Clothianidin frø-behandling har ingen påviselig negativ innvirkning på honningbikolonier og deres patogener

Studiedesign

i 2013 var det totalt 16 felt (8,9 ± 5,4 ha; gjennomsnittlig ± s.d.) i sør-Sverige, beregnet for vårsådde oljevekster (Brassica napus l.) ble paret i henhold til geografisk nærhet (men adskilt av >4 km) og arealbruk (Fig. 1, se ovenfor). Det omkringliggende landskapet ble inspisert for fravær av blomstrende avlinger. Men i 2013 var det to felt igjen i studien, selv om det var et annet rapsfelt i nærheten, for å beholde så mange gårdspar som mulig34. I hvert gårdspar ble ett felt tilfeldig tildelt for å bli sådd med clothianidin-behandlede rapsfrø, mens det andre feltet ble sådd med frø som ikke ble behandlet med clothianidin (behandlet: 8; kontroll: 8). De samme parrede gårdene ble brukt i 2014, men med behandlingene reversert, dvs. steder med behandlede felt i 2013 hadde kontrollfelt i 2014 og omvendt (behandlet: 6; kontroll: 4). På grunn av veksling ble ulike felt innenfor hver gård brukt i 2013 og 2014 (Fig. 1, se ovenfor). For å skape Fig. 1, vi lastet ned et kart Fra World Borders Database (nedlastbar her: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

Informasjon om omliggende landskapsvariabler for de ulike gårdene i 2014 er presentert I Utfyllende Tabell 7. I 2014 hadde halvparten av fokalfeltene ytterligere vårsådde raps (1-13 hektar) innenfor en radius på 2 km. De clothianidin-behandlede frøene for fokalfeltene ble belagt Med Elado, en varemerkebeskyttet blanding av to aktive ingredienser: clothianidin (400 g l−1) og β-cyfluthrin (+80 g l−1), valgt for denne studien fordi det var den dominerende frøinsekticidbehandlingen i rapsolje i Sverige og i Andre Deler Av Europe63. Clothianidin tas opp av anlegget og distribueres systematisk til alle dens deler for beskyttelse mot insekter64. β-Cyfluthrin anses ikke å være systemisk, og det ble ikke påvist rester i prøver samlet inn i denne studien34. Både clothianidin-behandlede og kontrollfrøene ble belagt med fungicidet thiram i 2013.

de deltakende bøndene ble instruert om ikke å bruke andre neonicotinoider i feltene under studien, selv om andre insektmiddelbladsprayer; primært Plenum (pymetrozin), avaunt/Steward (indoksakarb) og mavrik (tau-fluvalinat; også brukt som varroacid i biavl) ble brukt til skadedyrsbekjempelse (Supplerende Tabell 8). Biscaya, handelsnavn for en sprayformulering som inneholder neonicotinoid thiacloprid, ble imidlertid påført ett kontrollfelt i 2013, etterfulgt av En mavrik spray 1 uke senere, og til et behandlet felt i 2014, ved begge anledninger på 0.3 L ha-1. Tiakloprid har en betydelig lavere akutt toksisitet for bier enn clothianidin65, og bare spormengder av tiakloprid ble påvist i pollen, nektar og biprøver i 2013 og ingen i 2014. Mens Rundlö et al.34 observerte ingen endring i resultatene da felt Hvor Biscaya ble brukt ble ekskludert fra analysene, vi oppdaget noen kvalitative endringer (Supplerende Tabell 9). Disse endringene kan skyldes høyere thiacloprid rester oppdaget i 2014, men kan like godt ikke forholde Seg Til Biscaya, men heller til forskjellen Mellom Biscaya / Mavrik og de alternative insekticid spray kombinasjoner brukt34 eller skyldes redusert statistisk kraft.

Honeybee kolonier

Ett hundre og seksten honeybee kolonier ble utarbeidet i Slutten Av Mai 2013 av en profesjonell birøkter i enkelt Full-size Langstroth elveblest som inneholder to kammer med hovedsakelig forseglet stamfisk (med bier), to fulle honeybee (med bier), en trukket ut tom kam, fem kammer med voks foundation, bier ristet fra to kammer og enten en 1-åring (84 eksperimentelle kolonier) eller 2-åring (12 eksperimentelle kolonier). kolonier pluss 20 reservekolonier) dronning av kjent avstamning For Å Produsere Relativt Små, like store (3418 hryvnias 123 Voksne Bier; mener ± s.e.m.; n = 96 kolonier) kolonier med god plass til vekst som kan bli sterke nok til å overleve den kommende vinteren, men ikke vokse sin plass om sommeren. Seks eksperimentelle kolonier ble plassert langs feltkanten i hvert av de 16 rapsfeltene (totalt 96 kolonier) mellom 14. og 28. juni 2013 ved begynnelsen av rapsblomstringen (Supplerende Fig. 1). Queen avstamning og alder ble matchet mellom gården-par, men kolonier ble ellers fordelt tilfeldig. Kolonier ble holdt på en 60 ha organisk forvaltet vinter oljeraps felt i full blomst før plassering på 16 eksperimentelle felt (Supplerende Fig. 1) for å sikre pre-eksperiment koloni vekst var basert så mye som mulig på plantevernmiddel-fri foraging.

da rapsblomsten i forsøksfeltet hadde opphørt, ble koloniene flyttet mellom 2. og 31. juli (Supplerende Fig. 1) til en felles apiary å overvintre. Den 10. August fikk koloniene en maursyredampbehandling mot varroa-midd, bestående av 20 ml 60% maursyre gjennomvåt i en flat husholdningssvamp plassert under det indre dekselet på toppen av rammene. Koloniene ble matet totalt 20 kg sukker per koloni i form av en 55-60% v/v sukroseoppløsning, levert i en mateboks over tre anledninger i August–September 2013. En ytterligere lett Varroa-behandling ble utført 4. desember ved å drysse 30 ml 2,6% oksalsyre i 60% sukrose i mellom rammene, direkte på bieklyngen. Våren 2014 ble koloniene flyttet til et organisk forvaltet rapsfelt før de ble plassert på de 10 vårsådde rapsfeltene (Supplerende Fig. 1). Kolonier ble vurdert for inkludering i 2014-delen av studien hvis de hadde en 2 år gammel eggleggende dronning i April 2014 (unntatt kolonier som døde, re-queened eller hadde 3 år gamle dronninger i April 2014) og ikke hadde vrimlet i begynnelsen av juni 2014. Disse restriksjonene, i tillegg til kravet om at kolonier ville bli utsatt/ueksponert for clothianidin i begge årene av forsøket, betydde at i 2014 bare fire kolonier kunne tildeles hvert felt. Kolonier plassert av behandlede felt i 2013 ble igjen plassert av behandlede felt i 2014, for å vurdere de kumulative effektene av flerårig clothianidin eksponering, men ble ellers randomisert før plassering for å minimere utilsiktede forstyrrelser. Likevel måtte to kontrollkolonier fra 2013 plasseres av et clothianidin-behandlet felt i 2014, på grunn av utilstrekkelige kvalifiserende eksponerte kolonier for de seks clothianidin-behandlede feltene. Nok kolonier var tilgjengelige for de fire kontrollfeltene. Kolonienes styrke ble utlignet som beskrevet for 2013, men bare innenfor hver behandlingsgruppe. Koloniene ble redusert og utlignet for andre gang (8.juni 2014), etter at noen av dem ble for store og forsøkte å svømme (Supplerende Fig. 1). Hver redusert koloni inkluderte 1 full honningkam( med bier), 3 kammer med hovedsakelig forseglet brød (med bier), og den opprinnelige dronningen fra 2013 og 6 kammer med voksfundament. Koloniene ble flyttet til vårens rapsfelt mellom 16. og 25. juni 2014 og brakt tilbake til det felles overvintringsstedet mellom 14.og 22. juli 2014 (Supplerende Fig. 1).

Restanalyser

for å bekrefte clothianidin-eksponering ble 24 voksne honningbier per felt fanget ved hive-inngangen, pollenpellets samlet fra 5 honningbier foraging i rapsfeltene og nektar fjernet fra magen av 5 nektar-foraging honningbier i rapsfeltene analysert fra hvert sted for klutianidin-rester. Pollen (> 25 ml) ble samlet ved hjelp av pollenfeller, som ble installert i 1 dag på tre kolonier per sted og analysert for planteartens opprinnelse. Prøver ble håndtert og analysert som I Rundlö et al.34 og samlet under toppblomstringsvurderingene i begge år (Supplerende Fig. 1), med konsentrasjonene av clothianidin og fire andre neonicotinoider som brukes I Sverige (Supplerende Tabell 2) kvantifisert ved hjelp av væskekromatografi kombinert med tandem massespektrometri (LC-MS/MS) og pollen identifisert til rapsolje type ved hjelp av lysmikroskopi og pollen referansebibliotek (se Supplerende Tabell 2 for grenser for deteksjon og kvantifisering). For videre analyser av variasjonen i neonicotinoid eksponering av honningbier i ulike områder, vi samlet 12 honningbier per område fra strukturen inngangen. Denne prøvetaking ble gjort på tre clothianidin-behandlede steder i 2013. Nektar ble ekstrahert fra honningmagen til de samlede biene. Konsentrasjonene av clothianidin ble deretter kvantifisert i både nektar og bivev for hver enkelt bi. Flere detaljer om prøvebehandling for ulike matriser, LC-MS / MS metode og kvalitetskontroller er gitt I Supplerende Metoder.

Koloniutvikling, re-queening og honningproduksjon

Honeybee koloniutvikling ble vurdert av samme trente observatør og en assistent. Tilstedeværelsen av en leggdronning ble etablert, så vel som tilstedeværelsen av dronningceller. Hvis en re-queening hendelse ble ledsaget av et stort tap av voksne bier, ble det ansett å ha vrimlet. Hvis det ikke ble observert tap av voksne bier, ble kolonien ansett å ha re-queened gjennom erstattet. Kolonihonning produksjon og utvikling ble bestemt ved å veie koloniene og ved å vurdere kolonistyrke ved Hjelp Av Liebefeld metoden66, som det totale antall voksne bier og arealet av avkortet brød over alle rammer. Antall voksne bier ble estimert ved å telle honningbier på begge sider av 10-rammene. Antall avkortet stamceller (mengde stamfisk) ble bestemt ved å multiplisere andelen lukket stamfisk dekning av 2700, som er antall celler på den ene siden av rammene som brukes. Koloniene ble veid under pre-eksponering og etter eksponering vurderinger (ved Hjelp Av En mettler Toledos benkvekt som kunne veie opptil 32 kg med 1 g presisjon), for å estimere honningproduksjon. Full honning rammer ble erstattet av tomme rammer under raps blomst, slik at kolonien å vokse og redusere sverming. Både de fulle og de tomme rammene ble veid, for inkludering i beregningen av honningproduksjon. Under vurdering etter eksponering ble så mange honningrammer som mulig fjernet (maks 10% av området dekket med dekket brød) for å simulere biavlerne honninghøst. Pre-eksponeringsvurderinger ble gjort på det organisk forvaltede vintersådde rapsfeltet 6. -17. juni 2013 og 9. -11. juni 2014, og etter eksponeringsvurderinger ved common overwintering apiary 29. juli til 9. August 2013 og 28. -31. juli 2014 (Supplerende Fig. 1). Videre ble en vårkolonistyrkevurdering utført i April 2014 ved å estimere totalt antall voksne bier og antall avkortet brød (Supplerende Fig. 1). Kolonien assessor og assistenter ble blindet under datainnsamling med hensyn til behandlingsregime av feltene.

Patogen-og parasittprøveinnsamling og prosessering

Prøver av rundt 100 voksne honningbier ble tatt fra hver koloni under pre – og posteksponeringsvurderinger i clothianidin-behandlede og kontrolleksperimentelle oljeraps-felt i både 2013 og 2014 (Supplerende Fig. 1). Bier ble tatt fra den ytre kammen av hver koloni og besto derfor av en blanding av husbier og forager bees67. Alle bie-prøver ble lagret ved -20 °C til laboratoriearbeidet ble utført. V. destructor infestation priser for hver koloni ble bestemt ved å vaske de voksne bee prøver med såpevann for å løsne og telle mites68. Abdomens av 60 voksne honningbier per koloni (for individuelle kolonianalyser) eller per apiary (for 2013-pooled colony analyses, 10 bier per koloni) ble fjernet og plassert i en polyetylenpose med et indre nett (BioReba). Bukene ble malt i posen ved hjelp av en pestle og 30 ml nukleasefritt (Milli-Q) vann (0,5 ml per bi) ble blandet grundig med prøven for å skape en homogen suspensjon. Flere 1 ml av denne suspensjonen ble fjernet og frosset umiddelbart ved -80 °C for DNA – og RNA-ekstraksjon og som fremtidig referansemateriale.

Parasitter, patogener, symbiotiske mikrober og immungener

de innsamlede biprøvene ble vurdert for en rekke patogene og ikke-patogene parasitter og mikrober for å studere virkningen plassering av kolonier på clothianidin-behandlede felt på deres prevalens og overflod. Organismene inkluderte allestedsnærværende ektoparasitt varroa destructor, 13 virus: akutt bee lammelse virus (ABPV), bladlus dødelig lammelse virus (ALPV), Big Sioux River virus (BSRV), black queen celle virus (BQCV), kronisk bee lammelse virus (CBPV), deformert wing virus type-A (DWV-a), deformert wing virus type-B (DWV-B), Israelsk akutt lammelse virus (Iapv), Kashmir bee virus (KBV), Lake sinai virus stamme 1 (LSV-1) og stamme 2 (LSV-2), Sacbrood virus (Sac). sbv), slow BEE LAMMELSE VIRUS (sbpv); to vanlige HONEYBEE microsporidian Gut parasitter (NOSEMA APIS og nosema ceranae) OG TO SYMBIOTISKE tarmbakterier (gammaproteobacterium: gilliamella APICOLA OG BETAPROTEOBACTERIUM: Snodgrassella alvi). For 2013-prøvene analyserte vi også på apiary-nivå mRNA-nivåene av åtte honningbiegener (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 og SPH51) hvis uttrykk tidligere hadde vært knyttet til plantevernmiddel, patogen og/eller parasitteksponering19,44 og (sosial) immunitet i honningbier45.

nukleinsyreutvinning

DNA ble ekstrahert fra bi-homogenatene ved hjelp av protokollen for ekstrahering AV DNA Fra Nosema spores69, som er tilstrekkelig robust til også å trekke UT DNA fra bakterier og andre mikroorganismer. Totalt 500 µ primært bi-homogenat ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrofuge ved 13 000 o / min. Pelleten ble gjentatte ganger frosset-tint med flytende nitrogen og malt med en steril teflon mikropestle til pulverisert. Den pulveriserte pelleten ble resuspendert i 400 µ qiagen Plantevev DNeasy AP1 lysisbuffer inneholdende 4 µ rnase-A (10 mg ml−1) og inkubert og ristet i 10 min ved 65 oC, hvoretter 130 µ p3 nøytraliseringsbuffer (3,0 m kaliumacetat pH 5.5) ble tilsatt, etterfulgt av 5 min inkubasjon på is og sentrifugering i 5 min ved 14,000 rpm for å fjerne lysis rusk. DNA ble renset fra 500 µ av supernatanten av qiagens automatiserte qiacube-ekstraksjonsrobot, etter Plantedneasy-protokollen og eluerte DNA i 100 µ nukleasefritt vann. RNA ble ekstrahert av qiacube-roboten direkte fra 100 µ primært honeybee-homogenat ved Bruk Av qiagen-Anlegget RNeasy-protokollen (inkludert Qia-makuleringsmaskinen for ytterligere homogenisering70) og RNA ble eluert til 50 µ nukleasefritt vann. Den omtrentlige nukleinsyrekonsentrasjonen ble bestemt Av NanoDrop, hvoretter prøvene ble fortynnet med nukleasefritt vann til en jevn 10 ng µ-1 (DNA OG LSV−1(RNA)) eller 20 ng µ-1 (for alle ANDRE rna−prøver) og lagret ved -80 °C.

RT-qPCR og qPCR

de forskjellige mikroorganismer og verts-mRNA-mål ble oppdaget og kvantifisert ved Enten Ett-Trinns revers transkripsjon-kvantitativ pcr (rt-qpcr) For Patogener med et rna-genom og immun-og interne referansegenet mrna-mål, eller ved kvantitativ pcr (qpcr) for organismer MED DNA-GENOM. Detaljer om analysene er vist I Tilleggstabell 10, Tilleggstabell 11 og Tilleggstabell 12. Omvendt primer For Amel / LRR ble litt re-designet Fra Di Prisco et al.19 fordi den ekstremt høye komplementariteten mellom de opprinnelige forover-og revers primere resulterte i høye NIVÅER AV PCR-gjenstander som dominerer det kvantitative signalet. Reaksjonene ble utført i to eksemplarer, i 20@l (DNA) eller 10 hryvnl (RNA) reaksjonsvolumer som inneholdt 2 µl (DNA) eller 1.5@l (RNA) mal, 0.4 µ (DNA) eller 0.2 µ (RNA) av forover og bakover primer og Enten Bio-Rad Eva Green qPCR mix (DNA) eller Bio-Rad One-Step iTaq RT-qPCR mix MED SYBR Green detection chemistry (RNA). Reaksjonene ble inkubert i 96-brønns optiske qPCR-plater I Bio-Rad CFX connect thermocycler, ved bruk av følgende amplifikasjonssyklusprofiler: 10 min ved 50 °C for komplementær DNA (cDNA) syntese (KUN RT-qPCR): 5 min ved 95 hryvnias C (for å inaktivere revers transkriptase og aktivere Taq polymerase) etterfulgt av 40 sykluser på 10 s ved 95 °C for denaturering og 30 s ved 58 hryvnias C for primerglødning, forlengelse og datainnsamling. FOR DNA-analyser ble følgende amplifikasjonssyklusprofiler brukt: 2 min ved 98 hryvnias C for den første denatureringen etterfulgt av 40 sykluser på 5 s ved 98 hryvnias C for denaturering og 10 s ved 60 hryvnias C for primerglødning, forlengelse og datainnsamling. Amplifiseringssyklusene ble etterfulgt av en smeltekurveanalyse for å bestemme spesifisiteten til amplifiseringen ved å lese fluorescens ved 0,5 °c trinn fra 65 °C til 95 °C. inkludert på hver reaksjonsplate var positive og negative (ikke-mal) analysekontroller. For hver analysetype (Supplementstabell 10, Supplementstabell 11 og Supplementstabell 12) ble det utarbeidet en kalibreringskurve gjennom en 10 ganger fortynningsserie med en positiv kontroll av kjent konsentrasjon som dekker 6 størrelsesordener, for kvantitativ datakonvertering, etablering av referansesmeltekurveprofilen til amplikonet og estimering av reaksjonsresultatstatistikken.

datakonvertering og normalisering

smeltekurvene for individuelle reaksjoner ble evaluert visuelt for å skille ut ikke-spesifikke forsterkninger, som varierer i smeltetemperaturprofiler fra sanne mål cDNA/DNA-amplikoner. Ikke – spesifikke forsterkninger ble slettet fra datasettet. Alle analyser ble kjørt i to eksemplarer, med middelverdien av disse to duplikater som brukes i ytterligere beregninger. Begge duplikatene måtte gi en positiv kvantitativ verdi og passere smeltekurveanalysen for at dataene skulle inkluderes i datasettet. De rå RT-qPCR-dataene for alle bekreftede forsterkninger ble deretter konvertert til estimerte kopieringsnumre for hvert mål-RNA, ved hjelp av den tilsvarende kalibreringskurven for analysen. Disse dataene ble multiplisert med de forskjellige fortynningsfaktorene gjennom hele prosedyren for å beregne estimerte kopier av hvert mål per bee69. SIDEN RNA lett nedbrytes, er det en risiko for at forskjeller mellom individuelle prøver i rna-kvalitet (dvs. nedbrytning) kan påvirke resultatene70. FOR å korrigere FOR DETTE ble RT-qPCR-analyser for mRNA av et felles honeybee internt referansegen (RP49) kjørt på alle prøver. Dataene for rna-målene av interesse ble deretter normalisert til gjennomsnittsverdien FOR RP49 mRNA, og korrigerte dermed dataene for prøvespesifikke forskjeller I RNA-kvalitet med HENSYN TIL RT-qPCR ytelse70.

Statistiske analyser

andelene av honningbie-oppsamlet pollen som stammer fra raps-type planter ble sammenlignet mellom behandlinger (clothianidin frø behandling/ubehandlet) ved hjelp av en generalisert lineær modell forutsatt binominal fordeling og korrigere for overdispersion. Clothianidin-konsentrasjonene i nektar og pollen samlet av honningbier og i bievev ble sammenlignet mellom behandlinger ved Bruk Av Wilcoxon-Mann-Whitney-tester. For å sammenligne konsentrasjonene av clothianidin i bivævet og nektar i individuelle bier mellom felt, brukte VI analyser av varians (ANOVA), med feltidentitet som prediktor. Videre var konsentrasjonene av klutianidin i vev og nektarmageinnhold hos individuelle bier relatert ved bruk av en multippel lineær regresjon med feltidentitet og konsentrasjon av klutianidin i nektar som forklaringsvariabler og konsentrasjon av klutianidin i biavev som responsvariabel.

studien fulgte generelt EN FØR-Etter-Kontroll-Effekt (BACI) design, med en sammenkoblet feltstruktur, gjentatt i to påfølgende år på koloninivå for data om koloniutvikling, samt utbredelsen og overflod av parasitter, patogener og tarmbakterier. Årene, 2013 og 2014, ble analysert sammen i en full modell, med frøbehandling, blomst, år og deres interaksjoner som faste faktorer. Effekten av clothianidin-behandlingen ble vurdert ved samspillet mellom blomst og frøbehandling, da dette begrepet gjenspeiler forskjellen i endring mellom behandlinger over rapsblomstene. Hvis treveis-interaksjonen (bloom × frøbehandling × år) var signifikant (dvs. hvis variabelen reagerte forskjellig på clothianidin-behandlingen fra ett år til det neste), ble datasettet delt etter år og år ble droppet som en fast faktor. Videre ble datasettet analysert i bare 1 år dersom dataene besto av en utvalgsstørrelse ≤10 på ett år både for mikrobiotaforekomst og overflod (Supplerende Tabell 1). Kolonier som svømte (8 på kontrollfelt og 10 på clothianidin-behandlede felt i 2013; en på et kontrollfelt og to på clothianidin-behandlede felt i 2014) ble utelukket fra analysen, siden swarming har stor effekt på koloniutvikling. Også utelukket er den eneste kolonien som mistet sin dronning under transport før feltplassering i 2013 (behandlet felt). Ekskludert kolonier som vrimlet fra analysen kvalitativt endret noen resultater (Se Supplerende Tabell 13). Endringer i signifikansnivå kan skyldes redusert statistisk styrke, tilfeldige tilfeldigheter eller biologiske effekter.

Lineære blandede effektmodeller (LMM) ble brukt til å teste effekten av clothianidin-behandlingen på koloniutvikling målt som antall avkortede stamceller (mengde stamfisk) og antall voksne bier. Frøbehandling (clothianidin eller kontroll), blomst (før eller etter rapsolje), år (2013 eller 2014) og deres interaksjoner var faste faktorer. Farm pair identity, farm identity og colony identity ble inkludert som tilfeldige faktorer. Honningproduksjon ble sammenlignet mellom behandlinger ved BRUK AV EN LMM med gårdsparidentitet og gårdsidentitet som tilfeldige faktorer. Generaliserte lineære blandede modeller (Glmm) ble brukt til å teste påvirkning av clothianidin-behandlingen på re-queening og dødelighet av koloniene med gårdsidentitet som en tilfeldig faktor.

påvirkningen av clothianidin-behandlingen på vårkoloniutvikling, målt som antall voksne bier og mengde brød, ble testet ved hjelp av henholdsvis en lmm og EN GLMM, med frøbehandling som fast faktor og gårdsparidentitet og gårdsidentitet som tilfeldige faktorer. For antall avkortet stamceller brukte vi en negativ binomial feilfordeling og logaritmisk linkfunksjon.

microbiome og Varroa midd data ble analysert både på deres binomial (tilstedeværelse/fravær) og kvantitativ (overflod) karakter, Ved hjelp Av GLMMs (med binomial feilfordelinger og en logit link funksjon) og LMMs (med normal feilfordelinger), henholdsvis med frø behandling, blomst, år og deres interaksjoner som faste faktorer. Glmmer på forekomst av mikroorganisme eller varroa-midd inkluderte bare kolonidentitet som tilfeldig faktor, da den effektive prøvestørrelsen (dvs. det mindre hyppige utfallet av nærvær / fraværsdata) ikke tillot inkludering av flere tilfeldige faktorer. Bare organismer og år med en (effektiv) utvalgsstørrelse > 10 ble analysert for både prevalens og overflodsdata. I tillegg ble kolonier som ikke minst en gang testet positivt for en bestemt mikroorganisme, utelukket fra analysen av overflod. Bee patogen og bakteriell overflod ble logaritmisk (log10) transformert, da de generelt er eksponentielt fordelt. LMMs på målet organisme overflod inneholdt gården par identitet, gården identitet og koloni identitet som tilfeldige faktorer. Varroa midd tall per 100 bier og koloni vekt ble kvadratrot transformert for å unngå ikke-normalfordelte rester. Konfidensintervaller ble beregnet basert på profilsannsynlighet. For kvadratroten transformerte data ble estimatene tilbake-transformert til den opprinnelige skalaen for grafiske illustrasjoner.

immungenutskriftene var bare tilgjengelige for 2013 og på apiary nivå, men fulgte OGSÅ BACI-designen. LMMs på genuttrykk inneholdt frøbehandling og blomst som faste faktorer og gårdsidentitet som tilfeldige faktorer.

Statistiske data analyser ble utført ved Hjelp Av R bortsett fra analyser som adresserer verifisering av clothianidin eksponering og arealbruk, SOM SAS 9.4 For Windows (SAS Institute Inc.) ble brukt. LMMs var egnet ved hjelp av lmer-funksjonen til lme4-pakken, Og GLMMs var egnet ved hjelp av glmmTMB-funksjonen til glmmTMB-pakken i R. p-verdier fra GLMMs ble beregnet ved sannsynlighetsforhold tester. P-verdier fra LMMs ble beregnet ved Hjelp av anova-funksjonen til bilpakken, hvor type III F-tester ble brukt for modeller som inneholder interaksjoner og TYPE II F-tester for modeller uten interaksjoner (dvs.vårvurdering og honningproduksjon). Effekter av faste faktorer ble estimert ved hjelp av sum-til-null kontraster i alle modeller unntatt de på neonicotinoid rester. Sum-til-null-kontraster tillater bestemmelse av hovedeffekter / interaksjoner (dvs.estimering uavhengig av andre uavhengige variabler) og viser effektene av faktorer som avvik fra grand mean (intercept). For faktorer med to nivåer er størrelsen på avviket for hvert nivå fra grand mean det samme, men retningen er forskjellig. Vi representerer effekter av faktorer (frøbehandling, blomst, år), som avvik fra andre nivå (clothianidin, etter 2014) fra grand mean. Dette var også tilfellet for interaksjoner, slik at for eksempel frøbehandlingen × blomst interaksjon indikerer i hvilken grad klutianidin-eksponerte kolonier skilte seg i endring over oljevernblomsten fra gjennomsnittlig endring av begge behandlingene.

Effektanalyse

vi utførte effektanalyser for antall voksne bier og antall avkortede stamceller og honningproduksjon for å undersøke effektstørrelsen vi potensielt kunne oppdage gitt vårt design, replikering og modellvalg. Effekt ble bestemt for en rekke effektstørrelser ved et nominelt konfidensnivå på α = 0,05 ved 1000 Monte Carlo-simuleringer per effektstørrelse ved bruk av powerSim-funksjonen til simr-pakken. Effekt ble beregnet for en rekke effektstørrelser, uttrykt som endring i antall voksne bier, antall avkortede stamceller eller honningproduksjon. Ved å dele effektstørrelsen med gjennomsnittlig antall bier, gjennomsnittlig antall stamceller eller honningproduksjon av alle kontrollkolonier, oppnådde vi effektstørrelse uttrykt som prosentvis endring av disse matrices (Supplerende Fig. 3). Denne effektanalysen gjorde det mulig å sammenligne vår effektstørrelse med effektstørrelsen presentert Av Rundlö et al.34. Ved å bruke hele modellen kunne Vi oppdage en effektstørrelse for antall voksne bier på under 5% med en effekt på 80% sammenlignet med effektstørrelsen under 20% presentert Av Rundlö et al.34. Dette er enda lavere enn kravene til en effektstørrelse < 7% satt AV EFSA32. Som et resultat av en betydelig interaksjon mellom frøbehandling, blomst og år, ble datasettet for antall avkortet stamceller analysert separat for hvert år. Derfor presenterer vi her kraftanalysen for hvert år. Effektstørrelsen der 80% ble nådd økte fra under 10% i 2013 til litt under 11% i 2014 (Supplerende Fig. 3), sannsynligvis på grunn av redusert replikering i 2014. Vi utførte også en effektanalyse av honningproduksjon (mengde honning per koloni i kg) ved hjelp av datasettet i begge år, og viste at en effektstørrelse på under 20% kunne oppdages med en effekt på 80% (Supplerende Fig. 3).

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om eksperimentell design er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.