Antistoffmålretting Av claudin-1 som en potensiell kolorektal kreftbehandling

CRC-prøver

for profilering av genuttrykk valgte vi 143 tumorprøver fra 143 pasienter inkludert i tre kohorter: den prospektive enkeltsenterstudien REGP (19 pasienter) (GSE62322), det retrospektive multisenteret studie cosival (68 pasienter) og den prospektive multisenterstudien biocolon (56 Pasienter) (Gse62080 og gse72970) . For Disse tre studiene Var Inklusjonskriteriene: histologisk påvist adenokarsinom i tykktarmen, avansert og bidimensionelt målbar tumor (stadium IV), alder mellom 18 og 75 år, og Verdens Helseorganisasjon (WHO) funksjonsstatus ≤2. Før noen behandling gjennomgikk alle pasienter kirurgi for primær tumor reseksjon eller endoskopisk biopsi.

for western blot-analyse ble 13 ekstra tumorprøver fra den prospektive enkeltsenterstudien REGP, men ikke inkludert i de 143 prøvene, brukt.

for immunhistokjemisk analyse ble vevsprøver fra 52 ekstra pasienter med CRC retrospektivt valgt fra Institute Of Cancer Research Of Montpellier pathology files bare når normale slimhinner, adenom og adenokarsinomprøver var tilgjengelige for samme pasient.

alle studier med humane vevsprøver ble godkjent av de relevante etikkomiteene, og alle deltakerne ble informert om studiens mål og metoder og undertegnet et skriftlig informert samtykke før innmelding.

Genekspresjonsanalyse

Kolonprøver (normale kolon -, primærtumor-og levermetastaseprøver for reg/P-studien, men bare primære tumorprøver FOR COSIVAL-og BIOKOLONFORSØKENE) ble samlet på operasjonstidspunktet etter en standardisert prosedyre for å oppnå HØY KVALITET RNA . Prøver ble deretter hybridisert til humant genom U133 Pluss 2.0 arrays (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

for å identifisere nye terapeutiske mål for antistoffbasert terapi i mCRC, sammenlignet vi genuttrykksprofilene for normal slimhinne (n = 17), primærtumor (n = 20) og levermetastaser (n = 19) vevsprøver.

da CRC-heterogenitet må tas i betraktning ved sammenligning av genuttrykksprofiler, ble primærtumorprøver (n = 143) klassifisert ved HJELP AV CRC-molekylære klassifikasjoner basert på genuttrykksprofiler som er foreslått av tre uavhengige grupper og den nylige konsensusklassifiseringen . Kort, De Sousa E. Melo et al. foreslått å gruppere svulster i tre klasser: CCS1( CRC med mikrosatellitt ustabilitet, MSI), CCS2 (kreft med kromosomal ustabilitet, CIN) OG CCS3 (ny subtype) . Sadanandam et al. identifisert fem molekylære subtyper, basert på cellefenotypen: Bobellignende, Transittforsterkende (TA), Enterocyt, Stamme-lignende og Inflammatorisk . Marisa et al. beskrevet seks molekylære subtyper (C1 Til C6) med følgende hovedtrekk: C1 = CIN og nedregulering av immunveier, C2 = MSI, C3 = muterte KRAS, C4 = stamcellefenotypelignende, C5 = CIN og oppregulering AV WNT-veiene, Og C6 = CIN og normallignende genuttrykksprofil . Til slutt, med utgangspunkt i seks tidligere publiserte signaturer, presenterte et internasjonalt konsortium en klassifisering med fire konsensusundertyper: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolisk (CMS3) og mesenkymal (CMS4) (for gjennomgang ). CRC-prøvefordelingen i henhold til molekylær subtype er vist I Tilleggsfil 1: Tabell S1.

Immunhistokjemi analyse

Prøver ble satt sammen i et vev mikro-array (TMA) ved hjelp av tre vev kjerner (0,6 mm diameter hver) som tidligere beskrevet . I korte trekk ble 3-µ deler av TMA de-paraffinisert og rehydrert i graderte alkoholer. Varmeindusert antigenhenting ble utført ved å inkubere tma-seksjoner I EDTA-buffer (pH 9) ved 98 °C i et vannbad i 20 min. ETTER nøytralisering av den endogene peroksidaseaktiviteten ble tma-seksjoner inkubert med et polyklonalt anti-CLDN1-antistoff (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) eller antistoffdynningsmiddel (Dako, Glostrup, Danmark) alene i 60 minutter. Primær antistoffbinding ble visualisert ved bruk av Envision® – systemet og Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Danmark). Prosentandelen AV CLDN1-positive celler og fargeintensiteten (0, ingen flekker; 1, gulaktig; 2, brun; og 3, mørk brun) ble evaluert for hvert enkelt TMA-punkt.

Western blot analyse

Tumorvevsprøver fra pasienter ble direkte slipt i lysisbuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM natriumorthovanadat, en cocktail proteasehemmer tablett for 10 ml) ved hjelp av en mikser mill® mm 300 enhet (qiagen, valencia, ca). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt Med Bradford-analysen(Pierce Coomassie Plus Protein Assay). Da ble 50 µ av totale proteiner løst av 12% SDS-SIDE og overført til nitrocellulose membraner (Whatman® Protran®, porestørrelse 0.45 µ). Ikke-spesifikke bindingssteder ble blokkert med 5% (wt/vol) nonfat melk i PBS med 0,1% (vol/ vol) Tween 20 (PBS-T) ved romtemperatur i 1 h og deretter ble membraner inkubert ved 4 °C med et polyklonalt anti-CLDN1 antistoff (JAY-8) over natten. Membraner ble deretter vasket og inkubert med passende pepperrotperoxidase-konjugert sekundært antistoff i 1 h. Åpenbaring ble utført med et kjemiluminescenssystem (Amersham Biosciences); β-tubulin-uttrykk ble brukt til normalisering.

Subcellulær proteinekstraksjon

proteinekstraksjon ble utført som tidligere beskrevet . For hver prøve ble 20-µ tykke seksjoner kuttet med et kryotom, blandet i flytende nitrogen og forsiktig malt med en mikropestel. For subcellulær proteinekstraksjon Ble ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit brukt i henhold til produsentens instruksjoner (Calbiochem). Subcellulære fraksjoner (10 µ/hver) ble lastet på 12% SDS-SIDE geler. Immunoblotting ble gjort som beskrevet ovenfor med følgende primære antistoffer: anti-CLDN1 (JAY-8),- CD71 (Invitrogen),- Histon H3 (Pierce) og-β-tubulin (Sigma T4026).

Cellelinjer

følgende humane CRC-cellelinjer ble brukt: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (en gave Fra C. Montagut, Institutt For Medisinsk Onkologi, Hospital del Mar, Barcelona, Spania), HCT116 (CCL-247), Og ls174t (atcc cl-188). FOR Å oppnå DEN CLDN1-positive SW480-cellelinjen (SW480-CLDN1) ble SW480-celler stabilt transfisert med den humane CLDN1 cDNA-klonen (Invitrogen mgc-samlingen) eller med tom vektor (pcDNA) ved hjelp av jetPRIME™ transfeksjonsreagensen (Polyplus-transfeksjon Inc.(Frankrike). CLDN1-positive kloner ble selektert av voksende transfiserte celler i nærvær av 500 µ/ml geneticin. FOR CLDN1-demping BLE SW620 transdusert med pSIREN-vektoren som inneholdt shRNA mot CLDN1 (SW620shCLDN1) eller mot luciferase (shluc, negativ kontroll). Etter 24 timer ble celler valgt med 1 µ / mL puromycin og stabile kloner ble samlet. Alle forbigående transfeksjoner ble utført ved bruk av jetPRIME™ transfeksjonsreagensen.

Produksjon av anti-CLDN1 mAb 6 F6

for antistoffproduksjon ble 6-8 uker gamle KVINNELIGE BALB/c-mus (Harlan, Gannat, Frankrike) utfordret av intra-peritoneal (i.p.) injeksjon av 4 millioner mus NIH-celler transiently transfektert MED CLDN1 cDNA (NIH-CLDN1-celler) annenhver uke (fem injeksjoner totalt). NIH-CLDN1-celler ble blandet med Komplett Freunds adjuvans (Sigma) for den første injeksjonen, og med ufullstendig Freunds adjuvans (Sigma) for de andre fire injeksjonene. En intravenøs boosterinjeksjon AV NIH-CLDN1-celler ble gitt tre måneder etter den femte immuniseringen. Tre dager senere ble miltceller fra immuniserte mus smeltet sammen med musens myelomcellelinje P3-X63-Ag.8.653 for å produsere mus hybridomer. Supernatanter fra nylig genererte kloner ble screenet av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) ved HJELP AV SW480-CLDN1 og SW480-celler (negativ kontroll). Screeningsresultatene ble bekreftet ved å utføre og ytterligere screening VED HJELP AV SW620-og SW620-shCLDN1-celler. Anti-CLDN1 hybridoma 6 F6 klonen ble valgt og klonet ved å begrense fortynning. Antistoffisotyping viste at 6 F6 var En IgG3k.

alle dyreforsøk ble utført I samsvar med de franske regjeringens retningslinjer FOR eksperimentelle dyreforsøk (avtale CEEA-LR-12052).

Radiomerking og SPECT-CT imaging

Kvinnelige athymiske nakne mus (6-8 uker gamle) ble kjøpt Fra Harlan. 6 F6 mAb ble radiomerket MED 125i (Perkin Elmer)ved den spesifikke aktiviteten på 370 MBq / mg for spect-bildebehandling med enkeltfotonemisjon, ved bruk AV Iodo-GEN (Pierce Chemical Co.) metode. Etter injeksjon av halevene med 16 MBq/50 µ 125i-merket 6 F6, ble helkropps enkeltfotonemisjonstomografi / computertomografi (SPECT/CT) tatt med et 4-hoders multipleksende NanoSPECT-kamera med flere pinhull (Bioscan Inc., Washington, USA) på ulike tidspunkter (48, 72 og 96 timer). Samtidig ble helkroppsmikro-CT-bilder anskaffet for anatomisk samregistrering med SPECT-data. Rekonstruerte SPECT-og CT-data ble visualisert og samregistrert ved Bruk Av Invivoscope®.

Klonogen analyse

Kolorektale kreftceller ble sådd i en 6-brønnplate (150, 250 eller 400 celler/brønn) og fikk feste seg ved 37 °c over natten. Deretter ble 1 ml RPMI med eller uten 6 F6 mAb (endelig konsentrasjon: 100 µ/ml) tilsatt hver brønn og celler ble dyrket i seks dager. Etter seks dager i medium uten antistoff ble plater lest ved Hjelp Av Et Celigo™ imaging cytometer og” Single colony verification ” – applikasjonen. Celigo™ cytometer Er et benchtop in situ cellular analysesystem som gir bilder av brønner ved hjelp av lysfeltbelysning (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

Etablering av tredimensjonale (3d) sfæroide kulturer

Ultra-lav vedlegg, rundbunnede 96-brønnplater (Corning Costar) ble brukt til sfæroiddannelse. SW480 -, SW480-CLDN1-eller SW620-celler ble sådd med en tetthet på 5 × 104. Celler aggregeres og fusjoneres I 3d sfæroider innen 24-72 timer. Bilder av brønner ble tatt med et fasekontrastmikroskop ved bruk av et 5× – mål eller tatt med Celigo™ imaging cytometer ved bruk av” Tumorosphere ” – applikasjonen. Celleviabilitet ble vurdert med CellTiter-Glo Luminescerende Celleviabilitetsanalyse (Promega, Madison, WI, USA). Etter tilsetning av 100 µ CellTiter Glo reagens til hver brønn i 10 min, ble luminescens målt på en 1450 Microbeta TriLux Luminescens mikroplateleser (Perkin Elmer).

cellesyklus-og proliferasjonsanalyse i sfæroider

Sfæroider ble fremstilt ved å platere 1000 DiFi-celler per brønn i ultra-lave festeplater på 96 brønner, og dyrke dem i nærvær av 100 µ / ml av 6 F6 mAb eller irrelevant mab (retuximab) i 5 dager. For cellesyklusanalyse ble cellene pelletert, trypsinisert, vasket MED PBS, festet i 75% etanol og farget med 40 µ/ml propidiumjodid i nærvær av 100 µ ml−1 RNAse (Qiagen). Cellesyklusfordelingen ble bestemt med ET Fc500 Beckman Coulter Flow Cytometer ved HJELP AV FL – 3-kanalen. Celler ble gated på en prikkplot som viste DNA-puls-topp vs DNA-pulsområdet for å utelukke dubletter. Cellesyklusfordelinger ble illustrert ved Hjelp Av Flow jo-analyseprogramvaren (Treestar, FLOWJO, Ashland ELLER USA).

ved kulturdag 4 ble celleproliferasjon målt ved å inkubere celler med 5-etynyl-2 ‘ – Deoksyuridin (EdU) i 24 timer. EdU inkorporeres I DNA under aktiv DNA-syntese. Deretter, etter celle trypsinization og fiksering/permeabilization i 75% etanol/PBS, innlemmet EdU ble merket og oppdaget Med Klikk-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen). Cellene ble deretter inkubert med 1 µ / ml 4’, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) I PBS/0,1% Triton X100 ved 37 °C i 30 min. Celigo™ “Uttrykksanalyse” (Mål 1 + Maske) – applikasjonen ble brukt til å kvantifisere fluorescerende signal og for dataanalyse. Celler ble identifisert ved HJELP av dapi nukleær flekk og DNA-syntese ble kvantifisert ved å måle EdU inkorporering.

xenograft-modeller fra Mus

1,5 × 106 SW620-celler eller 3 × 106 DiFi-celler ble suspendert i kulturmedium og injisert subkutant (s.c.) i høyre flanke på 6-8 uker gamle athymiske nakenmus fra harlan. 100 mm3, ble mus randomisert i forskjellige grupper og behandlet ved i. p. injeksjon av 0,9% NaCl ELLER 6F6 mAb (15 mg/Kg per injeksjon) to ganger i uken i tre påfølgende uker for det første forsøket og tre ganger i uken for det andre forsøket. Tumorer ble målt to ganger i uken med en tykkelse og volumer beregnet med formelen: D1 x D2 x D3 / 2.

Intrasplenisk leverkoloniseringsmodell

i hvert eksperiment ble 2 millioner luciferase-ekspresjons SW620-celler (SW620-LUC-celler) injisert i milten av 6-8 uker gamle kvinnelige athymiske nakenmus. Milten ble fjernet 2 min etter celleinjeksjon. På dag 1 etter injeksjon ble musene tilfeldig delt i to grupper på 10 mus som ble behandlet enten med 15 mg/kg 6 F6 mAb eller 0,9% NaCl ved i.p. injeksjon, tre ganger per uke. For å evaluere metastatisk dannelse og spredning ble luciferaseuttrykk overvåket ved luminescensbilder etter injeksjon av luciferin (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) en gang per uke. I uke 5 etter operasjonen ble mus ofret, lever ble fjernet, fotografert og makroskopisk synlige metastaser på leveroverflaten ble talt.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble gjort ved HJELP AV STATA 13.0-programvaren (StataCorp). For genuttrykk eller immunhistokjemi eksperimenter ble forskjeller mellom grupper analysert Ved Hjelp Av Kruskall Wallis / Dunns test. Korrelasjoner MELLOM CLDN1 genuttrykk og progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) ble evaluert i hele gruppen (n = 143 pasienter) og i henhold til tumormolekylær subtype. Til dette formål ble de 143 pasientene delt i to grupper basert på MEDIAN CLDN1 genuttrykk (dvs. 9,75). PFS-og OS-verdier ble sammenlignet Ved Hjelp Av Kaplan-Meier-metoden og forskjeller mellom overlevelsesfordelinger vurdert ved hjelp av log-rank-testen.

den parede t-testen ble brukt til å sammenligne effekten av inkubasjon med 6 F6 mAb i in vitro-eksperimenter.

i in vivo-eksperimenter ble det brukt en lineær blandet regresjonsmodell for å bestemme forholdet mellom tumorvekst og antall dager etter injeksjon. Den faste delen av modellen inkluderte variabler som tilsvarer antall dager etter transplantasjonen og ulike behandlingsgrupper. Interaksjonsbetingelser ble bygget inn i modellen; tilfeldige avskjæringer og tilfeldige bakker ble inkludert for å ta hensyn til tidseffekten. Koeffisientene til modellen ble estimert med maksimal sannsynlighet. Overlevelsesraten ble estimert fra injeksjonsdatoen til datoen da svulsten nådde et volum på 1500 mm3 Ved Bruk Av Kaplan-Meier-metoden. Overlevelse kurver ble sammenlignet ved hjelp av log-rank test. For leverkoloniseringsforsøkene ble forskjeller mellom grupper evaluert Med Mann-Whitney U-testen. For alle eksperimenter ble forskjeller ansett å være signifikante når P < 0,05.