항체를 대상으로 claudin-1 잠재적으로 대장암 치료

CRC 샘플

에 대한 유전자 발현 분석,우리가 선택한 143 종양 샘플에서 143 환자에 포함 된 세 개의 동료:미래의 단일 센터의 연구 REGP(19 환자)(GSE62322),회고전 멀티-센터의 연구 COSIVAL(68 환자) 와 미래의 멀티-센터의 연구 BIOCOLON(56 환자)(GSE62080 및 GSE72970). 이 세 가지 연구에서 포함 기준은 조직 학적으로 입증 된 결장 선암,진행성 및 양측 측정 가능한 종양(4 기),18 세에서 75 세 사이의 연령 및 세계 보건기구(누가)성능 상태 2. 치료 전에 모든 환자는 원발성 종양 절제술 또는 내시경 생검 수술을 받았습니다.

웨스턴 블롯 분석을 위해 전향 적 단일 센터 연구 정규군에서 13 개의 추가 종양 샘플을 사용했지만 143 개의 샘플에 포함되지 않았습니다.

면역조직화학분석을 위해 몽펠리에 병리파일의 암 연구 연구소에서 동일한 환자에 대해 정상 점막,선종 및 선암종 샘플을 이용할 수 있는 경우에만 52 명의 추가 환자로부터의 조직 샘플을 소급 선정하였다.

인간 조직 샘플을 사용한 모든 연구는 관련 윤리위원회의 승인을 받았으며 모든 참가자는 연구 목표 및 방법에 대해 통보 받고 등록 전에 서면 동의서에 서명했습니다.유전자 발현 분석

결장 샘플(정상 결장,원발성 종양 및 간 전이 샘플,그러나 보존 및 생체 결장 시험을위한 원발성 종양 표본 만)은 표준화 된 절차에 따라 수술 당시 수집되었습니다. 그런 다음 샘플을 인간 게놈 133 플러스 2.0 어레이로 하이브리드 화했습니다.,산타 클라라,캘리포니아).

항 체 기반 치료에 대 한 새로운 치료 목표를 식별 하기 위해,우리는 정상 점 막(엔=17),기본 종양(엔=20)및 간 전이(엔=19)조직 샘플의 유전자 발현 프로 파일을 비교 했다.143)는 3 개의 독립적인 그룹에 의해 제안 된 유전자 발현 프로필 및 최근 합의 분류에 따라 유전자 발현 프로필 분자 분류를 사용 하 여 분류 했다. 간단히,데 수사 이.멜로 외. 종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면,종양에 대한 연구 결과에 따르면, 사다난담 외. 세포 표현형에 따라 5 개의 분자 아형을 확인했습니다:잔 모양,통과 증폭(타),장 세포,줄기 모양 및 염증. 마리사 외. 설명 된 6 개의 분자 아형(씨 1~씨 6)다음과 같은 주요 특징: 또한,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성되고,면역세포는 면역세포에 의해 생성된다. 마지막으로,이전에 발표 된 6 개의 서명부터 시작하여 국제 컨소시엄은 4 개의 합의 하위 유형으로 분류를 발표했습니다. 분자 하위 유형에 따른 샘플 분포는 추가 파일 1:표 1 에 나와 있습니다.상기한 바와 같이 3 개의 조직 코어(각각 0.6 밀리미터 직경)를 사용하여 조직 마이크로 어레이에 샘플을 조립하였다. 간단하게,3-μm 섹션의 TMA 었 de-paraffinized 및 재수에서 등급 알코올. 열-유발 항원이 검색되었을 수행하여 배양 TMA 섹션에서 EDTA buffer(pH9)98°C 에서 물 bath20min. 항체 희석제(다코,글로스트럽,덴마크)를 단독으로 60 분 동안 배양하였다. 1 차 항체 결합은 구상 시스템 및 다코 오토 세이너(다코,글로스트럽,덴마크)를 사용하여 시각화되었다. 염색 강도(0,염색 없음;1,황색;2,갈색;및 3,암갈색)를 각 개별 전두엽 반점에 대해 평가하였다.1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지,1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지,1990 년대 초반부터 1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,1990 년대 초반까지,10 밀리리터의 정제)믹서 밀을 사용하여 300 단위(키아 겐,발렌시아,캘리포니아). 단백질 농도는 브래드포드 분석(피어스 쿠마시 플러스 단백질 분석)으로 결정되었다. 그런 다음,50µg 의 총 단백질에 의해 해결 되었 12%SDS 페이지에 전송 니트로 막(Whatman®Protran®,숨구멍 크기 0.45μm). 비 특이성 결합 부위를 실온에서 1 시간 동안 0.1%(권/권)트윈 20(권-티)에서 5%(중량/권)무 지방 우유로 차단 한 다음 4 에서 배양 하였다. 그런 다음 막을 세척하고 1 시간 동안 적절한 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제-공액 2 차 항체로 배양 하였다.; 정규화를 위해 튜 불린 발현을 사용 하였다.

세포하 단백질 추출

단백질 추출은 앞서 설명한 바와 같이 수행되었다. 각 샘플에 대해 20-20 두께의 섹션을 저온 살균제로 절단하고 액체 질소에 혼합 한 다음 미세 유봉으로 부드럽게 분쇄했습니다. 세포 하 단백질 추출을 위해,단백질 추출물 세포 하 단백질 추출 키트는 제조업체의 지침(칼 바이오 켐)에 따라 사용되었습니다. 세포 내 분획물(각 10 그램/개)을 12%의 세포 내 페이지 겔에 적재 하였다. 면역블롯팅은 전술한 바와 같이 다음의 1 차 항체에 대해 수행되었다.1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 12 월 15 일,1990 년 188). 을 얻 CLDN1-긍정적인 된 sw480cell line(된 sw480-CLDN1),된 sw480 세포를 안정적으로 transfected 인 CLDN1cDNA 복제(Invitrogen MGC 컬렉션)또는 빈 벡터(pcDNA)를 사용하 jetPRIME™transfection reagent(Polyplus-transfection Inc.,프랑스). CLDN1-긍정적인 복제를 선정하여 성장하는 transfected 세포에서 존재의 500µg/ml geneticin. 에 대한 CLDN1 침묵,SW620 었으로 불리고 이 pSIREN 벡터를 포함하는 shRNA 에 대한 CLDN1(SW620shCLDN1)또는 루시페라아제(shLUC,부정적인 제어). 24 시간 후,퓨로마이신 1 개를 사용하여 세포를 선택하고,안정한 클론을 풀링하였다. 모든 과도 형질감염은 젯프라임 형질감염 시약을 사용하여 수행되었다.2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 12 월 25 일,2013 년 첫 번째 주사에 대한 완전한 프로 인트의 보조제(시그마)와 다른 4 개의 주사에 대한 불완전한 프로 인트의 보조제(시그마)와 혼합되었습니다. 제 5 차 예방접종 후 3 개월 후에 투여하였다. 3 일 후,면역화 된 마우스의 비장 세포를 마우스 골수종 세포주와 융합시켰다.8.653 마우스 하이브리도마를 생산합니다. 새로 생성 된 클론의 상청 액 형광 활성화 셀 정렬(팩스)에 의해 스크리닝 되었다. 상기 스크리닝 결과는 상기 셀 및 상기 셀 및 상기 셀 및 상기 셀 및 상기 셀들을 이용한 추가 스크리닝을 수행함으로써 확인되었다. 또한,본 발명에 따른 클론은 희석을 제한함으로써 선택 및 복제되었다. 모든 동물 실험은 프랑스 정부의 실험 동물 연구 지침을 준수하여 수행되었다.

방사과 SPECT-CT imaging

여성 athymic nude mice(6-8 주)에서 구입 한 할란. 1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일,1995 년 12 월 15 일)방법. 4 헤드 멀티플렉싱 멀티 핀홀 나노스펙트 카메라로 전신 단일 광자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상을 획득했습니다.,워싱턴,미국)다양한 시간에(48,72 과 96 시간). 동시에,전신 마이크로 코네티컷 이미지는 해부학 적 공동 등록을 위해 획득되었습니다. 원 SPECT 및 CT 데이터 시각화와 공동 등록된 사용 Invivoscope®도 있습니다.

클론 생성 분석

대장 암 세포를 6 웰 플레이트(150,250 또는 400 개의 세포/웰)에 시드하고 밤새 37 에서 고착시킬 수 있었다. 그 후,각 우물에 1 밀리람베르트(최종 농도:100 밀리람베르트/밀리람베르트)를 첨가하고,세포를 6 일 동안 배양하였다. 항체가없는 배지에서 6 일 더 지난 후,플레이트는 셀리 고 및”단일 콜로니 검증”응용 프로그램을 사용하여 이미징 세포 계측기를 판독 하였다. 이 Celigo™cytometer 는 벤치탑 현장에서 셀룰러 분석 시스템을 제공하는 이미지의 우물을 사용하여 밝은 필드에는 조명(Nexcelom 생명과학과,MA,미국).

3 차원(3 차원)회전타원체 배양의 확립

초저 부착,둥근 바닥 96 웰 플레이트(코닝 코스타)회전타원체 형성에 사용되었다. 또한,이 세포들은 104 의 밀도로 시딩되었다. 세포는 24-72 시간 내에 3 차원 회전 타원체로 집계되고 병합됩니다. 우물의 이미지는 5,000,000,000 대물을 사용하여 위상 대비 현미경으로 촬영하거나”종양권”응용 프로그램을 사용하여 셀리 고 1,000,000 이미징 세포 계측기로 캡처했습니다. 세포 생존력은 세포 티터-글로 발광 세포 생존력 분석(미국 위스콘신 주 매디슨 프로 메가)으로 평가되었습니다. 10 분 동안 각 웰에 셀티터 글로 시약 100 개를 첨가 한 후,1450 마이크로 베타 트리 룩스 발광 마이크로 플레이트 판독기(퍼킨 엘머)에서 발광을 측정 하였다.

회전 타원체

회전 타원체에서의 세포주기 및 증식 분석은 초저 부착 96-웰 플레이트에 웰 당 1000 개의 디피 세포를 도금하고,5 일 동안 100 개의 디피 세포를 성장시킴으로써 제조되었다. 세포주기 분석을 위해,세포를 펠렛 화하고,트립신 화하고,핍핀으로 세척하고,75%에탄올로 고정시키고,40 으로 염색 하였다. 세포 주기 분포는 플로-3 채널을 사용 하 여 베크만 풀베는 풀베는 흐름 세포 계측기로 결정 했다. 세포 이중 제외 유전자 펄스 영역 대 유전자 펄스 피크 표시 하는 도트 플롯에 문을 했다. 세포 주기 분포 흐름 조 분석 소프트웨어(트리 스타,흐름,애쉬 랜드,또는,미국)를 사용 하 여 설명 했다.

배양 4 일째에,24 시간 동안 5-에 티닐-2′-데 옥시우리딘(에듀)으로 세포를 배양하여 세포 증식을 측정 하였다. 그 후,75%에탄올/피에 세포 트립신 화 및 고정/투과 후,에듀를 라벨링하고 클릭 잇 에듀 알렉사 플루오르 488 유세포 계측 분석 키트(인 비트로 겐)로 검출 하였다. 세포 배양한 다음 1µg/ml 의 4′,6-diamidino-2-phenylindole(dapi 에서)에서 PBS/0.1%Triton X100 37°C30min. 상기 셀리고쌍”발현 분석”(표적 1+마스크)어플리케이션은 형광 신호를 정량화하고 데이터 분석을 위해 사용되었다. 세포 다 피 핵 얼룩을 사용 하 여 확인 하 고 유전자 합성 에듀 혼합을 측정 하 여 정량화 했다.

마우스 이종 이식 모델

1.5 제 106 제 620 세포 또는 3 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 106 제 첫 번째 실험에서는 연속 3 주 동안 일주일에 두 번,두 번째 실험에서는 일주일에 세 번 주사했습니다. 종양 캘리퍼스와 수식 계산 볼륨 격주로 측정 했다:디 1 엑스 디 2 엑스 디 3/2.

Intrasplenic 간 식민 모델

에서 각 실험은 2 만 루시페라아제 표현 SW620 세포(SW620-LUC 세포)주입하고 비장에서 6~8 주 된 여성 athymic nude mice. 세포 주입 후 2 분 후에 비장을 제거 하였다. 주사 후 1 일째에,생쥐를 무작위로 10 마리의 생쥐 두 그룹으로 나누었다. 전이성 형성 및 보급을 평가하기 위해 루시페라제 발현을 루시페린 주사 후 발광 영상에 의해 모니터링 하였다. 수술 후 5 주에 마우스를 희생 했다,간 제거,사진 및 간 표면에 거시적으로 보이는 전이 계산 했다.통계 분석

통계 분석은 13.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 유전자 발현 또는 면역 조직 화학 실험을 위해 크루스 콜 월리스/던의 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석했습니다. 종양 분자 아형에 따라 전체 그룹(엔=143 환자)에서 평가 했다. 이를 위해 143 명의 환자를 중앙값 1 유전자 발현(즉,9.75)에 따라 두 그룹으로 나누었다. 카플란-마이어 방법 및 로그 순위 테스트를 사용 하 여 평가 생존 분포 간의 차이 사용 하 여 비교 했다.

쌍 티-테스트 6 체 외 실험에서 부 화의 효과 비교 하는 데 사용 되었다.

생체 내 실험에서 선형 혼합 회귀 모델을 사용하여 종양 성장과 주사 후 일수 사이의 관계를 결정했습니다. 모델의 고정 된 부분에는 이식 후 일 수와 다른 치료 그룹에 해당하는 변수가 포함되었습니다. 상호 작용 용어는 모델에 내장 된;임의의 차단 및 임의 슬로프는 계정에 시간 효과를 가지고 포함되었다. 모델의 계수는 최대 우도로 추정되었습니다. 생존율은 주사일로부터 카플란 마이어 방법을 사용하여 종양이 1500 밀리미터 3 의 부피에 도달 한 날짜까지 추정되었습니다. 생존 곡선은 로그 순위 테스트를 사용하여 비교되었습니다. 간 식민지 실험에 대 한 그룹 간의 차이 만-휘트니 유 테스트와 함께 평가 했다. 모든 실험에 대 한 차이 때 중요 한 것으로 간주 되었다 피<0.05.