클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제는 클라미디아 전이를 위한 선택 마커로서의 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 연구 노트

이 유전자는 또한 고양이 유전자와 융합되어 있습니다. 우리는 대장균 클로람페니콜(최종 농도)를 포함 하는 매체에서 성장할 수 있었다: 고양이 유전자는 또한 클라미디아 변환 실험을위한 선택 마커로서 사용될 수 있음을 시사한다. 왕 등의 알에 의해 경고로.,리 등에 의해 입증 된 바와 같이,호스트 미토콘드리아에 클로람페니콜의 부작용. 클라미디아 변환이 항생제의 유틸리티에 영향을 미칠 수 있습니다. 리 등에서.보고 된 바에 따르면,클로람페니콜의 최소 독성 농도는 10%였다. 우리는 명백한 최저 클로람페니콜 농도 플라스미드 무료 다에 포함 형성을 완전히 억제 결정 했다. 트라코마티스 엘 2 균주 지정 엘 2 알은 0.05 그램/밀리리터(데이터는 표시되지 않음)에 불과했으며,이는 숙주 세포에 유독 한 농도보다 훨씬 낮았다. 따라서,우리는이 항생제 호스트 세포를 크게 강조 하지 않고 고양이 표현 형질을 선택 하는 데 사용할 수 있는 권유.우리는 암피실린으로 형질 전환 된 세포의 절반을 선택하고 나머지 절반은 클로람페니콜로 선택 하였다. 항생제(2,000 그램/밀리람실린 또는 0.1,000 그램/밀리람실린 클로람페니콜)를 변형 후 10 시간에 배양액에 첨가 하였다. 항로 2 에서 시작하여,이들의 농도는 각각 5 및 0.2 로 증가되었고,이들은 접종시에 첨가되었다. 통로 사이의 분할 비율은 통로 1 에서 통로 4 에서 1:1 로 유지되었습니다. 클로람페니콜의 마이크는 감염의 낮은 다중도(세포 당~0.1 포함 형성 단위)에서 결정되었지만,0.05 그램/밀리람베르트,변형되지 않은 클라미디아 중 일부는 0.1-0 의 존재 하에서 개재물을 형성 할 것으로 예상되었다.항생제에 의한 클라미디아 성장 억제의 효능은 감염의 다양성에 의해 영향을 받는다. 상술한 선택 의정서로,단계 대조 현미경의 밑에 암피실린으로,선정된 문화에서,거의 100%년 세포는 처음 통행에 탈선한 박판으로 포함을 포함하기 위하여 찾아냈습니다. 탈선 적인 암반 함유 흠도 통로 2,셀의 작은 비율에 여전히 존재 하지만 대부분 통로 3 에서 분명히 정상적인 흠에 의해 대체 되었다. 정상적인 개재물은 약 20%세포에서 발견되었고,비정상적인 개재물은 4 번 구절에서 거의 관찰되지 않았다. 통로 4 에서 10%수확 접종의 결과 통로 5 에서 흠 80%세포;에서 발견 되었다 분명히,이러한 흠 중 어느 것도 탈선 적란체 포함.

클로람페니콜은 클라미디아가 비정상적인 혈통을 형성하지 않기 때문에,우리는 포함 크기에 따라 항생제에 대한 내성을 판단했습니다. 정상보다 작은 크기의 내포물은 통로 1 의 거의 모든 세포에서 검출되었다. 일부,그러나 매우 작은 크기의 흠도는 통로 2 에서 발견되었고,그 흠도의 대부분은 통로 3 에 의해 정상 크기의 흠도로 대체되었습니다. 통행 4 에 20%세포안에 정상 치수가 재진 포함은 발견되었다. 10%통로 4 수확으로 접종 한 후 유도 된 통로 5 에서 클로람페니콜 농도의 증가(0.2 통로로부터 0.5 통로까지 0.5 통로까지),거의 100%세포에서 정상 크기의 개재물이 발견되었다 0000000.

선택 에이전트에 명백한 저항 뿐만 아니라,우리는 성공적인 변환에 대 한 추가 마커로 글 리 코겐 합성의 복원을 사용 합니다. 1:100 희석 속도(세포 수 등가)에서 맥 코이 세포를 감염 시키기 위해 사용 되었다(그림 2). 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드-무형성 플라스미드 글리코겐 합성이 확립 된 결과와 일치 함. 트라코마 티스는 플라스미드를 필요로,요오드 얼룩은 글리코겐이 야생 형의 개재물에 축적 된 것으로 나타났다 엘 2(그림 2 에이)하지만 그 엘 2 엘(그림 2 비). 클로람페니콜(최종 농도:0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 왕 등의 알에 의해 발표 된 데이터와 일치. 100,000 원::암피실린-글리코겐 함유 물(그림 2).암피실린-글리코겐 함유 물(그림 2).암피실린-글리코겐 함유 물(그림 2). 클로람페니콜로 선택된 클로람페니콜은 또한 글리코겐을 함유하는 글리코겐 양성 개재물을 형성했다(그림 2 에프). 예상대로,암피실린-선택된 형질 전환제는 클로람페니콜의 존재 하에서 정상 크기의 글리코겐-양성,글리코겐 함유 개재물을 형성 할 수 있었다(그림 2 지);마찬가지로,클로람페니콜-선택된 형질 전환제는 암피실린에 완전히 저항성이었고,발현 된 글리코겐 및 생성 된 글리코겐(그림 2 시간). 이 결과는 고양이 유전자가::클로람페니콜 저항은 클라미디아 변형에 대한 선택 마커로 사용될 수 있습니다.

우리는 다음 단계에서 락타 마제 유전자를 제거했습니다.::변형된 클라미디아는 상기와 동일한 요법을 사용하여 클로람페니콜로 선택을 하였다. 클로람페니콜 내성 개재물은 통로 4 의 배양에서 감염된 세포의 약 20%에서 나타났다. 형광 현미경 검사법과 요오드 얼룩은 5 번 항로로부터 채취 한 클로람페니콜의 존재 하에서 배양 된 세포에 글리코겐 양성 개재물 및 글리코겐 양성 개재물을 나타냈다(그림 3,상부 패널). 그러나,플라스미드에 있는 락타마제의 부족의 결과로,변형제는 암피실린의 면전에서 정상적인 포함을 형성할 수 없었습니다;대신,그들의 포함은 이상한 박판으로 채워졌습니다. 불규칙한 내포물은 여전히 글리코겐이 양성 이었지만 글리코겐은 거의 없었습니다(그림 3,하단 패널). 각 통로에 대해 1:100 분할 비율로 4 개의 통로에 대해 클로람페니콜을 추가로 배양하였다. 모든 포함에서 통과 9 동일한 모양으로 포함의 플라스미드-들로 가득하 chlamydiae 과하지 않는 플라스미드 무료 L2R,그리고 모든을 발견 했 GFP 익스프레스(데이터시하지 않음). 트라코마티스 변형에 대한 선택 마커로서 기능한다.

그것은 그 탐 등을 주목해야한다. 이전에 선택적 마커로 고양이 유전자 변환 시스템을 개발 하려고 했습니다. 그 연구에서,고양이 유전자를 포함하는 셔틀 벡터를 전자 공학적으로 처리 하였다. 그 결과,그 결과는 다음과 같습니다. 비록 고양이 미르나 효소 활성 변환된 클 라 미 디아의 초기 문화에서 검출 했다,저자 4 구절에 대 한 클로람페니콜로 선택 후 안정적인 변환 제를 얻기 위해 실패 했습니다. 그것은 모두 균주 일렉트로 포함 하는 기본 플라스미드 변환에 사용 되는 재조합 플라스미드와 동일한 복제 기원을 공유 하는 것이 중요 합니다. 왕 등 이후. 페니실린 내성 형질 전환제는 플라스미드가없는 플라스미드에서만 얻을 수 있었다. 트라코마티스 엘 2 변종,하지만 야생 형,플라스미드 가득 434/부,그렇지 않으면 동일한 실험 설정에서,그것은 소급 놀라운 일이 아니다 탐 등. 안정한 클로람페니콜 내성 클라미디아를 유도하지 못했습니다.

클라미디아 전이를 위한 선택 마커로서의 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제

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