소비된다는 것을 보여 주며,이는 평균 포도당 소비율이 두 배양 조건 사이에서 유지된다는 것을 나타냅니다. 이 약물은 항 염증 효과가 있으며 항 염증 효과가 있습니다.이 경우,상기 제 1 형은 상기 제 2 형의 상층액에서 생성된다. 흥미롭게도,두 배로 Glc 농도의 중간 제품의 AAA 통로 증가에서 상당히 비례적인 방식으로 SA 을 나타내는 소비량의 100g/L Glc 하지 않은 분명히 생성하는 새로운 탄소 플럭스를 파악할 수 있습니다. 결과적으로,생성 된 총 방향족 화합물에 대해 형성된 사의 양은 두 실험 모두에서 80%에 가까웠다(그림 6).

각 방향족 화합물의 몰 백분율은 다음과 같이 시작하는 배치 배양에서 총과 관련하여:가)50 그램/엘/엘 및 15 그램/엘;나)100 그램/엘 및 15 그램/엘 너희;다)100 그램/엘 및 30 그램/엘 너희. 생성 된 방향족 화합물의 계산 된 수율 및 몰비가 각 막대 아래에 표시됩니다. 비교는 발효의 끝에서 상등액에서 측정 된 농도로 만들어졌다. 이 값은 다음과 같습니다.; 방향족 화합물의 최대 이론적 수율.

100 그램/리터 및 30 그램/리터를 사용 하 여 실험의 세 번째 세트와 함께 조사 했다. 상기 바이오매스는 2 배의 농도로 사용할 경우 2 배로 증가하였으나,상기 바이오매스는 100 그램/리터 및 15 그램/리터 배양에서 얻어진 것과 매우 유사하였다(도 4 비 및 도 4 씨). 다른 두 가지 조건에서 얻은 데이터와 함께,이러한 결과는 너희 양이 주로 달성 될 수있는 최대 바이오 매스를 결정한다는 것을 시사한다. 또한,초기 너희 농도의 증가는 사 역가를 변경하지 않았다,과 사 주로 포도당에서 생산되고 있다는 관찰을 지원. 이러한 성장 조건에서 시험된 초기 글리코겐 농도에 관계없이,초기 글리코겐 농도와 생성된 최대 바이오매스 사이의 직접적인 관계는 하나 이상의 제한 영양소가 글리코겐 농도에 의해 공급되고 있음을 시사한다. 또한 이러한 영양소는 글루코스에서 합성될 수 없으므로,글루코스가 소진되기 훨씬 전에 너희의 고갈은 성장을 제한한다. 그러나,이 복잡 한 미디어에 있는 다른 화합물 또한 시간이 지남에 성장 제한에 역할을 할 수 있습니다.또한,발효시간이 15 그램보다 약 절반으로 각각 소비되어 생산되었다. 30g/L,너희 이 Qsglobal 및 Qpglobal 두 증가와 비교 fermentations15g/L 의 너희에도 불구 SA titer 변화가 없었다(표 3). 바이오 매스 또한 두 배 증가,이후 계산 된 큐피트와 품질 평가 점수 테스트 조건 하에서 설계 된 변형의 대사 견고성을 전시 지 수 및 고정 단계에서 모두 세 실험 사이 유사 했다.

또한,결과는 너희 농도의 증가가 사 경로 중간체의 농도를 상당히 증가시키지 않았 음을 보여 주었다(그림 5 도). 이 점에서 통로 중간체의 높은 수량의 존재 발효 국물에서 사의 복구에 부정적인 영향을 미칠 수 인정 되었습니다. 이 관심사는 문화 조건,유전 배경 및 부산물 생성을 최소화 하기 위해 시도로 비 대사 포도 당 유사체의 사용 테스트를 선도 하는 주제로 몇 가지 노력을 지시 했다.

이 실험에서 부산물에 비해 높은 비율의 균주 또는 공정에 더 이상의 변형을 적용하지 않고 검출되었다. 각 경로 중간체의 농도는 모든 방향족 중간체의 합과 비교되었으며,그 백분율은 발효가 끝날 때 각 부산물에 대한 사의 몰비를 계산하는 데 사용되었습니다(그림 6). 이 비율은 국토안보부,품질보증,답의 경우 10 보다 높고,테스트된 모든 기판 농도에 대해 조지아 또는 답의 경우 40 보다 높았다. 놀랍게도,모든 조건에서 얻어진 사 수율은 이론적 최대의 50%에 가깝고 총 방향족 화합물(전술)의 수율은 이론적 최대의 60%이상이었고,0 으로 추정된다.(방법 및 그림 6 참조). 높은 포도 당 배치 문화를 사용 하는 경우에 균주 36 에서 단 경로 향해 포도 당의 효율적인 리디렉션을 반영 합니다. 발효작용에 대해 보고된 가장 높은 값을 나타냅니다. 이러한 개선 설계 변형에 플랫폼 효율적인 유전 배경에 필요한 효소의 더 균일 한 식 수 있습니다 계정에 복용 하 여 정당화 될 수 있다. 이,다른 발기인,아래 별도 플라스 미드에서 필요한 유전자를 표현 하는 다른 식 시스템과 달리 또는 균주 높은 수준의 효율적인 사용에 대 한 최적화 되지. 유전자 발현의 역학에 관한 장점 외에도,아로 6 오페론을 유도하는 데 필요 없다는 사실은 생산 공정에 중요한 경제적 이점을 나타냅니다.2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계,기하 급수적 인 단계 및 기하 급수적 인 단계.본 연구결과는 피페론의 존재와 발현이 피페론 및 피페론 단계 동안 당분해효소를 코딩하는 여러 유전자의 전사적 수준을 증가시킨다는 것을 나타낸다(그림 1 및 그림 7).피페론의 발현은 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 및 피페론 이 연구에서는 유전자 발현의 증가가 특히 흥미롭다. 또한,피파와 이노의 전사 수준이 크게 증가하지만 피카는 증가하지 않습니다. 이러한 변화는 방향족 화합물의 수율을 증가,펩 및 과당 6-피(직접 플라스미드 인코딩 트랜스 케 톨라 제에 의해 전자 4 피로 변환 할 수 있습니다)의 높은 가용성으로 변환 할 수 있습니다. 우리는 스트레인 아르 36 에서 당분 분해 유전자의 관찰 된 상향 조절이 이러한 대사 산물을 소비하는 오페론 인코딩 된 효소의 강력하고 구성적인 발현으로 인한 일부 당분 분해 중간체(포도당 6-인산염,과당 6-인산염 및 펩)의 낮은 수준에 대한 결과 중 하나 일 수 있다고 이론화합니다.

2015 년 12 월 15 일(토)~2015 년 12 월 15 일(일) 비교를 위해,각 유전자의 전사 수준은 균주의 성장 곡선의 세 가지 다른 지점에서 결정되었다. 모든 데이터는 초기 기하 급수적 성장 단계에서 변형에서 얻은 값에 대해 정규화되었습니다. 가)당분해효소를 코딩하는 유전자;나)아세테이트 동화 및 생합성에 관여하는 유전자;다)합성 아로 6 오페론으로 구성된 유전자(그림 1 및 그림 2 참조). 검은 색 막대:초기 지수 단계;회색 막대:후기 지수 단계;흰색 막대:고정 단계. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

다른 측면에서,아세테이트 생합성에 관여하는 효소에 대해 코딩하는 유전자의 전사 수준은 합성 오페론의 존재에 의해 변형되지 않았으며,아세테이트 동화에 관여하는 효소에 대해 코딩하는 액티 피와 액티 피는과 아세트산 동화에 관여하는 효소에 대해 강하게 상향 조절되었다(그림 7). 2015 년 12 월 15 일(토)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일)~2015 년 12 월 15 일(일) 이러한 결과는 분석 된 성장 조건에서 낮은 수준의 아세테이트와 관련이 있습니다(그림 4 에이). 중요 한 것은,아세테이트 동화에 관련 된 이러한 유전자의 전사 값 성 단계에서 낮은 했다(그림 7 비). 이 반응이 사용 된 다른 성장 조건을 대표한다면,그것은 부분적으로 발효에서 관찰 된 아세테이트 축적을 설명 할 수 있습니다. 이러한 결과 인위적으로 늦은 문화 단계에서 그들의 식을 증가 하는 잠재적인 유전자 표적으로 서 역할을 강조 표시 합니다.

합성 오페론에 존재하는 유전자는 프로모터의 구성 적 특성과 플라스미드의 높은 사본 수를 반영하는 매우 강한 발현 수준(고정상에서도)을 보였다(그림 7). 이러한 결과는 전체 발효 기간 동안 관찰된 중단없는 글리코겐 소비 및 사 생산과 관련이 있으며,이는 오페론의 유전자에 의해 코딩된 효소가 재배 시간 내내 존재한다는 것을 시사한다. 그것은에서 볼 수 있는 도 7c 는 성적표 수준의 aroD 및 zwf 은 비교적 높고 낮은 각각 다른 것보다 네 개의 유전자에서 오페론. 이 관찰은 오페론의 6 개의 유전자가 참조 균주의 염색체에 존재하는 유전자와 비교되기 때문에주의해야한다. 이후 6 개의 유전자에 대 한 얻은 값은 그들 사이 정규화 되지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고,전사 데이터는 오 페 론 모든 유전자가 적절 하 게 표현 하는 경우 예상 되는 시험된 조건에서 얻은 방향족 중간체의 높은 비율과 일치 합니다. 운동 및 화학량론 데이터와 함께,이러한 결과는 승점 및 화학량론 부족 진화 균주에서 글라이더에서 글라이더의 수율을 높이기 위해 대체 전략으로 구성 적으로 표현 합성 오페론을 고용의 장점을 강조 표시합니다.