:혜성 분석 절차 및 결과 설명 권장 사항

미르카 가이드라인은 혜성 분석 결과 분석 및 보고 개선(http://www.hcomet.eu/)을 목표로 에이코멧 비용 조치 구성원에 의해 작성되었습니다. 저자는 이러한 분석 실험에 대한 최소 8 년의 경험을 가진 혜성 분석 전문가입니다(저자 중 15 명은>20 년의 관련 경험을 가지고 있습니다). 우리는 인터넷 기반 설문지를 사용하여 보고 세부 사항의 중요성에 관한 저자의 의견을 샘플링했습니다(표 1;보충 데이터). 각 정보는 저자에 의해’필수’,’바람직한’또는’중요하지 않음’으로 등급이 매겨졌으며 분류에는 75%합동의 임계 값이 사용되었습니다. ‘필수정보’답글 수가 75%의 합의에 이르지 못하면’필수정보’와’바람직한 정보’답글이 합쳐지고,75%의 작성자가’필수’또는’바람직한’답글 중 하나라고 동의하면’바람직한 정보’로 분류된다. 표 1 에는 각 권장 사항에 대한 설명 메모가 포함되어 있습니다.

혜성의 각 단계에 대한 구체적인 미르카 권고

1 단계: 혜성 분석이 단일 세포의 현탁액을 사용하기 때문에,단일 세포로 얻어지지 않은 표본은 세포 외 기질 또는 서로에 대한 세포의 부착을 방해하기 위해 기계적으로 또는 효소 적으로 처리되어야한다. 또한,조직 내 효소 소화는 세포로부터 뉴 클레아 제를 방출함으로써 내인성 디엔테로 복구 효소의 활성으로 인해 디엔테로 병변의 제거로 이어지거나 디엔테로 손상 수준을 증가시킬 수 있다. 균질화 버퍼의 조성은’바람직한’정보이며,특히 유전자의 완전성을 보존하기 위해 필요한 성분(예:에틸렌 디아민 테트라 아세트산)에 관한 것이다. 단일 셀 현 탁 액,조직의 균질화를 포함 하 여 격리에 대 한 절차에 대 한 설명’바람직한’기사에 보고 하는 정보로 간주 됩니다.

혈액 샘플은 종종 인간의 생체 모니터링 연구에 사용됩니다. 혈액 세포의 이기종 인구를 나타냅니다,때문에 세포 인구에 대 한 자세한 정보는 출판물에’필수’. 텍스트는 표본이 전혈(적혈구 포함),백혈구,단핵 혈액 세포 또는 세포의 하위 집합(예:림프구)인지 여부를 정확하게 설명해야합니다. 또한 실험을 반복하는 사람들을 위해 정맥 천자 절차,항응고제 유형 및 후속 세포 분리 방법(즉,원심 분리 및 세척 단계)에 대한 정보를 포함하는 것이 도움이 될 수 있으므로’바람직한’정보로 분류됩니다. 세포 또는 조직이 냉동 보존되어 있는 경우의 저장 조건에 대한 정보 및 냉동 방법(예:드라이아이스나 액체 질소에서의 스냅 냉동 또는 느린 냉동 절차)및 해동 절차는 보고해야 할’필수’정보로 간주됩니다.

단계 1 비: 시험관 내 유전자 복구 분석실험을 위한 기질 세포의 제조

모든 진핵세포 유형은 시험관 내 유전자 복구 분석실험을 위한 기질 세포로서 사용될 수 있고,세포 유형 및 밀도는 보고할’바람직한’정보이다. 유전 독성 화합물의 유형 및 방법 보고는’필수’는 기질 세포 및 후속 세포 저장 조건에서 유전자 병 변을 유도 하는 데 사용 하는 반면 기질 세포에서 검출 될 수 있는 유전자 병 변의 총 수준(예: 또한,포름아미도피리미딘의 세포내 글리코실라제-민감성 부위들의 수는’바람직한’정보로만 간주된다.

1 단계:분석 컨트롤

이 문서에서 분석 컨트롤 참조 모든 혜성 분석 실험에 포함 된 샘플;이러한 참조 표준,내부 통제 또는 기술 제어 라고도 16,27. 분석실험 컨트롤은 일반적으로 유전자 가닥 파괴 에이전트(예를 들어)에 노출 된 세포의 단일 배치에서 냉동 보존 된 분취 또한,전리 방사선,과산화수소 또는 메틸 메탄 술포 네이트)또는 특정 유형의 디 유전자 병변을 유발하는 치료(예:감광제 로 19-8022 플러스 라이트 또는 브롬산 칼륨 처리,디 유전자 산화를 유도하기 위해). 표준 알칼리성 혜성 분석실험 및 효소 변경한 혜성 분석실험을 위한 다른 분석실험 통제가 있습니다. 이러한 효소에 민감한 사이트의 동적 범위를 감소로 효소 수정된 분석실험에 사용 되는 화합물,유전자 가닥 나누기를 생성 하지 해야 합니다. 생체 모니터링 연구뿐만 아니라 횡단면,중재 적 및 임상 연구에서 노출되지 않은 세포를 분석 대조군으로 사용할 수 있습니다. 그것은’필수’분석 컨트롤 및 분석 변화(표준 편차)표준 및 효소 수정 혜성 분석 결과에서 손상의 수준을 보고.

체외 유전자 복구 분석실험은 분석실험 통제 그 자체 보다는 오히려 수선 활동의 계산에서 또한 이용되는 내부 실험적인 통제를 사용합니다. (즉,’배경 제어’);(2)노출된 세포 반응 버퍼,손상 에이전트(즉,’치료 제어’)와 처리에서 발생 하는 어떤 비특이적 인 유전자 가닥 나누기 또는 비 염기 사이트의 수준을 공개 하 여 배양 하는 반응 버퍼,노출된 세포 손상 에이전트(즉,’치료 제어’)와 함께 배양에서 뉴클레오이드의 복구 절 개 수준을 보고 하는’필수’정보입니다.; (3)샘플로부터 단백질 추출물로 배양된 비노출 기질 세포,비특이적 절개 또는 절단 활성을 확인하기 위해(즉,’특이성 제어’);및(4)효소-변형 혜성 분석실험에 대한 분석실험과 유사한 병변-특이 효소로 배양된 노출된 기질 세포(즉,’배양 반응 제어’).이 기사에서는 동물 조직의 생체 내 혜성 분석에 대한 음성 및 양성 대조군(489)에 설명 된 바와 같이 실험 그룹을 참조하십시오. 따라서 음수 및 양성 통제는 전체 실험과 관련이 있습니다. 긍정적 인 컨트롤은 혜성 분석으로 검출 된 유전자 가닥 나누기 또는 효소에 민감한 사이트를 생산하는 직접 또는 간접 작용 유전 독성 화합물을 의미한다. 효소가 수정된 혜성 분석실험에 대 한 특정 동물 조직에서 알칼리 성 혜성 분석실험(유전자 가닥 나누기 유도)에 대 한 긍정적인 컨트롤로서 목록 화합물에 해당 하는 긍정적인 컨트롤 사용할 수 있는 목록이 없습니다. 또한 건강한 사람들은 유전 독성 물질에 의도적으로 노출 될 수 없기 때문에 인간의 생체 모니터링 연구에는 긍정적 인 통제가 존재하지 않습니다. 긍정적인 컨트롤 이미 유전 독성에 세포 배양 실험에서 필수 간주 됩니다 하 고 사실상 혜성 분석을 사용 하 여 기사에서’필수’정보 될 것입니다. 그러나 동물 연구에서 실용적인 목적으로 혜성 분석 대조군에 대한 데이터(즉, 사실 부정 및 긍정적인 컨트롤에서 결과’바람직한’정보만 간주 됩니다 반면 위의 섹션에서 언급 한 샘플’단계 1 씨,분석 컨트롤’)충분 하다.

2 단계:아가로스에 세포 삽입

혜성 분석은 원래 유리 슬라이드에 아가로스의 3 개의 층을 사용하여 개발되었으며,중간 층은 세포를 포함한다. 그러나,아가로 오스의 상부 층은 필요하지 않으며,특정 절차는 하부 층(예를 들어,겔 본드 필름 분석)을 사용하지 않는다. 슬라이드 유형 및 크기(예: 겔의 가장자리 부근 세포의 비율이 증가함에 따라 겔 크기가 감소하고 겔의 가장자리에서 뉴클레오이드의 유전자가 뉴클레오이드의 유전자와 겔 22 의 중심을 향하여 다르게 이동할 수 있다. 아가로오스의 최종 농도(세포가 그 안에 내장된 상태)는 겔의 밀도에 따라 달라지기 때문에 보고하는 데’필수적’이다.

3 단계:세포의 용해

혜성 분석에서 세포를 용해시키는 몇 가지 절차가 있다. 용해 용액의 구성에 대한 정보는’필수’입니다. 특정 유형의 세포에는 추가 효소 배양 단계(예:단백질 분해 효소 케이)가 필요할 수 있으며 배양의 세부 사항도’필수’정보로보고되어야합니다. 일부 보고서는 용해 지속 시간이 특정 유형의 유전자 병변 28,29,30 의 안정성에 영향을 미칠 수 있으므로 용해 지속 시간 및 용해 용액의 온도가보고 할 수있는’바람직한’정보라고 제안합니다.

단계 4 에이: 리페어 효소 처리 효소-변형 혜성 분석실험

에서 리페어 효소의 활성을 억제할 수 있으므로,리페어 효소의 활성을 억제할 수 있으므로,리페어 효소의 처리(즉,세척 완충제의 조성,세척 횟수 및 지속 시간)사이에서 세척 단계가 수행되었는지 여부를 확인하는 것이’바람직하다’. 다른 제조자에서 효소가 핵 염기 병변으로 그들의 활동 그리고 그들의 특이성 둘 다에서 다르기 위하여 보였기 때문에,수선 효소의 근원에 관하여 정보를 중계하는 것이’근본적’이다 16. 대부분의 혜성 연구에서 적정 곡선 실험 효소 치료 31;에 대 한 최적의 조건을 식별 하기 위해 수행 됩니다. 겔에 적용되는 효소의 농도는’필수’정보입니다;단백질 농도(마그네슘/밀리람베르트)도 유용하지만,효소 단위(유/밀리람베르트)의 농도를보고하는 것이 바람직하다. 인큐베이터 유닛의 유형(예를 들어,인큐베이터,슬라이드 해자 또는 12-겔 시스템)및 인큐베이터 모드는 보고할’바람직한’정보이다. (1)효소 욕 또는 슬라이드에 드롭 및 커버슬립으로,(2)표준 2 겔 버전,12 겔 또는 다중 웰 시스템 또는(3)인큐베이터의 가습 상자,가열판 또는 가열 된 슬라이드 해자에서 배양이 수행되었는지 여부를 명시해야합니다.

단계 4 비: 단백질 추출물의 제조에 사용되는 세포의 수 또는 조직의 질량을 보고하는 것이’바람직한’반면,기질에 첨가되는 세포 또는 조직 추출물의 최종 단백질 농도를 보고하는 것은’필수적’이다. 추출 버퍼(‘바람직한’정보)의 구성은 인큐베이션 버퍼(‘필수’정보)의 구성보다 덜 중요합니다. 효소 수정 혜성 분석에 대 한 정보를 유지,그것은’바람직한’적정 실험에서 결과 보고 또는 이러한 수행 되었습니다 동일한 실험실에서 이전 연구를 참조. 젤 임베디드 기판 셀에 추가 하는 추출 물의 볼륨은’바람직한’정보. 이들은 수선 절개의 수에 영향을 미치기 때문에 잠복기의 내구 그리고 온도를 보고하는 것이’근본적’입니다. 효소 수정된 혜성 분석실험에 관해서는 인큐베이션 모드는 체 외 복구 분석실험에 대 한 보고’바람직한’정보. 인큐베이션 반응 제어(기질 세포에서 유전자 병 변의 양을 나타내는)로 사용 되는 효소의 정체성과 노출 되지 않은 기질 세포에서 유전자 복구 절 개 배경 수준에 사용 되는 버퍼의 구성에 대 한 정보는’필수’,때문에 그들은 유전자 복구 절 개 활동의 신뢰성을 입증 하는 열쇠.

단계 5:알칼리성 처리

고 알칼리성 산도 용액은 유전자 가닥을 함께 유지하는 수소 결합을 방해하고 또한 특정 핵 염기 병변을 유전자 가닥 파손으로 전환시킨다. 따라서 알칼리성 처리 기간은 후속 전기 영동 32,33,34 에서 유전자 이동 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 알칼리 용액의 조성,산도,온도 및 치료 기간에 관한 특정 정보는보고 할 수있는’필수’정보입니다.단계 6:전기 영동

유전자 이동의 가장 중요한 동인은 전기 영동의 지속 시간과 전기 전위(전기 영동 탱크 플랫폼을 통한 전압 강하)입니다 35. 전기 이동법 완충기의 구성,전기 이동법의 힘(전기 이동법 탱크 플래트홈에 전압 기온변화도)및 전기 이동법의 내구가 보고된다’근본적’입니다. 따라서,전기영동 용액의 온도에 대한 정보는’필수적’이며,이는 온도를 일정하게 유지하기 위해 취해진 단계들(예를 들어,플랫폼을 냉각시키거나 완충기를 순환시키는 것)에 대한 설명을 동반할 수 있다.

단계 7: 중화

이 단계는 효율적인 염색을 보장하기 위해 슬라이드에서 과량의 알칼리성 용액을 제거하는 것을 포함한다. 중화 용액의 구성을 설명하는 것이’바람직’합니다.

단계 8:염색 및 시각화

유전자 결합 염료는 유전자에 대한 결합 친화도가 다르므로 이미지 분석 소프트웨어의 1 차 혜성 분석 기술자의 계산에 다른 영향을 미칠 수 있습니다. 염료의 종류는’필수’정보,농도’바람직한’정보 반면 염색 및 시각화 사이의 시간 이다. 현미경 램프의 다른 유형에서 빛의 강렬은 다릅니다. 또한 램프의 나이 및 혜성의 채점 중에 켜진 시간에 따라 다릅니다. 그러나,빛의 세기를 측정하고 그에 따라 유전자 이동 수준을 보정하는 표준 절차는 없다. 또한,같은 혜성은 다른 현미경 배율에서 다른 수준의 유전자 이동을 갖는 것처럼 보일 수 있다. 따라서 스코어링에 사용되는 현미경 배율을 보고하는 것이’바람직’합니다. 혜성의 대표적인 이미지(예:,보고 된 수준의 유전자 마이그레이션과 함께 마이그레이션이 거의 없거나 전혀없는 제어,중간 및 광범위한 유전자 마이그레이션).

단계 9 에이:채점 및 데이터 분석

이 단계는 기본 혜성 분석 설명자에 대한’필수’정보를보고해야합니다(예:. (예:중앙값 또는 혜성 점수의 평균). 각 젤의 각 혜성의 개별 결과를보고하는 것은’중요하지 않다’; 그들은 전체 손상 수준을 계산하기 위해 결합됩니다. 다른 이미지 분석 소프트웨어 패키지가 주요 혜성 분석 예측기를 계산하는 다른 방법을 가질 수 있다는 것을 배제 할 수 없으므로 사용 된 소프트웨어(소프트웨어 이름,제조업체,버전)를보고하는 것이’필수’입니다. 모든 기본 설명자는 그들이 무엇을 의미하는지 이해하기 위해 혜성 분석법에 대한 전문 지식이 필요하다는 제한을 공유하는 반면,보정 곡선이 생성되면(알려진 주파수에서 휴식을 유도하는 전리 방사선을 사용하여)결과는 변경되지 않은 뉴클레오티드 또는 핵 염기 쌍에 비해 상대적인 병변 주파수로 변환 될 수 있습니다. 전리 방사선을 사용 하 여 교정 곡선을 얻을 하 고 변경 되지 않은 뉴클레오티드 또는 핵 염기 쌍에 상대적인 병 변 주파수에 유전자 이동 수준을 변환 하는 절차 이전 보고 되었습니다 40. 따라서 결과를 109 개의 변경되지 않은 뉴클레오티드 또는 106 개의 핵 염기 쌍 당 병변 수준으로보고하는 것이’바람직하다’.

단계 9 비: 효소에 민감한 사이트의 계산 또는 시험 관 내 유전자 복구 분석 결과 대 한 기판 절 개 순 번호

유전자 손상의 기저 수준에 기인하는 유전자 이동과 효소 특이 적 병변은 유전 독성의 다른 메커니즘에서 기인 할 수 있으므로 효소 처리 후 유전자 손상의 총 수준 만보고하는 것은 불충분합니다. 대신,그것은’필수’효소 처리 슬라이드에서 유전자 마이그레이션의 기초 수준 차감 되었습니다 효소 민감한 사이트로 유전 독성을 보고 하는.

시험 관내 유전자 복구 분석 모든 세포 또는 조직 추출 샘플과 동일한 기질 세포를 사용 하 여,동일한 실험(즉,분석 실행)에서 각 샘플에 대 한 동시 배경 및 치료 컨트롤을 필요 하지 않습니다. 하나 이상의 기판이있을 수 있습니다(예:,염기 및 뉴클레오티드 절제 수리 활성을 모두 분석 할 때),따라서 각 유형에 대한 별도의 컨트롤이 필요합니다. 그것은’필수’기판에 복구 추출 물에 의해 그물 절 개를 보고.

단계 9:결과의 통계 분석

통계 분석은’필수’입니다. 통계 분석의 유형은 연구 설계에 따라 다르며 유전 독성학 및 생체 모니터링 41,42 에 대한 통계 테스트의 일반적인 가정을 따릅니다.