Cistron
BIOGENESE AV PTX
DE fem PTX-underenhetene er kodet av sammenhengende cistroner i en enkelt polycistronisk operon , hvis uttrykk er regulert av bvga/s-systemet. Via denne to-komponent system toksin produksjon kan moduleres ved tilstedeværelse Av Av MgSO4 eller nikotinsyre, eller under vekst ved lave temperaturer(for gjennomgang, se). BvgS er et indre membranspennende protein som uttrykker flere kinaseaktiviteter. I aktiv tilstand aktiverer Den BvgA via fosforylering. Fosforylert BvgA, en cytoplasmatisk transkripsjonsregulator, binder seg deretter til operatørstedene I PTX – genpromotor-regionen, hvor DEN interagerer MED RNA-polymerasen og aktiverer transkripsjon. Selv om modulatorer som forstyrrer bvgs-signalering er identifisert, er ingen bvgs-ligand som kreves for å utløse signalering kjent, noe som tyder på At BvgS er aktivert som standard .
etter transkripsjon produseres de enkelte underenhetene som preproteiner som inneholder spaltbare signalpeptider. Ved translokasjon gjennom den indre membranen (mest sannsynlig via En sek-avhengig vei) fjernes signalpeptidene. Selv om signalpeptidene viser typiske trekk ved substratene for leader peptidase I, er deres spaltning Av Escherichia coli leader peptidase i svært ineffektiv. Koekspresjon Av b. pertussis lep-genet i E. coli øker modningen av PTX-underenheter betydelig . Innenfor det periplasmiske rommet dannes intra-subenhet disulfidbindinger, og holotoxin blir deretter samlet før sekresjon gjennom ytre membran. PTX inneholder totalt 11 intra-subenhet disulfidbindinger, en I S1, to i Hver S4 Og S5, og tre I Hver S2 og S3 . Alle cysteinene som er tilstede I PTX er involvert i intrakjede disulfidbindinger . Disulfiddannelsen er viktig for toksinbiogenesen, da endringen av enten cystein I S1 forhindrer denne underenheten i å samle seg Med b-oligomeren . Riktig disulfiddannelse er avhengig Av dsba / DsbC-systemet, som ble funnet å være avgjørende for PTX-montering og sekresjon . Mutasjoner i dsbC, som koder for en av tre disulfidisomeraser, har tilsynelatende ingen effekt på sammensetningen av toksinet, selv om de svekker sekresjonen, noe som tyder på At DsbC virker på en komponent som er spesielt nødvendig for PTX-sekresjon.
Sekresjon er ikke nødvendig for biologiske aktiviteter AV PTX, men full montering av holotoxin er viktig for effektiv sekresjon, som stammer konstruert for å produsere Bare S1 eller bare b oligomer viser en defekt i sekresjon . Imidlertid kan en fullt funksjonell b-oligomer utskilles til en viss grad i fravær Av S1, noe som indikerer at tilstedeværelsen Av S1 ikke er et absolutt krav til b-oligomersekresjon. I kontrast kan S1 alene ikke utskilles i fravær Av b-oligomeren, noe som tyder på at sekresjonsdeterminanter er lokalisert i B-oligomeren, selv om tilstedeværelsen Av S1 sikkert kan øke sekresjonseffektiviteten. Visse mutasjoner i s1-genet har en sterk skadelig effekt på sekresjon, spesielt i området rundt Arg-57, noe som tyder på at denne regionen Av S1 spiller en rolle i utskillelsen AV PTX. I fravær Av b oligomeren, s1 mest sannsynlig partisjoner til den ytre membranen, kanskje via Sin C-terminal, hydrofobe domene. Dette kan være samlingsstedet med b-oligomeren før sekresjon gjennom den ytre membranen .
de molekylære trinnene i holotoxin-samlingen er fortsatt dårlig forstått. Enkle underenheter i mutantstammer som ikke produserer de andre underenhetene, blir raskt degradert. Visse kombinasjoner av underenheter ser ut til å stabilisere hverandre gjensidig . For eksempel blir stabiliteten Til s2-underenheten sterkt forbedret ved tilstedeværelsen Av S4 og omvendt, som er konsistent Med s2-S4-dimerdannelsen avslørt av krystallstrukturen til holotoxinet. Det er også mulig at underenheter Av s2–S4-dimer med s1-underenheten dannes i fravær Av S3 og S5. S2-S4 dimer har ikke blitt funnet å bli utskilt I B. pertussis, mens tilsetningen Av S1 til denne dimer kan resultere i et visst nivå av sekresjon.
transporten AV PTX gjennom den ytre membranen Til b. pertussis er avhengig av et TYPE IV-sekresjonssystem (T4SS) som består av ni forskjellige proteiner, Kalt PtlA Gjennom PtlI . Disse proteinene er homologe til De Av T4SSs fra andre bakterier, inkludert Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila og Rickettsia prowasekii . Ptl-genene ligger direkte nedstrøms for de fem STRUKTURELLE PTX-genene og er under kontroll av ptx-promotoren . Imidlertid Ser Ptl-proteinene ut til å bli produsert på lavere nivåer enn PTX-underenhetene, som det fremgår av translasjonelle fusjoner av phoA-genet med forskjellige ptx-og ptl-gener . Produksjonen av Visse Ptl-proteiner ser ut til å være et begrensende trinn i utskillelsen AV PTX. Under eksponentiell vekst har bakteriene blitt estimert til å utskille tre toksinmolekyler / min / bakteriecelle , og underenheter har blitt funnet å akkumulere i det periplasmiske rommet, både som individuelle underenheter og samlet inn i holotoksiner. Subenhetsakkumulering skjer gjennom eksponentiell vekst, selv om nivåene av Visse Ptl-proteiner øker til mellom 30 og 1000 molekyler per celle. Dermed kan sekresjon i stedet for toksinproduksjon eller montering være hastighetsbegrensende. Merkelig, i fravær Av Ptl-proteiner, kan noen subenhetskombinasjoner, Som s2–S4-dimer i nærvær Av S1, utskilles, selv om sekresjonen av holotoksin sterkt avhenger av Tilstedeværelsen Av Ptl-proteiner.
Ptl-proteinene antas å danne et kompleks som spenner over både indre og ytre membraner , og alle Av Dem (Minst PtlA-H) ser ut til å være nødvendige for toksinsekresjon, som undersøkt av mutasjoner i hvert enkelt ptl-gen . Noen av mutasjonene introdusert i trans i villtype ptl + stammer resulterte i en dominerende negativ sekresjon fenotype, bekrefter at Minst PtlC Til PtlH er en del av et multimere kompleks. Et viktig skritt I PTX-sekresjon er åpenbart dets evne til å krysse peptidoglykanlaget, og PtlE har vist seg å uttrykke peptidogykanaseaktivitet . Dette 276-rester-lange proteinet inneholder aktive stedlikheter med andre glykohydrolaser, og alaninsubstitusjoner på dette stedet har vist seg å redusere peptidoglykanaseaktiviteten til rekombinant PtlE sterkt. De samme substitusjonene i naturlig PtlE avskaffer også sekresjon AV PTX av b. pertussis, noe som sterkt tyder på At PtlE er peptidoglykanasen som kreves for at toksinet skal krysse peptidoglykanlaget.
PTX-sekresjon krever også mest sannsynlig energi. To Av Ptl-proteinene, PtlC og PtlH, inneholder antatte adenosintrifosfat (ATP)–bindingssteder og kan dermed gi den energien som er nødvendig for toksinsekresjon. Begge proteinene har vist seg å være nødvendige for sekresjon , og i begge tilfeller er de antatte ATP-bindingsstedene essensielle for funksjon. For begge, en dominerende negativ fenotype er observert når mutant alleler er coexpressed med wild-type allel, noe som tyder på at begge fungerer som multimere eller er en del av sekresjonskomplekset. PtlH ble vist å være assosiert med den indre membranen, og mutasjoner i PTLHS ATP-bindingssted påvirker dets cellulære plassering og avskaffer dets interaksjoner med Andre Ptl-proteiner . Den nøyaktige Rollen Til PtlC er ennå ikke kjent. PtlD er også et indre membranprotein og inneholder fem transmembrane domener. Det er nødvendig for Stabiliteten Av PtlE, PtlF og PtlH via Sine c-terminal 72 rester. Denne C-terminale regionen er imidlertid ikke tilstrekkelig for toksinsekresjon . PtlF viser egenskaper av ytre membranproteiner (OMPs), men det kan også være forbundet med den indre membranen. Under ikke-reduserende forhold migrerer PtlF og PtlI som et kompleks under elektroforese av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel, noe som indikerer At PtlI bindes til PtlF ved dannelse av disulfidbinding . Den riktige dannelsen av disulfidbinding Mellom PtlI og PtlF kan avhenge Av DsbC, da mutasjoner i dsbc-genet påvirker sekresjonen uten å påvirke toksinsammensetningen .
