Alpha Cetsa Kunnskapsbase

• CETSA®
• Mål / Prøvetyper
• CETSA® Analysebetingelser
• Alfa CETSA® Immunanalyser
• CETSA® Dataanalyse Og Tolkning

Ansvarsfraskrivelse: Kun Til forskningsbruk. CETSA® er et registrert varemerke for Pelago Bioscience AB. Vær oppmerksom på at et gyldig cetsa® – abonnement er nødvendig for bruk av utstyr.

selve metoden FOR cetsa®

Q: Hva ER CETSA®?

A : Den Cellulære Termiske Skiftanalysen er en metode som tillater kvantifisering av en forbindelses Målengasjement (TE) i levende celler eller i forstyrrede celler. CETSA® – analyseprinsippet er basert på endringen i termisk denatureringsprofil av målproteinet som oppstår etter binding av en forbindelse. Cetsa® – analysen utføres ved å inkubere cellene med testforbindelsen, etterfulgt av oppvarming av de sammensatte behandlede cellene, og deretter ved å måle det gjenværende oppløselige målproteinet.

Q: Hva Er Termisk Skift

A: Ved oppvarming vil et protein møte en temperatur der den denaturerer (noen ganger referert til som smeltepunktet). Denne smeltetemperaturen er en fysisk egenskap og en konstant for et gitt sett med forhold (pH, trykk, salter). Forbindelser som interagerer med et protein vil endre smeltetemperaturen (termisk skift). For et gitt bindingssted i et protein kan størrelsen på det termiske skiftet måles ved forskjellige sammensatte konsentrasjoner (dose-respons), OG EC50-verdiene avledet fra slike kurver kan brukes til å etablere en rangorden av potens av en serie forbindelser, som direkte korrelerer med rangorden av affinitet av forbindelsene . Det finnes flere varianter på In vitro Termisk Skift analyse, men nøkkelen teknikken ble først beskrevet Av Semisotnov et al. (1991). I denne metoden eksponerer smeltende og utfoldende protein hydrofobe overflater som gjør AT SYPRO orange kan binde seg. Dette fargestoffer fluorescens er slukket i vann, slik at bindingen til disse hydrofobe overflater reverserer dette og forårsaker fluorescens til topp når proteinet er fullt utfoldet. Denne Typen Termisk Skiftanalyse kan bare brukes på høyrensede proteiner, og for arter med lav overflod kan dette bety at et overuttrykkssystem er nødvendig for å generere tilstrekkelige mengder.

Termofluor – temperaturfølsomt fargesystem (Med Sypro Orange)

Differensialskanning fluorimetri (DSF) – alternative fargebaserte metoder

Kvantifiserende PCR-systemer (F. Eks. : disse brukes til å levere oppvarmingshendelsen og kan måle fluorescensendringer

Nanotemper-er et selskap som produserer dedikert instrument som oppvarmer prøven og måler fluorescensen. Det gir bedre ytelse enn de tilpassede PCR-systemene.

Spørsmål: Hvorfor Er Måleinvolvering Viktig?

A: i fravær av bekreftelse på at en forbindelse faktisk samhandler med ønsket mål, kan stoffutviklere miste verdifull tid og ressurser som beveger seg i feil retning. Av den grunn har bekreftelse av en forbindelses Målengasjement lenge vært ansett som viktig i narkotikaoppdagelse. Slike analyser muliggjør direkte sammenligninger av en forbindelses affinitet for at målet skal gjøres, som sådan er det et viktig tiltak for å velge hvilke forbindelser som skal gå videre i alle stadier av blygenerering og optimalisering. Fordi Målengasjement kan korreleres med affinitet, gjør det mulig for forskere å velge forbindelser som har de høyeste affinitetsverdiene. Som sådan er det et ekstremt nyttig tiltak for å sikre riktig sammensatt prioritering i hvert trinn av narkotikaoppdagelsesprosessen.

Spørsmål: hvordan skiller CETSA® seg fra andre Teknologier for Termisk Skiftanalyse?

A: Ved SIDEN AV CETSA ® finnes det mange metoder for å vurdere Målengasjement(F. eks. Overflateplasmonresonans, Fluorescenspolarisering og Termisk Skift). Imidlertid er alle disse metodene avhengige av at renset protein er tilgjengelig og kun kan brukes in vitro, noe som betyr at de avledede affinitetsverdiene kanskje ikke er prediktive for faktisk affinitet eller bindingspotensial i levende celler. Å kunne kjøre Termiske Skiftanalyser i en relevant cellulær sammenheng, hvor proteinet er i sitt opprinnelige miljø, i nærvær av dets naturlige partnerproteiner, med fysiologiske konsentrasjoner av dets kofaktorer og substrater, gir mye mer relevante data, som bedre vil oversette til dyremodeller og kliniske studier.

Mens Den Cellulære Termiske Skiftanalysen er en metode basert på det samme biofysiske prinsippet som standard Termiske skiftanalyser (dvs.at spesifikke proteiner vil denaturere ved en angitt temperatur), måler den ikke direkte den spesifikke temperaturen for utfolding, men stoler i stedet på det faktum at tilstedeværelsen av en forbindelse på proteinet vil påvirke mengden løselig protein tilstede etter oppvarming til en angitt temperatur. SOM sådan er CETSA® i hovedsak en total proteinanalyse utført etter en bestemt oppvarmingshendelse. Forbindelser med ulike målengasjementspotensialer vil endre de relative mengdene protein som overlever oppvarmingshendelsen. Fordi analysen måler dette restproteinet, i stedet for selve smeltehendelsen, kan det brukes på mer komplekse in vivo-systemer som celler og lysater (og i NOEN cetsa® formater selv fast vev). I TILLEGG kan CETSA® identifisere forbindelser som destabiliserer et protein (dvs.reduserer smeltetemperaturen), dette er mindre rett frem med de andre termiske skiftmetodene.

Q: Hvordan Er Alpha CETSA® forskjellig fra Andre Cellulære Termiske Skiftanalyseteknologier eller Andre Cellulære Målintervallanalyser?

A: SOM nevnt ovenfor er CETSA® i utgangspunktet en total proteinanalyse utført etter varmesjokk. Alpha CETSA® bruker et dobbelt antistoff nærhet basert deteksjonssystem. Andre metoder unngå bruk av et antistoff basert system ved å modifisere målet protein:

• Promega nanoluciferase thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc Luciferase Smeltet sammen med målproteinet (rekombinant uttrykt protein); Når proteinmålet med Nanoluc-enzymet tag aggregater, vil luciferase-signalet reduseres.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay: Luciferase Fusion Tag kombinert med merkede tracer forbindelser som, når i umiddelbar nærhet til luciferase vil føre Til Bioluminescens Resonans Energioverføring (BRET). Sammensatt binding i samme lomme vil forskyve sporstoffet og BRET signalet vil avta. Dette er Ikke en varmesjokkmetode.
• DiscoverX InCELL Pulse: Basert På Enzymfragment Complementation (EFC) teknologi : målproteinet smeltes sammen med et lite enzymdonorfragment av β-galaktosidase (β-gal). Et ekstra reporterprotein vil binde seg til dette fragmentet for å rekonstituere et aktivt enzym, som vil hydrolysere et substrat og generere et kjemiluminescerende signal som tillater kvantifisering av proteinoverskudd. Etter varmenaturering vil proteinet aggregere og begrense tilgangen til den større luciferasekomponenten til sin partner på proteinmålet.

hovedforskjellen mellom disse systemene for ” rekombinant CETSA® “eller” rekombinant target engagement ” og Alpha CETSA®, er at de ikke kan brukes på innfødte og umodifiserte celler. Dette har en rekke negative konsekvenser:

1. mens kostnadene ved å utvikle en ny antistoff par og den påfølgende per brønn kostnader kan være høyere enn bare å transfisere en enkelt celle linje, er det sannsynlig at noen funn programmet vil ønske å bli testet med en rekke modell cellelinjer, hver transfeksjon kommer med sine egne kostnader og kloning ut de påfølgende cellelinjer vil ta flere uker.
2. Generering av et merket protein vil alltid ha fysiologiske konsekvenser på cellen, og det merkede proteinet kan være (i) overuttrykt (feil støkiometri vs. partnere), (ii) ikke plassert i det riktige cellulære rommet eller (iii) ikke assosiert med viktige partnerproteiner og (iv) kan ha en annen smelteadferd enn det opprinnelige proteinet. Det betyr at den tilsynelatende effekten av en forbindelse kanskje ikke gjenspeiler dens virkelige oppførsel i pasientens vev. Disse problemene kan forstørres i et midlertidig transfeksjonssystem.
3. Luciferasehemmere kan resultere i falske positive treff.
4. i senere stadier av blyoptimalisering når mer komplekse og fysiologisk mer relevante cellulære modeller (primære, innfødte cellelinjer og vev) kreves, er taggede proteintilnærminger ganske enkelt ikke anvendelige.

Spørsmål: Hvilken informasjon leverer EN cetsa® – analyse?

A: CETSA® gir et unikt mål på en forbindelse ‘på målet tilstedeværelse’ og kan betraktes som mål belegg. Denne belegget vil bli påvirket av både forbindelsens evne til å engasjere målet og forbindelsens evne til å være tilstede på riktig sted (dvs. har den riktig oppløselighet, permeabilitet, metabolsk stabilitet og tilgjengelighet i riktig cellekammer). Ikke-cellulære Mål Engasjement analyser tilby tiltak av affinitet som korrelerer bare med protein atferd i svært kunstige miljøer ofte ved hjelp av renset rekombinant uttrykt mål proteiner.

Spørsmål: KAN CETSA® brukes TIL SAR-analysestudier?

A: DET er ingen publiserte eksempler ennå HVOR CETSA® har blitt brukt til sammensatt optimalisering. Imidlertid ble potensialet OG anvendeligheten AV CETSA® som skal brukes TIL SAR-analyse og hitbekreftelse tydelig demonstrert Av Shaw et al. ved sammenligning av data FRA CETSA® – analysen med vanlig brukte biokjemiske og cellebaserte analysedata (Shaw et al. 2018 SLA-Funn 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). Publikasjonen demonstrerer merverdien AV CETSA® for screening, hitbekreftelse og SAR-generasjon for to proteinmål: B-Raf og PARP1.

Mål/Utvalgstyper

Spørsmål: Hvor mange mål har blitt validert I CETSA® så langt?

A: I CETSA® ht (de fleste Er Alpha CETSA® , noen bruker HTRF) har mer enn 30 mål blitt validert, inkludert mål med lokalisering av nukleær, mitokondriell, cytoplasmisk og plasmamembran.

Mer enn 100 mål har blitt validert så langt I CETSA® Classic (Western Blot basert deteksjon).

CETSA® M/S genererer informasjon for 6000 til 7000 mål samtidig.

Spørsmål: Kan alle målproteiner testes I CETSA®?

R: noen mål er “blinde” I CETSA®, dvs . sammensatt binding vil ikke endre deres termiske stabilitet. Dette kan skje når proteinet har flere domener, og forbindelsen bare er bindende til ett domene, og hvis stabilisering av dette enkeltdomenet ikke globalt påvirker den termiske stabiliteten til hele proteinet. Det er noen proteiner som ikke smelter i typisk temperaturområde som brukes I cetsa® eksperimenter.

Pelago har tilgang til en stor database med termiske stabilitetsdata fra prosjekter med massespektrometrisk avlesning (CETSA® MS), og denne informasjonen tas i betraktning når Pelago vurderer” CETSA® bility ” av et proteinmål før det utvikles En Alpha CETSA® – analyse. Ta kontakt Med Pelago for å be om slik informasjon.

Q: er GPCRs mottagelig FOR CETSA® ?

A: Noen få eksempler på Gpcr er testet I CETSA® . I en nylig publikasjon fra Astra Zeneca (Kawatkar Et al Chem Biology 2019) BLE CETSA® Classics-analyser etablert for et sett med membranbundne proteiner, inkludert ET gpcr-proteinmål. En potensiell utfordring MED CETSA® på GPCRs kan være begrenset tilgjengelighet av antistoffer for deteksjon. I tillegg kan integrert membranlokalisering Av GPRCs føre til uforutsigbar smelteadferd.

Spørsmål: Hvilke typer prøver kan testes I CETSA®?

A : DET finnes eksempler PÅ CETSA® – analyser som bruker mange forskjellige typer matriser, inkludert immortaliserte cellelinjer, primærceller, ips-celler, pasientavledede Pbmcer, sfæroider, nukleære fraksjoner fra dyrkede celler, ex-vivo behandlet vev, vev fra in vivo dyreforsøk, bakterier, gjær, sebrafisk og insekter.

Spørsmål: kan prøvene fryses etter oppvarmingstrinnet?

A: Dette er mulig, men dette krever en sak-til-sak validering som fryseprosessen kan denaturere noen proteiner.

Spørsmål: cellene mine trenger kulturplatebelegg med noen proteiner (f. eks. kollagen eller Matrigel); er spesiell forsiktighet nødvendig for å unngå prøvepreparering?

A: Vi har ikke møtt noen problemer med celler dyrket på belagte plater.

Cetsa® Analyseforhold

Spørsmål: hva er De typiske Alfa-cetsa® analyseoptimaliseringspoeng?

A: hvis du starter fra bunnen av, må immunoassay utvikles og optimaliseres først. Det er viktig og verdt å investere i å utvikle en svært sensitiv Alfa-analyse, da det vil tillate å redusere celletallet per brønn som trengs i CETSA® – analysen. FORDI CETSA® – analysen ødelegger en del av proteinet som må påvises, er det vanligvis behov for flere celler/brønner i EN cetsa® – analyse sammenlignet med andre cellebaserte analyser. Vennligst se PerkinElmer guider for alpha analyse utvikling for hvordan du går frem og for nyttige tips, OG TIL CETSA® verktøykasse manualer hvis du bruker verktøykassen (anti mouse Ig X anti rabbit ig perler) tilnærming.

deretter INKLUDERER CETSA® analyseoptimaliseringspoeng:

• titrering Av Celletetthet
• Valg av cellelysebuffer
• Inkubasjonstid for celler med testforbindelsen
• Temperatur for inkubasjon av celler med testforbindelsen
• Etablering av smelte-og skiftkurver
• Valg av temperatur for isotermiske dose-responsforsøk
• arbeidsflyt og automatiseringsinnstillinger

spørsmål: hvorfor leveres forskjellige cetsa® cellelysebuffere og hva er virkningen av å bruke forskjellige Cellelysebuffere?

A: Lysisbufferen er viktig for flere aspekter av analysen. Dens rolle er flere: lysing cellene og potensielt frigjøre målproteinet fra partnerproteiner som kan forstyrre antistoffgjenkjenning, for å gjøre målet tilgjengelig for deteksjon av antistoffene; stabilisere målproteinet for å gjøre analysen stabil; unngå eller minimere potensiell epiturbance effekt; å gi de riktige fysisk-kjemiske forholdene (pH, ionisk styrke og natur av salter, vaskemiddeltype og konsentrasjon,…) for immunoassayet, … som forskjellige immunoassays kan ha forskjellige optimale forhold, og som forskjellige proteinmål, og forskjellige celletyper kan ha forskjellige krav til optimal analyseytelse, gjør vi 5 forskjellige cellelysebuffere tilgjengelige. Disse gir en rekke celle lysis forhold. Dette betyr imidlertid ikke at ytterligere komponenter kan tilsettes i spesielle tilfeller, som ekstra vaskemiddeltyper, for å forbedre ytterligere analyseytelse.

Spørsmål: Finnes det proteasehemmere i cetsa® cellelysebuffere?

A: CETSA® Cellelysebuffere 1, 4 og 5 inneholder noen divalente kationer, som forventes å hemme proteaser som krever slike divalente kationer for deres aktivitet (F.Eks. Matriksmetalloproteinaser). Utenom dette er ingen andre proteasehemmere inkludert I CETSA® cellelysebuffere, da disse vanligvis ikke er nødvendige for Utførelse Av Alfa CETSA® – analyser. Men for spesifikke celletyper eller vevsprøver, kan det være lurt å legge til typiske proteinasehemmere, for eksempel leupeptin.

Spørsmål: hva er de typiske smeltetemperaturene?

a: smeltetemperaturen (Tm) er definert som temperaturen der halvparten av målproteinpopulasjonen har blitt denaturert (dvs.I Alpha CETSA® hvor halvparten av Alfasignalet har gått tapt). Avhengig av målet er smeltetemperaturen oftest mellom 40°C og 60°C, med en gjennomsnittlig smeltetemperatur på 52°C. noen proteiner, som membranassosierte proteiner, er vanligvis mer stabile og kan ha høyere smeltetemperatur. Cetsa® analysedata FOR proteiner med en smeltetemperatur over 65°C kan påvirkes av det faktum at membranpermeabiliteten og celleintegriteten forstyrres når cellene varmes opp, og dermed påvirker analysens fysiologiske betydning.

etter vår erfaring er smeltetemperaturen målspesifikk og avhengig av analysematrisen og lysisbufferen som brukes.

Spørsmål: forventes Tm å være den samme når du arbeider med intakte celler og forstyrrede celler?

A: ikke nødvendigvis, som når forstyrre celler, protein-protein interaksjoner som stabiliserer proteiner kan gå tapt, noe som kan føre til en endret smeltetemperatur i forhold til intakte celler. For et eksempel henvises Det til Alfa CETSA® MEK1-analysedata.

Spørsmål: hvilken oppvarmingstemperatur bør jeg velge for sammensatt testing?

A: For stabiliserende forbindelser anbefales det å velge den laveste temperaturen med det største analysevinduet, da det forventes å gi den mest sensitive analysen (lavere EC50-verdier). For destabiliserende forbindelser anbefales det å velge den høyeste temperaturen med det største analysevinduet. Temperaturer over 65°C kan ha innvirkning på cellulær permeabilitet og redusere betydningen av dataene.

Q: Bør jeg forvente den samme smeltetemperaturen I Cetsa® Classic (Western Blot) og Alpha CETSA®?

A: Ikke nødvendigvis: den tilsynelatende smeltetemperaturen kan variere mellom begge metodene, fordi deteksjonsmetodene er forskjellige.

Spørsmål: er det viktig å ha streng kontroll over prøveoppvarmingstider?

A: ja dette er ekstremt viktig å kontrollere, da lengre oppvarmingstider kan føre til riktig skifte av dose-responskurven (se nedenfor kommentarene om oppholdstid). Standard oppvarmingstid er 3 minutter.

Forbindelser med kort oppholdstid (dvs. høy dissosiasjonsrate konstant koffers; oppholdstid T er lik 1 / koffers) vil dissociere raskere fra målet når det er oppvarmet, sammenlignet med forbindelser som har lang oppholdstid. DERFOR FORVENTES EC50-eller ITDRF50-verdien å øke med økende oppvarmingstider. For flere forklaringer PÅ cetsa®-teorien, se Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbä T. (2018) Kvantitativ Tolkning Av Intracellulær Legemiddelbinding Og Kinetikk Ved Bruk av Cellulær Termisk Skiftanalyse. Biokjemi 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. I teorien, påvisning av ulike forbindelser oppholdstid på målet, ved varierende oppvarmingstid kan være mulig, men det er ingen publiserte rapporter ennå tilgjengelig om dette har blitt gjort.

Q: håndboken instruerer å enten kjøle seg på is, eller i 3 min ved 25°C etter varmesjokk. Er dette kjøletrinnet viktig, og er det viktig å ha streng kontroll over kjøletiden?

A: Kjøling av prøven sikrer raskt at varmesjokkfasen er godt kontrollert. Bare å la temperaturene avkjøles uten hjelp, vil sikkert produsere forskjellige kjølehastigheter i forskjellige brønner og påvirke mengden varmesjokk som leveres til systemet. Kjølefasen er ikke så kritisk som oppvarmingsfasen, men bør gjennomføres raskt og konsekvent.

Spørsmål: Kan Jeg bruke PerkinElmer “Biomarker” og “SureFire” (ikke-cetsa® ) sett til å utføre EN cetsa® analyse?

A: i teorien kan enhver total proteinanalyse være egnet for BRUK I EN cetsa® – protokoll, selv om hvert system må optimaliseres og valideres. CETSA® – metoden er imidlertid patentert og tillatelse vil være nødvendig fra Pelago Bioscience. Videre er bare bruk av de angitte målet kits støttes Av PerkinElmer. Bruk av tool box kit støttes Av Pelago Bioscience og er kun tilgjengelig for lisensinnehavere.

Spørsmål: Er Det mulig å lese Alfa-signalet direkte fra PCR-platen som brukes til å varme opp prøvene?

R: Dette vil gi fordeler når det gjelder antall pipetteringstrinn, prøveforbruk og enkel automatisering, men muligheten for Å bruke PCR-plater for hele prosessen – fra prøvebehandling til deteksjon-er ikke demonstrert ennå. PCR-plater er ofte svært fleksible, noe som fører til ujevn signal over platen, eller har ikke de riktige dimensjonene for å tillate at de håndteres av platelesere. Godt til godt kryss-snakk kan også være et problem i SLIKE PCR-plater.

Spørsmål: kan kjemisk denaturering (f. eks. ved bruk av urea eller guanidin) brukes i stedet for varme?

A: Fordelen med å bruke temperatur for å levere varmesjokket er at det gjøres på en svært kontrollert måte som sannsynligvis vil være konstant mellom prøver, og begrenset over en velkontrollert tidsramme. En kjemisk denatureringsprosess kan fungere i et renset proteinekstrakt; men i det komplekse cellulære miljøet vil variasjon i cellevolum, bufferingskapasitet, lipidinnhold osv. sannsynligvis bety at forskjellige cellelinjer viser forskjellige denatureringsegenskaper for et gitt protein.

da denaturering (oppvarmingstid) er kritisk, kan dette være ganske vanskelig å kontrollere ved bruk av kjemisk denaturering. I tillegg kan varme påføres uten å forstyrre celler, slik at man kan teste i ekte cellulær sammenheng. Dette ville ikke være tilfelle av kjemisk denaturering, da celler måtte forstyrres for å tillate måltilgang til denatureringsmiddelet, og dermed miste intracellulære konsentrasjoner, proteinforeninger etc.. Derfor anbefaler vi ikke å erstatte varmesjokk ved kjemisk denaturering.

Alpha cetsa® Immunoassay

Q: Trenger jeg monoklonale antistoffer eller kan polyklonale antistoffer også brukes når JEG utvikler EN cetsa® – analyse?

A: både monoklonale eller polyklonale antistoffer kan brukes, avhengig av kvaliteten på antistoffene. Monoklonale antistoffer gir en fordel når det gjelder stabil reagensforsyning, som for enhver annen deteksjonsmetode ved bruk av antistoffer.

Spørsmål: når du bruker polyklonale antistoffer, vil neste parti fungere på samme måte i EN CETSA® – analyse?

A: Etter vår erfaring har vi aldri møtt en situasjon der neste parti av et polyklonalt antistoff oppførte seg annerledes i CETSA® – analysen sammenlignet med tidligere partier. CETSA® – analysen må imidlertid re-valideres med neste parti av polyclonal antistoff.

Spørsmål: Er det andre anbefalinger for antistoffvalg?

A: hvis tilgjengelig, bør antistoffer velges slik at de dekker forskjellige epitoper av målproteinet, for å maksimere sjansene for å finne et passende antistoffpar som vil fungere I Alpha CETSA® – analysen.

Antistoffpar som gir brattere kurver (høyere Bakkehelling) og mindre bakgrunn foretrekkes da de vanligvis gir et mer spesifikt signal. Lav Bakkehelling kan være tegn på evnen til et antistoffpar til å gjenkjenne det re-foldede proteinet.

Spørsmål: Er Alfa CETSA® antistoffer mot det endogene målproteinet bare eller det endogene målproteinet pluss bundet lite molekyl?

A: basert på kittene utviklet så langt, er antistoffene bare mot proteinmålet.

Q: Kan jeg forvente at deteksjonsantistoffaffiniteter skal være forskjellige mellom bundet og ubundet lite molekyl for å målrette protein?

A: Små molekyler som påvirker proteinfolding på epitopsteder, er faktisk i fare for å endre antistoffbinding. Dette fenomenet kalles “epiturbance” og kan være en begrensning av antistoffbasert-CETSA® . Epiturbance er generelt ikke observert I cetsa® Classic assay format (Western Blotting), da proteinet i dette tilfellet er fullstendig denaturert før antistoffdeteksjonstrinnet.

Spørsmål: Kan Bare IgG brukes med cetsa® verktøykasse sett?

A: Faktisk er antistoffene på anti-kanin-og anti-mus-perlene spesifikke For IgG, og vil ikke gjenkjenne andre antistoffklasser(dvs.

Spørsmål: er Det en fordel å bruke Alpha CETSA® sammenlignet MED Cetsa® Classic (Western Blotting)?

A: Ved siden av større følsomhet For Alpha CETSA® – analysen og gjennomstrømning og automatiseringshensyn, på grunn av mulige vanskeligheter med å analysere membranproteiner i CETSA® Classic-metoden, Kan Alpha CETSA® utføre bedre for slike mål, da Det ikke trenger noe separasjonstrinn.

CETSA® Dataanalyse Og Tolkning

Q: Hvilke falske positive treff kan fås i CETSA®?

A: den termiske stabiliteten til noen proteiner kan påvirkes etter sammensatt behandling, selv om de ikke er direkte bundet av testforbindelsen. Disse indirekte effektene kan være et resultat av for eksempel proteinfosforylering, proteinrekruttering av et partnerprotein, eller fra generell endring av Redoks-tilstanden til cellen. Kjøring AV cetsa® – analysen parallelt på intakte celler og på forstyrrede celler kan skille mellom direkte og indirekte effekter, da slike indirekte effekter ikke forventes når cellene forstyrres og metabolske prosesser stoppes.

intereferanse Av Sammensatte analyser kan forekomme I Alpha CETSA® siden forbindelsene er tilstede i deteksjonstrinnet ved en relativt høy konsentrasjon. Dette kan gi misvisende resultater, og det er viktig å utføre en tellerskjerm for å identifisere disse forbindelsene.

Spørsmål: Hvordan kan målet destabilisering tolkes?

A: Destabilisering kan skyldes forstyrrelsen av forbindelsesbindingen av et proteinkompleks som stabiliserte målproteinet. I vår erfaring har membranproteiner vanligvis en høyere smeltetemperatur og er ganske destabilisert enn stabilisert ved sammensatt binding. For kinaser kan det også skyldes forskyvning AV ATP. I slike tilfeller kan det være nyttig å sammenligne resultatet AV cetsa® – analyser når de utføres på intakte celler (fysiologiske ATP-konsentrasjoner) og forstyrrede celler (TAP AV ATP). For noen mål (se erbb2 Alpha Cetsa® kit manual) har vi observert at irreversible hemmere destabiliserte målet mens en reversibel hemmer stabiliserte målet.

Q: Er det en måte å unngå epiturbance effekt?

A: Tilsetning av en liten mengde vaskemiddel, som 0,01% SDS, kan forhindre epiturbance-fenomenet. En forklaring kan være at SDS gir tilgang til antistoffet selv i nærvær av forbindelsen. Noen AV cetsa® celle lysis buffer inneholder en liten MENGDE SDS og kan derfor unngå epiturbance over andre lysis buffere. Vi kan ikke utelukke at FLERE SDS kanskje må legges til i noen tilfeller.

det skal bemerkes at en slik epiturbance-effekt ikke er begrenset TIL cetsa® – analyser, men kan også forekomme i enhver immunoassay.

Spørsmål: Counter-screen / hvordan sjekke om MIN cetsa® hit er en falsk positiv?

A: I CETSA® er det en enkel metode som gjør det mulig å avgjøre om forbindelsen virker på målproteinet (de)stabilisering selv, eller forstyrrer deteksjonsmetoden: en sammenligning kan gjøres mellom (1) tilsetning av forbindelsene til cellene, deretter inkubering og varmebehandling og (2) oppvarming av cellene først og tilsetning av forbindelsen først etter. Hvis den sammensatte aktiviteten bare finnes i test 1, er den virkelig aktiv på målet. Hvis sammensatt aktivitet er funnet i 1 og 2, viser det at det på en eller annen måte forstyrrer deteksjonsteknologien (se PerkinElmer Protein-Protein interaction guide for en liste over potensielle alfa-forstyrrelser).

Spørsmål: Hvilke falske negative treff kan fås I CETSA®?

A: Hvis et stoff ikke når målet i en cellulær sammenheng, kan det virke positivt i biokjemiske analyser, og fortsatt være negativt I CETSA® . Dette er ikke et falskt negativt, men reflekterer bare det faktum at forbindelsen ikke er i stand til å få tilgang til målet under virkelige cellulære forhold, noe som er en del av metodens kraft.

Spørsmål: hvordan sammenligner cetsa® – verdier med funksjonelle analyser / er det en betydning av termoshiftamplituden?

A: Ved analyse AV cetsa® – data må man huske på at analyseprinsippet er ganske forskjellig fra typiske funksjonelle analyser, for eksempel å se på proteinfosforylering, ionkonsentrasjoner, cAMP og andre signaltransduksjonsmarkører eller fenotypisk analyse i høy innholdsscreening, og derfor må dataene tolkes tilsvarende.

amplituden til termoshift er IKKE et mål på sammensatt affinitet.

EC50-eller ITDRF50-verdiene er spesifikke for visse analyseforhold(temperatur, oppvarmingstid,…). Dette er ikke forskjellig fra funksjonelle analyser, HVOR EC50-verdier for eksempel er spesifikke for stimuleringstider.

Spørsmål: er det mulig å diskriminere antagonister mot agonister I CETSA® – analyser?

A: Normalt er Dette Ikke en informasjon som er hentet FRA cetsa® – analyser, men publikasjonen Fra Shaw et al. (2018) Vitenskapelige RAPPORTER | (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. rapporter om at bare agonister var i stand til å stabilisere androgenreseptoren i cetsa® – analysen som ble utviklet, mens antagonist ikke hadde noen direkte effekt i CETSA® – analysen, men kunne påvises som konkurrenter av effekten av agonister i CETSA® – analysen. I dette spesielle tilfellet var derfor cetsa® – analysen i stand til å diskriminere mellom androgenreseptoragonister og antagonister. Dette betyr ikke at dette er mulig for noe mål, da DET er mange eksempler hvor CETSA® – analysen direkte oppdager både agonister og antagonister.

Q: KAN CETSA® brukes til å oppdage toksisitet av en forbindelse?

A: Forbindelser som utøver noen toksisk effekt på en celle forventes å føre til endring i nivået av noen proteiner (via nedbrytning og / eller transkripsjonelle effekter) og til endringer i termostabilitet av noen proteiner (via post-translasjonelle modifikasjoner eller generell endring av Redokstilstanden til cellene). Pelago undersøker muligheten for å generere “cetsa® fingeravtrykk” som kan knyttes til ulike typer toksisitet, fra CETSA® MS data. Dette kan også generere kunnskap om mål som narkotika ikke bør treffe for å unngå slik toksisitet. Hvis et bestemt mål ser ut til å være knyttet til toksisitet, kan Bruk Av Alpha CETSA® bli en valgfri metode for legemiddelindustrien.

Spørsmål: Kan et husholdningsprotein brukes til normalisering AV cetsa® – analyser?

A: Normalisering er vanligvis ikke nødvendig I cetsa® – analyser, da den viktige utgangen av analysen er EC50-verdien. Men i noen tilfeller, for eksempel ved arbeid med vevsprøver, kan mengden materiale som er engasjert per datapunkt variere ganske betydelig, og normalisering kan da være ønsket. I Cetsa® Classic (Western blotting) BRUKES SOD1 ofte som smeltepunkt på 80°C gjør DET til en god uforanderlig referanse for ethvert mål, og da molekylvekten på 18 kDa gjør det enkelt å oppdage På Western blots. GAPDH anbefales ikke på grunn av lavere smeltetemperatur (55 °C), noe som gjør det ikke mulig å kontrollere mål med høyere smeltetemperatur.

hvis du ønsker å normalisere Alpha CETSA® – analysen, kan cofilin bli forsøkt (det er Et AlphaLISA SureFire ultra-sett for totalt cofilin, med foreløpige cetsa® data, men ikke fullt validert sett ennå)