클로 드로 네이트 함유 리포좀에 의한 대 식세포 고갈은 쥐 및 토끼에서 풍선 손상 후 신인 자극 형성을 감소시킨다

염증 세포는 손상 직후에 모집 된 혈관 수리에 중요한 역할을한다.1,2 죽종 절제술 조직에서의 대 식세포 침윤 및 혈액 단핵구의 활성화 상태는 증가 된 재협착 속도와 관련이 있습니다.3,4 재협착에서 대식세포의 영향은 아마도 재협착의 발병에 기여하는 수많은 성장 인자,사이토카인 및 효소를 발현하는 능력에 기인할 것이다.5 따라서,우리는 단핵구 및 대 식세포의 전신 불 활성화가 신 자극 형성의 감쇠로 이어질 수 있으며 대 식세포가 재 협착의 병인에 중추적 인 역할을한다는 가설을 세웠다.

대 식세포 고갈은 클로 드로 네이트를 함유 한 리포좀의 전신 주입으로 달성 될 수있다.6 클로 드로 네이트는 파골 세포의 강력한 억제제 인 뼈를 찾는 약제 인 비스포스포네이트 계열에 속합니다. 다른 혈압과 마찬가지로 클로 드로 네이트는 세포막 투과성이 좋지 않습니다.7 리포좀은 망상 내피 시스템의 세포,특히 대 식세포에 의해 쉽게 흡수됩니다. 클로 드로 네이트의 리포좀 매개 전달은 효과적인 식균 후 대 식세포를 비활성화 및 죽이지 만 비 식세포 세포에는 독성이 없습니다.6

방법을

리

Clodronate(Sifavitor)and rhodamine RE(Avanti 북극 지질)에 캡슐화 된 리 50µ/L distearoyl-phosphatidylglycerol(DSPG)(Avanti),100µ/L 콜레스테롤(Sigma 화학 물질),및 150µ/L1,2-distearoyl-sn-라우린지,글리세로제라틴 등이-3-phosphocholine(DSPC)(Avanti)by reverse-phase 증발 기술,다른 부분에서 설명한 것처럼.리포좀의 평균 크기는 각각 190,24.5 밀리몰/엘,20 밀리몰/엘,클로드로네이트 및 지질이었다.

대 식 세포 같은 원시 264 세포에 대 한 생물 학적 활성의 검증을 결정 했다. 이 연구에서는 연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,연구된 연구 결과에 따르면,8,10

토끼 모델

뉴질랜드 흰 토끼(할란 연구소,예루살렘,이스라엘)무게 2.5 에 3.5 킬로그램은 예루살렘 히브리 대학교 및 미국 국립 보건원의 동물 보호 지침에 따라 사용되었습니다. 동물은 혈관 성형술 30 일 전에 시작하여 2%콜레스테롤과 6%땅콩 기름의 죽상 경화성 식단을 먹였습니다. 고 콜레스테롤 혈증이 확인되었습니다(혈장 콜레스테롤>1200 밀리그램/디딜 방아). 그 후,환자는 약물 복용을 중단 할 수 있습니다. 헤파린(200 밀리그램/킬로그램),아트로핀(0.05 밀리그램)및 노르 플록 사신 니코 티 네이트(70 밀리그램)가 투여되었다. 풍선 손상은 왼쪽 경동맥에서 3 밀리미터 혈관 성형술 풍선 카테터(코디,8 기압에서 2,000,000 분 인플레이션)로 수행되었습니다. 정맥 내 리포좀 또는 자유 클로 드로 네이트(15 밀리그램/킬로그램),빈 리포좀 또는 완충액. 실험 그룹의 유형에 눈을 멀게 조사자는 실험을 수행. 안락사 후 동맥 관류-고정 된 장소에서 4%포름 알데히드 용액(산도 7.4),형태 학적 분석을 위해 처리되고,베르 호프 엘라스틴 염색,메이어 헤 마톡 실린 및 에오신 및 변형 된 모바 트 펜타 크롬으로 염색된다.

쥐 모델

350 내지 420 그램의 수컷 사브라 쥐(할란 실험실)가 사용되었다. 쥐 경동맥 손상 모델은 이전에 설명 된대로 수행되었습니다.11,12 리포좀 클로 드로 네이트(15 밀리그램/킬로그램)를 -1 일 및+6 일에 주사 하였다. 장기를 14 일째에 수확하고 전술한 바와 같이 처리하였다.

형태 분석

각 슬라이드에서 8~10 섹션 전산화 형태 분석(국립 보건원 이미지)실험 그룹의 유형에 눈 멀게 하는 조사자에 의해 분석 되었다. 네오 인티 마에 의해 가장 큰 내강이 좁아지는 섹션은 이전에 설명한 바와 같이 분석되었습니다.11 잔류 루멘,내부 탄성 층(원래 루멘)에 의해 경계되는 영역 및 외부 탄성 층(총 동맥 영역)에 의해 경계되는 영역을 직접 측정 하였다. 신 내막 농축의 정도는 신 내마 면적과 원래 내강(%협착)의 비율 및 신 내막 영역과 미디어 영역 사이의 비율로 표현되었습니다. 개장,수축(네거티브)및 광대 한(긍정적인),및 개장 비율(아르 자형)의 정도 인접 한,비 손상 된 참조 세그먼트와 풍선 부상 세그먼트의 총 동맥 영역의 비율을 비교 하 여 추정 했다.

Cytometry

Anticoagulated 혈액(200µL)was incubated30 분 동안(4°C,어둠 속에서)마우스 anti-인 RPE-활용 anti-CD14(가 ダッコ 에서 집착할). 팩스용해액(1:20 희석)을 15 분 동안 첨가하였다. 유세포 계측법을 위해 1 밀리리터의 팩스매질로서 현탁(1500 분당 회전수,5 분,4 분당 회전수,4 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수,1 분당 회전수, 단핵구는 상대 크기,측면 산란 및 형광에 따라 확인되었습니다.1498>

리포좀의 분포

토끼에게 로다민 표지 리포좀을 주입하거나 완충제를 -1 일에 투여하고+1 일 및+6 일에 안락사시켰다. 피콜 그라디언트(시그마)및 원심 분리(1500 분당 회전수,5 분)를 사용하여 혈액 단핵구를 분리 하였다. 수확된 조직을 식염수로 헹구었다;섹션은 슬라이드에 장착되고 공초점 현미경으로 관찰되었다.

면역조직화학

외식된 표본을 짧은 식염수 관류 후 절제하고 즉시 냉동 절제를 위한 10 월 화합물에서 동결시켰다. 슬라이드를 탈 파라핀 화하고,메탄올(10 분)에서 1%물 2 로 배양하여 내인성 퍼 옥시다아제를 차단 한 다음,10%말 혈청 피필을(20 분)동안 투여 하였다. 1 차 항체(다코)를 1 시간 동안 투여하였다. 이어서 바이오티닐화된 2 차 항체(말 안티마우스,벡터 실험실)및 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체(알파벳 엘리트 키트,벡터 실험실)를 각각 30 분 동안 세척하였다. 색상의 개발은 퍼 옥시 다제 기판(시그마)의 존재하에 3,3′-디아 미노 벤지딘 테트라 하이드로 클로라이드(소량 퍼 옥시 다제 기판,시그마 화학 공동)에 5 분 노출에 의해 달성되었다. 슬라이드는 아가미 3 호 헤 마톡 실린(시그마)으로 약간 역표되었다. 양성 염색은 현미경(올림푸스,40)에서 2,000,000/0.25 10,000,000/0 으로 평가되었다.25 배율 및 디지털화 된 비디오 프레임. 대 식 세포의 보급 5~6 높은 전원 필드에 긍정적으로 스테인드 셀에 의해 점유 하는 평균 백분율 영역으로 평가 되었다.

일-1 생산 및 전사

동물의 별도 그룹 이러한 연구에 사용 되었다. 동맥과 간은 콜라게나 제 완충액에서 균질화되었고,추출 된 일-1 은 상업용 엘리사 키트를 사용하여 측정되었습니다.1498>

역전사–중합 효소 연쇄 반응에 대 한 분석,경동맥에서 경동맥 분리 키트(생명 기술)를 사용 하 여 추출 했다. 품질,크기,그리고 양의 RNA 사 했고,값의 밴드들을 정규화하 β-말라 mRNA expression.13

매트릭스 메탈로프로테이나제 -2 활성

콜라게나제 완충액에서 동맥 균질화의 상등액을 콜라게나제 활성에 대해 분석 하였다. 젤라틴 함침(1 밀리그램/밀리람베르트)에서 샘플을 분리하였다: 100%폴리아크릴아미드 겔을 메탄올/아세트산/물(30:10:60)에서 콜라게나제 완충액(16 시간,37 시간)에서 배양하고,0.5%쿠마시에지 250(바이오라드)으로 염색하였다. 밴드 강도 컴퓨터 밀도 측정법에 의해 결정 되었다(분자 역학 유형 300 에이).

통계

데이터는 평균으로 표현된다. 대조군과 치료군 간의 조직 학적 소견의 비교는 짝을 이루지 않은 학생의 티 테스트에 의해 이루어졌습니다. 시간 경과에 따른 혈액 단핵구 및 사이토 카인의 비교는 2 방향 분산 분석. 차이는 통계적으로 유의했다 피<0.05.

결과

혈관 성형술 과형성 예방

풍선 손상 후 대조군 동물에서 세포 외 기질 형성 및 세포 외 기질 형성의 대규모 증식이 관찰되었다(그림 1,에이 및 비). 용액에서 빈 리포좀,식염수 또는 유리 클로 드로 네이트에 의한 치료 사이에 유의 한 차이가 발견되지 않았습니다(대조군으로 풀링 된 결과). N/M 의 비율 1.4±0.44(그림 1),그리고 내강 협 75±8%. LC(15mg/kg,일 -1+6)감 N/M 율을 0.66±0.2(그림 1,c,d,e)내강 및 협 41±8%. 가벼운 광대 한 리모델링은 두 대조군 모두에서 발생했습니다(아르 자형=1. 22±0.24)및 LC-동물 처리(RR=1.29±0.25). 내측 영역,뼈 형태 및 미네랄 성분은 액상 치료에 영향을받지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 명백한 감염 및 탐지가능한 조직 부작용은 관찰되지 않았습니다.

비 고 콜레스테롤 혈증 동물 모델(거품 세포 없음)에서 대 식세포 고갈의 효과를 확인하기 위해 쥐 경동맥 손상 모델이 사용되었습니다.11 표시된 네오 인 티마는 내측 및 총 동맥 면적에 유의 한 변화가없는 정맥 치료에 의해 억제되었습니다(표).

행동 메커니즘

혈액 단핵구 및 조직 대 식세포의 감소

기준 단핵구 수준은 백혈구의 2.8%였다. 수술 전,정맥 주사 후 24 시간 동안 단핵구는 총 정맥의<0.2%로 급격히 감소했으며(그림 2,에이 과 비),반면 정맥 수는 변하지 않았습니다. 수술 3 일 후,혈액 단핵구는 대조군 동물에서 3.5%,대조군 동물에서 0.4%,대조군 동물에서 0.7%,대조군 동물에서 0.7%로 약간 증가하여 6 일 후 기준선 수준으로 되돌아 갔다(그림 2).

간 및 비장 대 식세포는 손상 후 6 일(그림 3)에 의해 감소되었다. 간에서 긍정적으로 염색 된 영역은 21.5%에서 14.7%로 2.9%로,비장에서 33.3%에서 1.5%에서 11.4%로 각각 대조군 및 엘씨 처리 된 토끼에서 유의하게 감소되었다. 유사하게,대 식세포에 대한 감소 된 동맥 램 -11 염색은 부상 후 3 일 및 6 일 후에 정맥 처리 된 토끼에서 관찰되었다(그림 4).

단핵구 및 대 식세포의 감소는 또한 형광 리포좀(플로리다)의 주입에 의해 검출되었다. 형광 신호의 현저한 감소는 혈액 단핵구(뿐만 아니라 감소 된 수)와 간 및 비장 치료 동물의 간에서 관찰되었다(그림 5). 플로리다 부상 하지만 그대로 동맥에서 발견 되었다. 액체와 플로리다 공동 관리 크게 손상 된 동맥 벽에 형광 신호 감소(그림 5).

1.6%에서 대조군 동물에서 1.7%로 감소되었다(그림 6,에이 및 비). 네오 인티 마는 이 초기 시점에서 거의 관찰되지 않았다.

부상 후 동맥 조직에서 일-1 차 수준의 분석 결과,종 모양의 패턴이 부상 후 6 일에 정점에 도달하여 30 일 후에 기저 수준으로 돌아 오는 것으로 나타났습니다(그림 7).,그리고 일-1 차 수준의 유의 한 감소가 3 일 및 6 일 후에 관찰되었습니다. 제어 동물,IL-1β mRNA 전사했다 더 강해 하루에 3 개 이상의 약한 식 후 1 일 부상을,하지만 모두 크게 감소해서 LC 치료(그림 7). 간에서 일리노이-1 제 1 차 수준도 하루에 액의 단일 주입 후 감소 했다 -1,기저 수준으로 경사 30 일(데이터 표시 되지 않음).

동맥 매트릭스 metalloproteinase(MMP-2)증가 활동 후 상해,전시 종 모양의 패턴에 최 6 일(292±46)반환하는 기초 수준에서 14 일(그림 7c). 그 결과,1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지,1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지 계속되었다.

토론

이 연구는 리포좀 캡슐화 된 클로 드로 네이트의 전신 투여에 의한 대 식세포의 불 활성화가 쥐와 고 콜레스테롤 혈증 토끼 모두에서 풍선 손상 후 내강 손실을 억제한다는 것을 처음으로 보여줍니다. 이러한 결과 대 식 세포 가속된 동맥 병 증의 병 인에 중추적인 역할을 우리의 가설을 확인 합니다. 관강 영역의 관찰 된 증가는 주로 신 내막 과형성의 감소를 통해 달성되었다. 광대한 개장에 있는 온화한 증가는 또한 설명되었습니다,그러나 내강 지역에 있는 다름에 그것의 기여금은 최소 이었습니다.

클로 드로 네이트는 골다공증을 포함한 뼈 관련 질환에 임상 적으로 사용되는 약물 인 혈압의 가족에 속합니다. 높은 친수성 및 음전하를 띤 자유 혈압은 세포막을 거의 횡단 할 수 없습니다.7 뼈 재 흡수 파골 세포(혈액 단핵구에서 대 식세포로 발생)에 의한 혈압 흡수는 세포가 약물 코팅 된 뼈를 삼킬 때 발생합니다.7 도 무료 clodronate 도 LC 저해 SMC 또는 EC 확산 또는 neointimal formation. 대 식세포에서 클로 드로 네이트의 효과적이고 선택적 엔도 사이토 시스는 리포좀에 클로 드로 네이트를 캡슐화함으로써 달성된다.9,10,14 식균 작용 후,리소좀 작용은 리포좀의 지방 이중층을 방해하고 자유 클로 드로 네이트가 세포 내로 방출되어 돌이킬 수없는 기능적 손상 및 세포 사멸을 일으킨다.8,15

대 식 세포 마이그레이션에 의해 매개 되는 상해에 대 한 초기 단계 응답을 중단 했다.16 부상 전 액체낭염 주사 혈액 단핵구(그림 2)와 간,비장 및 손상된 동맥벽의 대 식세포 수 및 활성이 급격히 고갈되었습니다(그림 3,4 및 5). 단핵구/대식세포 이동을 루멘 및/또는 외벽으로부터 손상된 혈관으로의 차단(그림 5)에 의해 혈액 단핵구의 비활성화와 함께 보이는 효과와 유사할 수 있다.

IL-1β 및 MMP-2 레벨에서 감소 했 부상당한 동맥 후 세그먼트 LC 치료입니다. 동맥 손상 후 분비되는 활성화 된 대 식세포의 이러한 주요 생성물은 신 자극 증식 과정에 기여합니다.18-20 대식세포는 대식세포의 주요 표적이 될 수 있다. 동맥에 거품 세포 없이 쥐 모델에서 내막 증식의 억제 추가 메커니즘 운전으로 대 식 세포의 전신 고갈을 지원 합니다. 함께 찍은,이 일시적인 전신 면역 조절 및 항 염증 효과 감소 뇌척수액 이동 및 증식 및 동맥 재 협착.

우리의 연구 결과는 다양 한 양식에 의해 대 식 세포 기능의 변조 후 관찰 하는 유익한 효과와 동시. 맥-122 의 봉쇄 및 맥-1–결핍 마우스에서 토끼에서 부상 후 감소 된 네오 인 티마 형성이 달성되었다.23 따라서,최근 보고서에 따르면,9,17,22,23 염증 과정은 네오 인티 마 형성의 캐스케이드에서 중추적 인 역할을합니다. 대 식세포 고갈은 또한 정맥 이식의 증식을 감소시킵니다.24 방아쇠,영향을받는 혈관,혈관 성형 동맥의 기본 플라크,협착 조직의 구성 및 과정의 지속 기간 측면에서 다른 병리학에도 불구하고 정맥 이식 모델의 긍정적 인 효과는 혈관 내막 증식을 자극하는 대 식세포의 일반적인 역할을 시사합니다.

시사점 및 한계

자유 클로 드로 네이트는 세포에 침투하지 않으며 전신 순환에서 짧은 반감기를 갖는다.6 죽은 대 식세포 및 리포좀에서 누출 된 클로 드로 네이트는 뼈 이외의 조직에 상당한 정도로 축적되지 않습니다. 대부분의 다른 리포좀 및 미립자 약물 전달 시스템과 마찬가지로 리포좀 제형의 결과가 망상 내피 시스템에 있었기 때문에 체세포 성장 또는 혈청 미네랄 함량에 영향을 미치지 않았습니다. 또한,15 밀리그램/킬로그램 무료 클로 드로 네이트의 두 주사는 정상 뼈에 영향을 미치지 않아야합니다.25

대 식세포의 불 활성화는 면역 억제 및 감염의 위험을 수반한다. 그러나,맥-1–결핍 마이크 26 및 쥐에 대 한 연구에서와 같이 24 아니 명백한 감염 과도 대 식 세포 고갈 우리의 연구에서 관찰 되었다. 이 연구에서 혈액 단핵구는 주사 후 6 일 동안 완전히 회복되었으며,일-1 농도는 기저 수준으로 돌아 왔습니다. 다른 대 식 세포 기능의 회복 4~6 일 후 액체에 의해 유발 된 고갈 유도 아니 장기 독성 효과 나타났습니다.6,14 간 및 비장 대 식세포의 일시적,부분적 고갈의 임상 적 의미는 인간의 시험에서 더 조사되어야한다.

동물에서 내막 증식을 억제하려는 약리학 적 시도에 대한 많은 보고서는 인간의 재 협착의 후속 억제로 번역되지 않았다. 현재 연구 혈관 복구에 염증의 역할 및 부상 후 내막 증식의 감소에 타고 난 면역을 변조의 가능한 값을 명료 하 게 조사 도구로 액션을 사용 합니다. 이 두 가지 동물 모델 인 쥐와 고 콜레스테롤 혈증 토끼에서 이질적인 손상과 다른 정도의 염증이 관찰되었다는 것은 혈관 수리에서 단핵구 및 대 식세포의 주요 역할을 지원하고 인간의 재 협착 억제에 대한 예측 가치를 증가시킵니다.

대 식세포가 풍부한 부위는 불안정 협심증 및 급성 심근 경색 환자의 죽상 경화성 병변에서 만연하며,3 및 대 식세포는 아마도 죽상 경화성 플라크의 파열 및 급성 관상 동맥 증후군의 갑작스런 발병을 매개한다.27 추가 연구는 리포좀 비스포스포네이트에 의한 대 식세포 고갈이 급성 관상 동맥 증후군을 포함한 다른 염증 매개 혈관 병증 및 심근 병증을 안정화시키는 전략을 부여 할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 보증됩니다.

결론적으로,엘씨 투여는 래트 및 고 콜레스테롤 혈증 토끼 모델에서 풍선 손상 후 신 자극 증식을 억제했다. 제안 된 메커니즘은 단핵구/대 식세포 활동의 전신적 선택적 일시적인 조절입니다. 대 식세포는 신 자극 조직에서 상대적으로 빈약하지만 신 자극 증식 과정에서 중요한 역할을합니다. 따라서 손상 후 1 주일 동안 대 식세포의 조기 조절 및 불 활성화는 나중에 혈관 성형술 후 동맥 협착을 크게 감소시킵니다.

각주