cis–trans isomerase av umettede fettsyrer I Pseudomonas og VIBRIO: biokjemi, molekylærbiologi og fysiologisk funksjon av en unik stress adaptive mekanisme

Abstract

Isomerisering av cis til transumettede fettsyrer er en mekanisme som muliggjør Gram-negative bakterier som tilhører slekter Pseudomonas Og Vibrio å tilpasse seg flere former for miljøstress. Omfanget av isomeriseringen korrelerer tilsynelatende med fluiditetseffekter forårsaket, dvs. ved økning i temperatur eller akkumulering av membrantoksiske organiske forbindelser. Transfettsyrer genereres ved direkte isomerisering av den respektive cis-konfigurasjonen av dobbeltbindingen uten et skifte av sin posisjon. Omdannelsen av cis umettede fettsyrer til trans er tilsynelatende instrumental i tilpasningen av membranfluiditet til å endre kjemiske eller fysiske parametere i det cellulære miljøet. En slik adaptiv mekanisme ser ut til å være en alternativ måte å regulere membranfluiditet på når veksten hemmes, for eksempel ved høye konsentrasjoner av giftige stoffer. Cis-trans isomerase (Cti) – aktiviteten er konstitutivt tilstede og ligger i periplasma, det krever VERKEN ATP eller noen annen kofaktor som NAD (P)H ELLER glutation, og den opererer i fravær av de novo-syntese av lipider. Dens uavhengighet FRA ATP er i samsvar med reaksjonens negative frie energi. cti koder for et polypeptid med En n-terminal hydrofob signalsekvens, som spaltes under eller kort tid etter at enzymet transporteres over cytoplasmisk membran til det periplasmiske rommet. Et funksjonelt hemebindingssted for cytokrom c-type ble identifisert i det forutsagte cti-polypeptidet, og nylig ble det oppnådd direkte bevis for at isomerisering ikke inkluderer en forbigående metning av dobbeltbindingen.

1 Innledning — historie

i alle levende celler påvirker stress på grunn av strenge endringer i miljøet membranene. Som et resultat oppstår forstyrrelse av membranintegritet, og dermed blir funksjonen som en barriere, som en matrise for enzymer og som en energiomformer kompromittert . Hvis mottiltak ikke er tatt vekst hemming eller celledød kan forekomme. Den store adaptive responsen til cellene er å holde fluiditeten til membranene i en konstant verdi uavhengig av faktiske miljøforhold. En slik stabilisering av membranfluiditet kjent som ‘homeoviscous tilpasning’ er forårsaket av endringer i fettsyresammensetningen av membranlipider, det utgjør den dominerende responsen av bakterier til membranaktive stoffer eller endrede miljøforhold . Denne grunnleggende mekanismen ble undersøkt Og rapportert I Det berømte arbeidet Av Ingram på slutten av 70-tallet i det siste århundre . Men frem til slutten av 80-tallet ble cis-konfigurasjonen av dobbeltbindingen fortsatt ansett som den eneste som forekommer naturlig i bakterielle fettsyrer. Forbedringen av analytiske avskjæringsteknikker, spesielt ved å introdusere kapillærkolonner i gasskromatografi, muliggjorde klar differensiering av relaterte fettsyremetylestere og en ny klasse fettsyrer, dvs. transkonfigurerte umettede fettsyrer, ble funnet i noen prokaryoter . De første rapportene om transisomerer av umettede fettsyrer var For Vibrio og Pseudomonas bare 10 år siden. Det kan da påvises at transumettede fettsyrer ble syntetisert in vivo fra acetat I Pseudomonas atlantica, selv om det ikke var mulig å forklare hvordan slike fettsyrer kunne dannes basert på kjente biosyntetiske ruter av umettede fettsyrer.

Kort tid etter ble det påvist at konvertering av cis til transumettede fettsyrer utgjør en ny adaptiv mekanisme som gjør det mulig for bakterier å endre sin membranfluiditet i to arter, dvs. i den psykrofile bakterien Vibrio sp. stamme ABE-1 som svar på en økning i temperatur Og I Pseudomonas putida P8 som tilpasning til giftige organiske forbindelser, som fenoler .

vår minireview oppsummerer dagens kunnskap og fremgang med hensyn til tilstanden til faget, og legger vekt på en ganske effektiv og elegant mekanisme som gjør at bakterier kan tilpasse seg miljøendringer som påvirker membranfluiditet.

2 Fysiologi og funksjon av cis-trans isomerase (Cti) av umettede fettsyrer

Begge, I vibrio sp. stamme ABE-1 og I P. putida P8, en klar økning av den normalt lave mengden av transumettede fettsyrer er observert når cellene er utsatt for forhøyede temperaturer eller toksiske fenolkonsentrasjoner. Voksende celler av P. putida reagerer på fenol på en konsentrasjonsavhengig måte, dvs. økning i trans og samtidig reduksjon i de respektive cis umettede fettsyrer korrelerer med mengden fenol akkumulert i membranen . Slik konvertering er ikke avhengig av vekst, da den også forekommer i ikke-voksende celler der forholdet mellom mettede og umettede fettsyrer og den totale mengden umettede fettsyrer ikke kan endres på grunn av mangel på lipidbiosyntese . Konsekvent finner reaksjonen sted i celler hvor fettsyrebiosyntese hemmes av cerulenin . Cis-trans-konvertering har en enzymlignende kinetikk og når sitt endelige trans til cis-forhold 30 min etter tilsetning av membrantoksiske midler. Da konverteringshastigheten ikke påvirkes av kloramfenikol, ble det konkludert med at systemet er konstitutivt tilstede og ikke krever de novo proteinbiosyntese .

Oljesyre (C18:1δ 9cis), som normalt ikke syntetiseres Av P. putida P8, er imidlertid inkorporert i membranlipider i supplerte kulturer. Etter tilsetning av en toksisk 4-klorfenolkonsentrasjon ble oljesyre omdannet til transisomer, dvs. elaidinsyre (C18:1δ 9trans). Et slikt funn viste at transfettsyrer syntetiseres ved direkte isomerisering av cis til transumettede fettsyrer uten å skifte posisjonen til dobbeltbindingen . Økningen av de transmettede fettsyrene ble ledsaget av reduksjonen i den respektive cis umettede fettsyren, mens den totale mengden av begge ble holdt konstant ved enhver konsentrasjon av tilsatte toksiner . SYSTEMET krever IKKE ATP eller noen annen kofaktor som NAD(P)H eller glutation. Dens uavhengighet fra energi som gir ATP er i samsvar med den negative frie energien til cis til transreaksjon .

alle disse dataene førte til forslaget om cis–trans isomerisering å være en ny adaptiv respons i bakterier slik at de kan håndtere økninger i temperatur eller giftige konsentrasjoner av membranforstyrrende forbindelser, forhold som ellers ville påvirke deres membranfluiditet .

fordelen med konverteringen stammer fra steriske forskjeller som vises av cis og transumettede fettsyrer. Et høyt innhold av mettede fettsyrer i membraner gjør at acylkjedene av fettsyrer kan danne en optimal hydrofob interaksjon mellom hverandre, noe som til slutt fører til en tett pakket, stiv membran. Generelt har mettede fettsyrer en mye høyere overgangstemperatur eller smeltepunkt sammenlignet med cis umettede fettsyrer. Fosfolipider som inneholder 16:0 mettede fettsyrer har en overgangstemperatur som er omtrent 63°C høyere enn de som inneholder 16: 1 cis umettede fettsyrer . Faseovergangstemperaturen til membraner øker med økende forhold mellom mettede og umettede fettsyrer. Dobbeltbindingen av en cis umettet fettsyre fremkaller en ubøyelig bøyning med en vinkel på 30° i acylkjeden. Følgelig forstyrres den høyt bestilte pakken av acylkjeder i membranene, noe som igjen resulterer i lavere faseovergangstemperaturer av slike membraner . Således resulterer umettede fettsyrer i cis-konfigurasjonen med bøyde steriske strukturer (dvs.en kink i acylkjeden) i en membran med relativt høy fluiditet. I markert kontrast mangler den lange utvidede steriske strukturen i trans-konfigurasjonen kinken og kan sette inn i membranen på samme måte som mettede fettsyrer .

Bakterier tilpasse seg en økning i deres membran fluiditet ved å øke graden av metning av deres fosfolipid fettsyrer og i noen tilfeller, endring fra cis til trans konfigurasjonen av deres umettede fettsyrer. . En stor ulempe ved endringer i graden av metning som en stressrespons stammer fra sin strenge avhengighet av cellevekst og fettsyrebiosyntese. Følgelig er bakterier som bruker denne mekanismen ikke i stand til å utføre post-biosyntetiske modifikasjoner av membranfluiditeten. Faktisk har det blitt observert at løsningsmidler forårsaker et skifte i forholdet mellom mettede og umettede fettsyrer bare opp til konsentrasjoner som helt hemmer veksten. I nærvær av høyere, dvs. giftige konsentrasjoner, kan cellene ikke reagere og er dermed ikke i stand til å tilpasse seg slike forhold eller de dør selv . Isomerisering av cis til transumettede fettsyrer funnet frem til nå bare i stammer Av slægten Pseudomonas, inkludert de store representantene P. putida og p. aeruginosa, og Vibrio representerer en løsning på problemet med vekstavhengighet, da det også virker i ikke-voksende celler. Selv om endringen fra cis til trans umettet dobbeltbinding ikke har samme avtagende effekt på membranfluiditet som en konvertering til mettede fettsyrer, forårsaker det fortsatt en betydelig effekt på membranets stivhet .

etter første observasjoner hovedsakelig basert på fenolforbindelser, ble en rekke organiske løsningsmidler testet for deres evne til å aktivere Cti, kvalitativt og kvantitativt. Følgelig korrelerer graden av isomerisering tilsynelatende med toksisiteten og konsentrasjonen av organiske forbindelser i membranen . Den antimikrobielle virkningen av et løsningsmiddel korrelerer med dets hydrofobicitet på en måte uttrykt av logaritmen til partisjonskoeffisienten av forbindelsen i en blanding av n-oktanol og vann (logPow) . Organiske løsningsmidler med en logPow mellom 1 og 5 er svært giftige for mikroorganismer fordi de partisjonerer fortrinnsvis i membraner, hvor de forårsaker en økning i membranfluiditet, som til slutt fører til ikke-spesifikk permeabilisering . Forholdet mellom logP-verdien til en forbindelse og dens toksisitet er vist I Tabell 1, hvor 11 undersøkte forbindelser er oppført i henhold til deres økende logP-verdier. I Fig. 1 logP-verdiene er plottet mot målte estimerte konsentrasjoner som forårsaker 50% veksthemming (EC 50) og samtidig konsentrasjonene av forbindelsene som forårsaker en halv maksimal økning i trans / cis (tc 50) forholdet mellom bakterier. Således er det et direkte forhold mellom toksisiteten av organiske løsningsmidler og deres aktiveringseffekter På Cti, men dette er helt uavhengig av kjemiske strukturer av forbindelsene.

Siden 1989, da En P. putida-stamme ble oppdaget som vokste i media som inneholdt en andre fase av det generelt svært giftige toluen, styren eller xylen, flere Andre P. putidastammer har blitt funnet med lignende egenskaper, og mange forskningsgrupper har forsøkt å avdekke mekanismene som ligger til grunn for løsemiddeltoleranse. I de fleste av disse bakteriene har Cti vært involvert i løsemiddeltoleranse.

ikke bare organiske løsemidler eller økning i temperatur, men også noen andre stresselicitorer ble testet for deres effekt På Cti. Oppsummert ble alle membraner som påvirker stimuli som organiske løsningsmidler, osmotisk stress (forårsaket Av NaCl og sukrose), tungmetaller, varmesjokk og membranaktive antibiotika vist å aktivere systemet . Stressforhold, som osmotisk stress forårsaket av glyserol, kaldt sjokk og høy pH, som er kjent for ikke å være aktivatorer av cellulær k + – opptak-den første cellulære reaksjonen på membranskader som fører til økt permeabilisering-forårsaket ikke aktivering av Cti . Slike funn tyder tydelig på at cis / trans-forholdet antagelig er en del av en generell stressresponsmekanisme av mikroorganismer .

3 Biokjemi Og molekylærbiologi Av Cti

Etter den fysiologiske beskrivelsen av Den generelle funksjonen Av Cti i bakterier for å tilpasse seg forskjellige spenninger, ble molekylærbiologiske og biokjemiske undersøkelser utført for å karakterisere dette unike adaptive responssystemet.

basert på tester Av Cti-aktivitet i cellerom ble cytoplasmisk membran ansett som plasseringen av enzymet der også dets substrater, fosfolipidfettsyrene, er tilstede. Overraskende Nok ble Cti deretter renset fra den periplasmiske fraksjonen Av Pseudomonas oleovorans Og Pseudomonas sp. stamme E-3 . Kloning av enzymet tillot sin isolasjon som Et His-merket P. putida P8 protein heterologt uttrykt I Escherichia coli. Cti er et nøytralt protein på 87 kDa og ble vist å være monocistronisk transkribert og konstitusjonelt uttrykt. Nukleotidsekvensen av cti-genet fra P. putida P8, P. putida DOT-T1E Og P. oleovorans Gpo12 endelig gjort klart at isomerase besitter En N-terminal hydrofob signal sekvens, som spaltes av etter målretting enzymet til periplasmic plass.

En cti knockout mutant Av P. putida DOT-T1E er konstruert som ikke er i stand til å isomerisere cis umettede fettsyrer. Denne mutanten har en overlevelsesrate når sjokkert med 0.08% (vol/vol) toluen lavere enn villtype-stammen, og det viser også en lengre forsinkelsesfase enn foreldrestammen når den vokser med toluen levert i gassfasen, resulterer som tydelig impliserer Cti i toluen-respons i denne stammen. Imidlertid er cis-trans isomerisering usannsynlig å være den eneste nødvendige tilpasningsmekanismen til organiske løsningsmidler fordi stammer er kjent som kan utføre isomeriseringen og fortsatt er løsningsmiddelfølsomme .

Holtwick et al. gitt bevis for at enzymet er et cytokrom c-type protein da de kunne finne et hemebindingssted i det forventede cti-polypeptidet. For et enzympreparat Fra Pseudomonas sp. stamme E-3, som antagelig er homolog til cti-genproduktet Av P. putida P8, ble det foreslått at jern (sannsynligvis Fe3+) spiller en avgjørende rolle i den katalytiske reaksjonen . Cis-trans isomerisering ble funnet å være uavhengig av kardiolipinsyntasen, et enzym som letter langsiktig tilpasning av membranen ved forbedret kardiolipinsyntese .

Svært nylig ble den molekylære mekanismen for isomeriseringsreaksjonen klarlagt. I tilskuddsforsøk med dobbelt deuterert oljesyre ble det påvist at oljesyre ble omdannet utelukkende til dobbelt deuterert elaidinsyre etter aktivering av Cti. En forbigående metning av dobbeltbindingen under isomerisering må utelukkes, samt en kombinert hydrering-dehydreringsreaksjon . Således foreslås en enzymatisk mekanisme: et enzym-substratkompleks dannes der det elektrofile jern (sannsynligvis Fe3+), gitt av heme-domenet som er tilstede i enzymet, fjerner et elektron fra cis-dobbeltbindingen, og overfører sp2-bindingen til en sp3. Dobbeltbindingen rekonstitueres deretter etter rotasjon til trans-konfigurasjonen. En ordning med denne foreslåtte enzymatiske mekanismen er presentert I Fig. 2. En slik mekanisme er i samsvar med sted rettet mutagenese eksperimenter utført for å ødelegge heme-bindende motiv I Cti Av P. putida P8 . Disse mutasjonene resulterer i tap av funksjon av enzymet og gir dermed bevis for tilstedeværelsen av cytokrom c og heme i enzymets katalytiske senter. Siden reaksjonen av enzymet ikke er avhengig av en kofaktor, er cti-aktivitet forskjellig fra alle andre kjente hemeholdige enzymer som virker på fettsyrer som substrater. Det er imidlertid ikke behov for en kofaktor fordi ingen nettelektronkraft forbrukes.

En annen indikasjon for sin unikhet stammer fra likhet søk: Cti viste ingen signifikante likheter med homologe peptider når den spådde aminosyresekvens ble sammenlignet med andre proteiner. Ikke overraskende identifiserte imidlertid sammenligning av aminosyresekvenser av de syv opp til dagens kjente cti-proteiner dem alle som hemeholdige polypeptider av cytokrom c-typen . Uavhengig av taxon er en hemegruppe av cytokrom c-typen til stede som et høyt konservert motiv og som et funksjonelt domene i alle enzymer sammenlignet, spesielt er hemebindingsstedet i Cyt c-proteiner lokalisert mellom hemevinylgrupper og de to cysteinene som finnes I det konserverte hemebindende motivet CXXCH.

i Alle cti-sekvenser av de seks Pseudomonas-stammene så langt undersøkt, er En N-terminal signalsekvens tilstede, som indikerer periplasmisk lokalisering Av Cti. En slik lokalisering har allerede blitt bevist For p. oleovorans Og P. putida DOT-T1E . Imidlertid er et signalpeptid karakteristisk For Sek-avhengig sekresjon ikke tilstede I cti-proteinet Av V. cholerae. Flere sekvensjusteringer av de syv kjente cti-proteinene viste at proteiner fra Pseudomonas og Vibrio-stammer danner et fylogenetisk tre bestående av tre hovedgrener, noe som tyder på en felles forfedre av enzymet. Interessant nok utgjør det forutsagte polypeptidet fra V. cholerae åpenbart ikke en egen gruppe, men kommer heller fra den mangfoldige gruppen proteiner Fra P. aeruginosa og P. sp. E-3 . Svært nylig viste justeringsstudier at gener kjent for cti også kan være tilstede i genomene av bakterier som tilhører slægten Methylococcus og Nitrosomonas. Disse organismene er også kjent for å inneholde transumettede fettsyrer . Imidlertid mangler direkte fysiologiske eller biokjemiske bevis for Tilstedeværelsen Av Cti i disse bakteriene fortsatt.

4 Regulering Av Cti

et av de store åpne spørsmålene om cti av umettede fettsyrer er hvordan aktiviteten til dette konstitutivt uttrykte periplasmiske enzymet er regulert. En mulighet ville være en kompleks modell der substratene av enzymet, cis umettede fettsyrer, spaltes fra den periplasmiske fasen av membranfosfolipidene. Den resulterende frie umettede fettsyren vil da bli isomerisert Ved Cti-virkning og deretter festet til lysofosfolipidet, noe som resulterer i et fosfolipid som inneholder transumettede fettsyrer . Likevel er en slik kompleks modell ikke i samsvar med data som bekrefter Cti-aktivitet i hvilende celler og i fullstendig fravær av energikilder, da det i det minste ville trenge energi å feste de modifiserte fettsyrene til membranen.

Regulering av enzymaktivitet kan imidlertid oppnås ved ganske enkelt å gi enzymets aktive senter evnen til å nå sitt substrat, dobbeltbindingen, som igjen avhenger av membranets fluiditetstilstand. Følgelig reflekterer den observerte regio-spesifisitet av enzymet penetrasjon av det aktive stedet av isomerasen til en bestemt dybde i membranen . Den hydrofile strukturen Til Cti og dens periplasmiske plassering støtter antagelsen om at enzymet bare kan nå sitt mål, dvs. dobbeltbindingene av umettede fettsyrer som befinner seg på en viss dybde av membranen, når membranen åpnes av miljøforhold som forårsaker oppløsning av membranen . Det har tidligere vist seg at en reduksjon i acylkjedeordre kan resultere i økt penetrasjon og translokasjon av proteiner i membraner . I analogi med visse fosfolipaser er Det tenkelig At Cti viser dypere penetrasjon i membranen når rekkefølgen av acylkjeder reduseres og avstanden mellom fosfolipidhodegrupper økes. Det er også klart tenkelig at reduksjon av pakking av membraner vil tillate dobbeltbindinger å nærme seg membranoverflater oftere , og til slutt lette samspillet med isomerasen . Da acylkjedepakning økes ved cis til transisomerisering av de umettede fettsyrene , vil penetrasjonen av proteinet motvirkes og samtidig cis til transisomerisering hemmes, noe som til slutt resulterer i stram regulering av acylkjedepakningen uten involvering av indirekte signaleringsmekanismer eller veier. Etter fjerning av den membranaktive forbindelsen vil gjenvinningen av det regelmessig lave trans-cis-forholdet mest sannsynlig skje ved normal de novo-syntese av all-cis-fettsyrer, siden omvendt (trans til cis) prosess vil kreve en energiinngang.

en slik modell for regulering Av Cti–aktivitet forklarer også tilstrekkelig det ofte rapporterte forholdet mellom graden av cis-trans isomerisering og toksisiteten forårsaket av en viss konsentrasjon av en miljøstressfaktor . Som et annet resultat av reaksjonen katalysert av enzymet, oppstår en reduksjon av membranfluiditet, og da enzymet ikke kan nå sitt mål når membranfluiditet har nådd sitt normale nivå, blir enzymet tvunget ut av dobbeltlaget .

5 Avsluttende bemerkninger

selv om cis–trans isomerisering av umettede fettsyrer ikke har blitt fullstendig forstått ble det klart at det er en del av en generell stressrespons system I Pseudomonas og Vibrio celler. En annen indikasjon på den generelle funksjonen Til Cti er også dens ofte beskrevne avhengighet av induksjon/aktivering av andre stressresponsmekanismer .

Det utgjør Tydeligvis en presserende adaptiv mekanisme som tillater raske modifikasjoner av membraner for å takle det nye miljøstresset. En slik rask respons, som virker i form av minutter, gir tid til andre mekanismer avhengig av cellevekst for å lette deres rolle i den adaptive responsen, da den umiddelbare reaksjonen garanterer overlevelse under ulike stressforhold. Når det gjelder løsemiddeltoleranse, virker en slags kaskade av raske (presserende), midtveis og langsiktige mekanismer sammen for å nå en full tilpasning til miljøstress. Cti representerer utvilsomt en av de store presserende systemer som hjelper cellene til å motstå den første toluen sjokk, til slutt tillater aktivering og induksjon av ytterligere adaptive mekanismer som til slutt provosere fullstendig tilpasning .

På grunn av sin enkle funksjon og effektivitet, og fordi det fungerer uten komplekse regler, er det utrolig at en slik cis til trans isomeriseringsmekanisme ikke er allestedsnærværende tilstede I Gram-negative bakterier. En mulig forklaring kan komme fra den utbredte forekomsten av De to slektene Pseudomonas Og Vibrio. Blant ikke-spesialiserte bakterier er Medlemmer Av Slekten Pseudomonas kjent for å være svært tilpasningsdyktige mikroorganismer, etter å ha erobret alle nisjer av et stort antall økosystemer som består av jord, menneskelig hud og sjøvann. Medlemmer av slekten vibrio erobret også et bredt spekter av økosystemer, inkludert jord og dypvann. For å kunne kolonisere alle disse nisjene må de være ekstremt fleksible og tilpasningsdyktige til endrede miljøforhold. Cti gir cellene en effektiv mekanisme for å oppnå en slik tilpasningsevne. Dette er ikke nødvendig i Andre Gram-negative bakterier, Som E. coli, som er spesialisert på livet i mage-tarmkanalen hos pattedyr hvor de kan leve lykkelig uten en slik presserende membrantilpasningsmekanisme.

Membranlipider tilbyr et lovende verktøy som biomarkører for analyse av mikrobielle populasjonsendringer. Faktisk, Guckert et al. har foreslått å bruke et trans / cis-forhold større enn 0,1 (normal indeks rapportert for de fleste miljøprøver) som en indeks for sult eller stress. Siden måling av fettsyreprofiler har blitt en rutinemessig metode i mange laboratorier, høres dette ut som en lovende tilnærming til vurdering av toksiske effekter. Bestemmelse av trans / cis-indeksen kan derfor være et verdifullt alternativ for å studere toksisitetsstatusen til naturlige prøver, spesielt når vekstavhengige tester ikke kan utføres, f. eks. i naturlige habitater. Hovedområdet for en slik indikator ser ut til å være måling av toksisitet og miljøbelastning under in situ bioremedieringsprosesser der fettsyreprofiler har betydning som markør for økologiske undersøkelser av jordmikrofloraen. For eksempel, under bioremediering av forurensede steder, kan nivået av transumettede fettsyrer brukes som markør for generell stress og stressreduksjon for å overvåke bionedbrytingsprosessen . Anvendelsen av cis-trans isomerisering som et vurderingsverktøy for den generelle toksisiteten av organiske forbindelser er allerede beskrevet for aromatiske karbonylforbindelser . Videre studier som tar sikte på og forbedrer bruken av isomerisering av cis til transumettede fettsyrer som indikator for stress er avgjørende og kan til slutt resultere i en anvendelig teknikk for miljøovervåking.