(a) Den seksuelle livssyklusen Til Chlamydomonas reinhardtii består… / Last Ned Vitenskapelig Diagram

… naturen til de genetiske stoffene som trosset Mendels lov. Omfattende studier i løpet av det siste århundre, ved hjelp av en rekke teknikker, inkludert elektronmikroskopi, genetikk, molekylærbiologi og biokjemi, har avslørt at de genetiske stoffene faktisk er genomer innenfor kloroplaster og mitokondrier (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Kloroplaster (cp) og mitokondrier (mt) antas å ha oppstått fra forfedre endosymbiotiske forhold mellom kjerneceller og frie levende bakterier-henholdsvis cyanobakterier og alfa – lilla bakterier. De inneholder sine egne genomer, som antagelig er rester fra deres forfedre (Gray 1992). I dag vet vi at cp-og mt-gener overføres til avkommet utelukkende fra moderens foreldre i de forskjellige taxa av høyere planter, bregner, moser, alger (Kuroiwa 1991), sopp (Mitchell Og Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), og dyr (Hutchison et al. 1974), inkludert mennesker. Uniparental arv av cp / mt genomer ble lenge antatt å være et passivt utfall basert på at egg inneholder flere antall organeller, mens mannlige gameter i beste fall bare bidrar med noen få (Gyllensten et al. 1991). Imidlertid er prosessen med uniparental arv sannsynligvis mer dynamisk. Et klassisk og slående eksempel ville være forekomsten av ikke-Mendelsk arv i de unicellulære grønne alger, Chlamydomonas reinhardtii, som produserer gameter av identiske størrelser (isogamous) (sager 1954). Livssyklusen Til C.reinhardtii er utsøkt enkel. Det er to parringstyper Av c. reinhardtii, parringstype pluss (mt+) og parringstype minus (mt), kontrollert av en enkelt kompleks parringstype loci på koblingsgruppe VI (Ferris et al . 2002). C. reinhardtii gjennomgår en seksuell livssyklus, som inkluderer definerte stadier av differensiering (Figur 1). Vegetative celler skiller seg til gameter under betingelser av nitrogen sult og lysbestråling (Pan et al. 1996). Innen minutter av å bli blandet, gameter av motsatte parring typer holder seg til hverandre ved sin flagella og sikring for å danne zygoter. Etter en obligatorisk hvileperiode gjennomgår zygoten meiose og spiring for å produsere fire haploide avkom. Mer enn 90% av avkommet som dannes arver kloroplast (cp) egenskaper, fortrinnsvis fra mt + foreldre, et fenomen først beskrevet mer enn 50 år siden (Sager 1954). Sager beskrev arvemønstrene til TO UV-induserte mutasjoner, sr1 og sr2 . Sr1-mutasjonen gir resistens mot lave nivåer av antibiotisk streptomycin, og sr2-mutasjonen gir resistens mot høye nivåer av streptomycin. Når sr1 ble krysset over til en streptomycin sensitiv stamme, ble lave nivåer av streptomycin resistens arvet, etter Mendels lov. I kontrast, da en mt+ – forelder med sr2-mutasjonen ble krysset til en sensitiv mt-forelder, var alle de meiotiske avkommet resistente mot høye nivåer av streptomycin. I det gjensidige korset var det meiotiske avkom alle streptomycin sensitive (sager 1954). I 1962 kom bevis for eksistensen av cpDNA fra lys og elektronmikroskopisk arbeid Av Ris Og Plaut (Ris And Plaut 1962). Bare ett år senere beskrev Sager Og Ishida isoleringen av cpDNA ved cesiumklorid (CsCl) tetthetsgradientsentrifugering (Sager og Ishida 1963). I 1989 ble sr2-mutasjonen vist å lokalisere i rps12-genet av cp-genomet (Liu et al. 1989). I 1972 viste en biokjemisk studie at mengden mt-cpDNA redusert i forhold til mt + cpDNA, 6-24 h etter parring (Sager og Lane 1972). DNA fra mt + og mt – gameter ble merket med enten 14 N-eller 15 NH 4 Cl, Og CsCl tetthet gradient sentrifugering ble brukt til å overvåke skjebnen til kjernefysisk DNA og cpDNA i 6-og 24-h zygoter. Seks timer i zygote utvikling, signalet representerer mt-cpDNA var klart lavere enn mt + cpDNA, indikerer en fortrinnsrett reduksjon av mt-cpDNA i forhold til mt + cpDNA. I 1980, Den første molekylære bevis for fortrinnsrett reduksjon av mt – cpDNA ble gitt Av Grant et al. (Grant et al. 1980). Forfatterne overvåket oppførselen til mt + og mt-cpDNA, og utnyttet restriksjonsfragmentlengdepolymorfismer (RFLPs), i En c. reinhardtii mutantstamme ac-u-g-23 som bærer to små slettinger i kloroplast-DNA. Forfatterne fant at både slettingene i cpDNA og den ikke-fotosyntetiske fenotypen var uniparentalt arvet. 203-kb kloroplast genomet Av C. reinhardtii (Maul et al. 2002) er til stede på ~80-100 kopier per celle, og er organisert i 5-10 DNA-proteinkomplekser, som kalles kloroplast nukleoider (Kuroiwa et al. 1981). I 1982 Ble Kuroiwa et al. fant AT dapi (dsdna spesifikk fluorokrom, 4′,6-diamidino-2-fenylindol)-farget mt – cp nukleoider forsvant fortrinnsvis i unge zygoter innen 50 min av parring (Kuroiwa et al. 1982). I 1999 ble fortrinnsforsinkelsen av mt – cp-nukleoider observert i en levende zygote ved BRUK AV SYBR Green I (dsDNA-spesifikk fluorokrom som kan gjennomsyre i levende celler) (Figur 1) (Nishimura et al. 1999). Tolkningen av dette dramatiske fenomenet var imidlertid kontroversielt fordi preferanseforsinkelsen av fluorescerende mt – cp-nukleoider skjedde godt før DNA-reduksjon ble oppdaget ved biokjemiske eller molekylære biologiske metoder (6-24 timer etter parring) (Sager and Lane 1972). To primære muligheter ble foreslått for å forklare dette. En mulighet var at oppløsningen av cp nukleoider kan føre til spredning av cpDNA molekyler, og den andre muligheten var at den raske fordøyelsen av cpDNA molekyler kan føre til forsvinningen av cpDNA nukleoider. Et problem med å ta opp dette spørsmålet er at parringsreaksjonen utføres ved hjelp av millioner av mt + og mt-gameter (Figur 2). Cellepopulasjonen er uunngåelig en heterogen blanding av celler, som unmated mt + og mt-gameter, zygoter med eller uten mt – cp nukleoider, og eksepsjonelle meitotiske zygoter (1~5%) som ikke danner meitotiske zygoter (Ebersold 1967). Generelt krever molekylære og biokjemiske metoder store mengder homogene prøver for presise analyser, og enhver heterogenitet i prøvene vil forvirre resultatene. Med andre ord vil “personlighetene” til individuelle celler eller organeller i en befolkning bli fortynnet og mest sannsynlig tapt i analyseprosessen. På den annen side kan mikroskopi avsløre “personlighetene” på morfologisk nivå, men ikke på molekylært nivå. For å studere tilstanden til cpDNA-molekyler under forsvinden av mt – cp-nukleoider var det nødvendig å samle zygoter basert på nærvær eller fravær av mt-cp-nukleoider, og å analysere de enkelte zygoter ved hjelp av molekylærbiologiske teknikker. For å oppnå dette ble optiske pinsetter ansatt(Figur 3). Bruk av optisk pinsett er en ny teknikk for å manipulere levende celler eller organeller under direkte mikroskopisk observasjon (Ashkin et al . 1987). I denne studien ble en enkelt zygote med eller uten cp-nukleoider samlet ved hjelp av optiske pinsett, og tilstedeværelsen eller fraværet av mt – cpDNA-molekyler ble bestemt ved nestet PCR-analyse. De individuelle skjebnene til mt + og mt – zygotisk cpDNA ble fulgt separat ved hjelp av en kloroplast transformant LO3c, som har bakteriegenet aadA (aminoglykosidadenyltransferase). De enkle zygotene som ble oppnådd med de optiske pincettene, ble utsatt for svært sensitiv nestet PCR-analyse for aadA (Figur 4) (Nishimura et al. 1999). Når L03c mt + gameter ble krysset med villtype mt-gameter, ble aadA gensekvenser detektert i alle zygotene som ble undersøkt. Tvert imot, da L03c mt – gametene ble krysset med villtype-gameter, ble aadA-sekvensene bare forsterket i yngre zygoter (10 og 30 min etter zygotformasjon). Etter at de fluorescerende mt-cp-nukleoidene forsvant, ble aadA-sekvensene ikke lenger detektert i zygotene (90 og 120 min etter zygotdannelse). Disse resultatene indikerer at mt-cpDNA-molekylene blir fullstendig fordøyd i 10 min, hvor mt-cp-nukleoider forsvinner, og at minst en svært effektiv nuklease aktiveres i mt – kloroplast like etter zygotdannelse. Denne aktive fordøyelsen av mt-cpDNA er trolig grunnlaget for mors arv av cpDNA. Den enkleste modellen for uniparental arv av cpDNA er at prosessen består av to forskjellige hendelser som sannsynligvis vil oppstå på forskjellige stadier av livssyklusen: en “beskyttelse” av mt+ cpDNA, kanskje under gametogenese, og en “ødelegger” av ubeskyttet mt – cpDNA under tidlig zygote utvikling. A) Begrensning-Metylering hypotese I 1972, sager og kolleger foreslått at mt-cpDNA ble fordøyd av virkningen av begrensning enzymer, mens mt + cpDNA ble beskyttet av metylering-en modell analogt med bakteriell begrensning-metylering system (Sager og Lane 1972). Sager og kolleger samlet raskt overbevisende bevis som viser en økning i metyleringsnivået for mt + cpDNA, som ble påvist 7 h etter parring (Burton et al . 1979; Royer Og Sager 1979; Sano et al. 1980). Videre er rensingen av mt + gametespesifikke DNA-metyltransferaser, med molekylvekt på 60 kDa og 20 kDa, rapportert (Sano et al. 1981). Denne mt + gametespesifikke metyleringshendelsen var tilsynelatende reversibel, som forventet for beskyttelse (Sano et al. 1984). Genet for kloroplast-resident DNA-metyltransferase ble endelig identifisert i 2002, og dets mt+ gametespesifikke uttrykk og kloroplastlokalisering ble bekreftet (Nishiyama et al . 2002). På den annen side har en rekke papirer fra uavhengige grupper senere hevdet at metylering av mt + cpDNA ikke kunne forklare beskyttelse tilstrekkelig. Bolen et al. isolert en nukleær mutant me1 som konstitutivt metylerer cpDNA på et høyere nivå i både mt + og mt – celler (Bolen et al. 1982). Når me1 gameter ble brukt for kors, normale uniparental arv mønstre ble observert, inkonsekvent med …