COLO 205

Vellykket Kultur Av Cellene Dine:

*vennligst les viktig teknisk informasjon som følger før du håndterer ECACC-leverte cellelinjer*. Denne informasjonen er også TILGJENGELIG SOM PDF fra vår hovedmeny, Under ‘ Kundestøtte ‘(klikk her).

Lagring Av Frosne Celler

ved mottak skal frosne ampuller umiddelbart overføres direkte til flytende nitrogen i gassform, med mindre de skal brukes umiddelbart. Ikke bruk en -80°C fryser som et alternativ; dette vil resultere i tap av levedyktighet.

Hvordan Håndtere Frosne Celler Ved Mottak

ved mottak av en forsendelse av FROSNE ECACC-leverte cellelinjer er det viktig at sluttbrukeren gir forsendelsen oppmerksomhet uten forsinkelse. De tekniske rådene som følger med cellelinjene bør konsulteres før ampullene fjernes fra tørisen. Korrekt håndtering umiddelbart etter mottak er avgjørende for å kunne etablere cellelinjen i sluttbrukerens laboratorium.

når en cellelinje er bestilt, bør sluttbrukere også vurdere kulturforholdene for den nye cellelinjen og sørge for at riktig medium vil være tilgjengelig når cellene kommer.

Betydningen Av Celletelling

Utfør et levedyktig celletall når du gjenoppliver og høster cellekulturer. En av de vanligste årsakene til manglende etablering av celler i kultur skyldes bruk av feil levedyktig cellesåd tetthet ved gjenoppliving dvs. seeding celler for lav eller for høy. Dette kan unngås ved å utføre et levedyktig celletall og følge den anbefalte såddtettheten.

for den spesifikke cellelinjen du jobber med, les informasjonen som er gitt under Fanen Beskrivelse på vår nettside. Denne informasjonen kan også bli funnet I Cellelinjedatabladet, som vil bli gitt til deg som en papirkopi med cellelinjeforsendelsen. Seeding tettheten er vist i subkultur rutinemessig informasjon. Når seeding celler umiddelbart etter gjenoppliving, bruke midten til øvre enden av seeding tetthet området gitt.

Resuscitation Av Frosne Celler

det er viktig å håndtere frosne ampuller med forsiktighet; bruk laboratoriefrakk, full beskyttende ansiktsmaske og hansker. I sjeldne tilfeller kan ampuller eksplodere ved oppvarming på grunn av utvidelse av fanget gjenværende flytende nitrogen.

1. I et mikrobiologisk sikkerhetsskap, hold et vev fuktet i 70% alkohol rundt hetten på den frosne ampullen. Vri hetten en kvart omdreining for å frigjøre gjenværende flytende nitrogen som kan bli fanget. Trekk til hetten igjen. Overfør ampullen raskt til et 37oc vannbad til bare en eller to små iskrystaller, hvis noen, forblir (1-2 minutter). Det er viktig å tine raskt for å minimere skade på cellemembranene.
merk: ikke senk ampullen helt ned, da dette kan øke risikoen for kontaminering.

2. Tørk ampullen med et vev fuktet i 70% alkohol før åpningen.

3. Pipett hele innholdet i ampullen i et sterilt rør(f. eks. 15 ml kapasitet). Deretter tilsettes sakte 5 ml forvarmet medium som allerede er supplert med de riktige bestanddelene. Bestem levedyktig celletetthet ved hjelp av trypan blå flekk, et hemocytometer og et invertert mikroskop for å telle cellene eller tilsvarende celletellingsmetode. Overfør riktig volum av cellesuspensjon for å oppnå cellesåd tetthet anbefalt på cellelinjen dataregistrering.

For vedheftende cellelinjer: Juster volumet av mediet, og om nødvendig kolben størrelse, for å oppnå cellesåd tetthet anbefalt på cellelinjedatabladet. Et forhåndssentrifugeringstrinn for å fjerne kryobeskyttende middel er normalt ikke nødvendig, da den første medieskiftet vil fjerne resterende kryobeskyttende middel. Hvis det er, vil dette bli spesifisert på databladet. Hvis cellene skal brukes umiddelbart (f.eks. for en cellebasert analyse), i stedet for subkulturert, kan det være tilrådelig å utføre et forhåndssentrifugeringstrinn for å fjerne kryobeskyttende middel.

for suspensjonscellelinjer*: et forhåndssentrifugeringstrinn for å fjerne kryobeskyttende middel anbefales, dvs. pellets cellene ved sentrifugering ved 150 x g i 5 minutter og resuspend cellepellet i friskt medium ved hjelp av riktig volum for å oppnå riktig såddtetthet.

1. Inkuber kolber ved temperatur og CO2-nivå som anbefales på databladet. Hvis EN CO2-matet inkubator brukes, bør kolben ha en ventilert hette for å tillate gassformig utveksling.

Hybridomkulturer Fra Frossen

når hybridomkulturer gjenvinnes fra frosne er det ikke uvanlig at veksten til å begynne med går saktere enn forventet, og det kan være en observert reduksjon i levedyktighet. Etablering av en aktivt spredende kultur kan ta opptil 2 uker.

ved gjenopplivning er et sentrifugeringstrinn for å fjerne kryobeskyttelsesmiddelet avgjørende. Tin raskt den frosne ampullen i et vannbad ved 37°C i 1-2 minutter. Overfør innholdet til et sentrifugerør og tilsett sakte 5-10 ml forvarmet vekstmedium+. Fjern en prove for telling. Sentrifuge ved 100 x g i 2-3 minutter til pelletceller og frø ved en relativt høy tetthet på 5-7 x 105 celler / ml. Plasser kultur kolbe flat og observere regelmessig til levedyktige prolifererende celler er sett.

+ofte hybridom kulturer kan ha nytte av å bli resuspendert med media supplert med 20% FBS i tidlig kritisk fase av kultur etablering umiddelbart etter gjenoppliving.

Prosedyre For Frysing Av Celler

ECACC anbefaler å fryse et lager av cellelinjen din kort tid etter mottak (mellom 2 – 4 x 106 celler / ml) som en forholdsregel.

følgende veiledning tilbys for forberedelse og kryopreservering av cellelinjer.

1. Høst cellene i loggfasen av vekst på samme måte som brukes til rutinemessig subkultur. For adherente cellelinjer, høste så nær 80-90% confluency, som mulig.

2. Standardprosedyren er å bruke 90% serum + 10% kryobeskyttende middel for alle cellelinjer med mindre annet er angitt på databladet. Tillat 1 ml for hver ampulle. De fleste cellelinjer kan fryses i passende kulturmedium supplert med 20% serum og 10% kryobeskyttende middel. DETTE er VANLIGVIS DMSO, men i visse tilfeller anbefales glyserol. HVIS DMSO ikke er egnet, vil et alternativ bli spesifisert på Cellelinjedatabladet.

3. Pellet celler ved sentrifugering f. eks 150 x g i 5 minutter. Resuspend cellepellets i passende frysemedium for å gi en endelig cellekonsentrasjon mellom 2 – 4 x 106 celler / ml og pipette 1 ml i hver ampulle.

4. Frys cellene med en kjølehastighet mellom 1-3oC / min ved hjelp av en programmerbar hastighetsstyrt fryser eller egnet alternativ1. Når temperaturen når minst-130oC, overfør ampullen til et gassfase flytende nitrogenlagringsfartøy.