Gap junction protein Connexin-43 Er en direkte transkripsjonell regulator Av N-cadherin in vivo

embryo manipulasjon

Voksen X. laevis ble opprettholdt på 17 °C Og brukt i henhold Til forskriftene Til Den Biologiske Serviceenheten Ved University College London, i samsvar MED STORBRITANNIAS Retningslinjer For Hjemmekontor fastsatt I Dyreloven 1986 som beskrevet 45. X. laevis embryoer ble oppnådd og iscenesatt som tidligere beskrevet46, 47. For å spesifikt målrette nevrale kammen ble embryoer injisert i dyrets ventrale blastomerer i åttecelletrinnet på den ene siden for alle eksperimenter, unntatt når embryonale lysater ble brukt. I dette tilfellet ble embryoer injisert i begge dyr sider av to-celle stadium embryoer. Embryo mikroinjeksjoner ble utført i henhold til48. Om nødvendig ble fluorescein-dekstran (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) eller rhodamin-dekstran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) brukt som sporstoffer. Oligomorfolinos mot X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘- TTCCTAAGGCACTCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTTGTGGGGTCGA – 3′) OG BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-Aacggaccgggtttaaaggcttcct-3′) ble syntetisert og levert Av Gene Tools LLC. Equimolare konsentrasjoner av standard kontroll morpholino (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5’) ble brukt. Mengdene av morpholinos tilsvarer mengdene injisert i den ene siden av åtte-celle stadium embryoer, mens den andre siden ble brukt som en intern kontroll. Når embryoer ble brukt til innsamling av embryonale lysater, ble de injisert i to-celle stadium i begge dyreblastomerer og dobbelt av de nevnte dosene ble brukt. For å teste effektiviteten Av Cx43MOs på den endogene cx43 mRNA, utførte vi western blot analyse. Begge Cx43MOs senket effektivt proteinnivåene av den endogene Cx43FL og Cx43iso (Fig. 3a, b). For å validere BTF3MO effektivitet, vi testet ved immunostaining av nevrale crest celler BTF3 protein uttrykk, som viste reduserte nivåer AV BTF3 I BTF3MO celler sammenlignet MED CTLMO (Supplerende Fig . 3a).

in situ hybridisering ble utført som tidligere beskrevet49, 50. Kort fortalt ble embryoer festet i MEMPFA, etterfulgt av over natten hybridisering med digoksigenin-merkede prober, inkubert med ET AP-antistoff og AP-aktivitet ble utviklet ved BRUK AV NBT / BCP-substrater. Digoxigenin-merkede RNA-prober ble forberedt for foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22) og sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0.8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml), og vri (0.7 µg/ml) ble brukt for å vurdere nevrale crest induksjon, vri (0.7 hryvnias/ml) for migrering av nevralkammer, n-cadherin (1 hryvnias/mL) for å vurdere uttrykksnivåer og btf3 (0,7 hryvnias/mL) uttrykksmønster. Helmontert immunosteining ble utført som tidligere beskrevet55 ved Bruk Av cx43 antistoff (1: 1000, Sigma, C6219). Kort sagt ble embryoer festet i MEPMFA og inkubert over natten med antistoffet ved den beskrevne fortynningen.

animal cap explants ble dissekert Fra Xenopus blastulas (trinn 8) ved hjelp av en standardteknikk 48, 56 og forberedt for in situ-hybridisering som beskrevet ovenfor. For dyr cap analyser, ble 500 pg mRNA injisert i dyresiden av de to blastomerer av to-celle stadium embryoer. Analyse AV ISH ble utført på 20-25 embryoer per tilstand for hvert uavhengig eksperiment.

manipulering og avbildning Av nevrale kam

transplantasjoner av Nevrale kam ble utført som tidligere rapportert57. Kort sagt, neural crest tatt fra stage 18 fluorescently merkede embryoer ble dissekert med øyenbryn kniver og podet inn umerket verts embryoer. For in vitro eksperimenter ble kraniale nevrale kameksplantater dissekert i trinn 18 ved hjelp av en standardteknikk 58,59 og belagt på fibronektin (Sigma, F1141) belagte retter som tidligere beskrevet53. For enkeltcelleanalyser ble nevrale kamceller kort dissosiert I Ca2+/Mg2 + -fri Danilchick medium53. For hver tilstand ble ti embryoer transplantert med fluorescerende merket NC analysert per eksperiment.

Immunosteining ble utført på nevrale crest explants som tidligere beskrevet54 ved bruk av anti-n-cadherin (1: 50, rat IgG, klon MNCD2, DSHB), anti-e-cadherin (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Imaging av in vitro neural crest migrasjon ble utført ved hjelp av time-lapse kinematografi som beskrevet tidligere53, 60. Kort sagt, nevrale kamceller ble dyrket i plast eller glass petriskåler belagt med fibronektin, og time-lapse microcopy ble startet etter en time med in vitro kultur. For cellemotilitet og migrasjon ble sammensatte mikroskoper (Enten Et Eclipse 80i Nikon-mikroskop med Et Hamamatsu Digitalkamera eller ET DMRXA2 Leica-mikroskop med Et Hamamatsu Digitalkamera styrt Av Enkelt PCI-program) utstyrt med motoriserte trinn og en 10×/0.30 NA tørr linse. Nc kulturer ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Bilder ble anskaffet hvert 5. minutt i en periode på 12 timer. FOR cellemorfologi–bildebehandling ble DET brukt ET TCS SP8-mikroskop med en 63 × /0.90 NA vanndypemålobjektiver og kontrollert AV LAS-AF-programvare. Faste celler ble avbildet ved hjelp av en 63 × /1.4 NA olje nedsenking mål og En Leica TCS SPE confocal mikroskop kontrollert AV LAS-AF programvare.

for konstruksjonslokalisering ELLER endogene IF-nivåer ble 10-15 NCCs analysert for hver tilstand per eksperiment.

analyse Av cellemigrasjon og cellemorfologi

Kjemotaksianalyse ble utført etter en standard prosedyre61 ved bruk av heparin akrylperler (Sigma, H5263) belagt med 1 µ/mL renset human stromalcellederivert faktor-1 (Sigma, SRP3276). Cellemotilitet og kjemotaksis ble analysert ved Hjelp Av ImageJ (https://imagej.nih.gov) analyseverktøy, som beskrevet tidligere53, 60. Kort sagt, hver enkelt celle ble manuelt sporet ved Hjelp Av Manuell Sporing plugin Av ImageJ, ble dataene samlet inn og analysert ved Hjelp Av Chemotaxis plugin Av ImageJ. Cellemorfologi ble vurdert ved å distribuere sirkulasjonsindeksen (complete circle = 1) og estimert Av ImageJ analyseverktøy. Celledispersjon ble analysert Ved Hjelp Av Delaunay triangulering algoritme (ImageJ Plugins) og ble plottet som gjennomsnittlig explant trekant område, som beskrevet før54. Cell protrusive området ble analysert i nevrale crest celler på kanten av en explant måle outgrowing området som stammer fra to påfølgende tidsrammer med 4 min tidsintervall; disse to påfølgende rammer ble trukket fra for å generere den nye area12. For analyse av cellekjemoterapi og celledispersjon ble 10-15 eksplanter analysert per betingelse for hvert uavhengig eksperiment. For cellemotilitet ble cellemorfologi og celleprojeksjoner 15-25 NCCs analysert per tilstand per eksperiment.

Molekylærbiologi, plasmider og reagenser

for cDNA-syntese ble totalt RNA isolert fra 10-15 embryoer trinn 23-24 eller 10-15 dyrekapsler trinn 8 Fra X. laevis per betingelse for hvert uavhengig eksperiment og tre tekniske replikaer ble brukt innen hvert eksperiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) som mal. Full lengde Cx43 (cx43fl, aa 1-379), Cx43 carboxy terminalt avkortet konstruksjon (Cx43Trunc, aa 1-212) Og Cx43-20k konstruksjon (cx43tail, aa 213-379) ble klonet i 5 ‘Bamhi/3’ Xhoi av pCS2+ eller pCS2-EGFP vektorer. PCS2-EGFP-vektoren ble vennlig levert Av Dr. Masa Tada. Inducible konstruksjon Av Cx43Tail ble fremstilt ved å fusjonere Cx43-20ktail (aa 219-379) til ligand-bindende domene av human GR (aa 512-777). Cx43-20k ble klonet til 5 ‘Ecori / 3’ Aci og GR til 5 ‘Aci/3’ Xhoi av pCS2 + og pCS2-EGFP. BTF3 konstruksjoner ble syntetisert Ved Hjelp Av X. laevis sekvens fra cDNA klone (UniGene ID XL.3536). BTF3FL (aa 1-162) ble klonet i 5 ‘Ecori / 3’ Xhoi av pCS2 + eller pCS2-EGFP. BTF3 sletting konstruere mangler nls regionen RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) ble klonet i 5 ‘Bamhi / 3’ Clai av pCS2+. For BiFC eksperimenter (Fig. 4b, c), Cx43Tail og Cx43Trunc ble klonet til 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi av pCS2-VC155. BTF3FL ble klonet i 5 ‘Bamhi / 3’ Bamhi av pCS2-VN9m. BiFC vektorer ble vennlig levert Av Prof James C. Smith. Alle konstruerte sekvenser er verifisert av automatisert DNA-sekvensering (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ 213 CX43 (800 pg/embryo,63).

all analyse på fluorescerende konstruksjoner ble vurdert ved normalisering til bakgrunnen fluorescens og ved behov, til totalt celleområde fluorescens.

følgende reagenser ble brukt: flufenamic syre (50 µM for NC explant inkubasjon −100µM for fosteret behandling, Sigma, F9005), meclofenamic syre (50 µM for NC explant inkubasjon −100µM for fosteret behandling, Sigma, M4531), actinomycin D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) og etanol-oppløst dexamethasone (10 µM) ble lagt til kultur medium på stadier 14-15 og opprettholdes til nevrale crest vandrende embryonale stadier (stage 23). For å kontrollere mulig lekkasje av induserbare kimærer ble en søskenbatch embryoer dyrket uten dexametason og behandlet for in situ hybridisering. For koblingstest (testing gap junction channel activity) ble 10-15 NCCs analysert per tilstand per eksperiment.

Immunoprecipitation, fraksjonering og western blotting

for hver tilstand ble 10-15 embryoer brukt til fremstilling av embryolysater per eksperiment. Hele embryoer ble tilberedt for western blot etter homogenisering i lysisbuffer (20 Mm Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-x, pH 8,0) med ekstra proteasehemmere (Roche, 11836153001) og fosfatasehemmere (Roche, 04906837001)54,64. For western blots ble følgende antistoffer brukt: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); kort tid ble cellene suspendert i lysisbuffer og sentrifugert ved 20 000×g i 5 min ved 4 °C, supernatanten ble gjenfunnet og volumet justert med fortynningsbuffer. Perler ble equilibrated i fortynning buffer og blandet med resuspendert celle lysat. Blandingen ble magnetisk renset og forberedt for western blot. Nuclear fraksjon isolering Av x. laevis embryoer ble utført ved hjelp av differensial sentrifugering protokoller med modifikasjoner64,65. Kort, trinn 18 X. laevis embryolysater ved bruk av en 22 g kanyle og 20 µ homogeniseringsbuffer (HB: 250 mM sukrose, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, fosfatase og proteasehemmere) per embryo. Alle prøvene ble sentrifugert ved 250×g i 5 min for å fjerne embryo rusk. Etter oppsamling av supernatanten ble den distribuert til tre forskjellige rør og spunnet med tre forskjellige hastigheter (400×g, 600×g) i 5 min for å isolere cellekjernene. Postnuclear supernatanter ble holdt for videre behandling. Kjernepelletene ble igjen vasket i buffer HG og sentrifugert med riktig hastighet (400×g, 600×g). Kjernepellets ble deretter resuspendert i 40 µ 10% glyserol / 0,1% SDS / 1% Triton-X i HB. Passende mengde prøvebuffer ble tilsatt til hver prøve, og prøver ble behandlet for akrylamidgelelektroforese og western blot-analyse. For å unngå lastefeil ble den samme membranen blottet mot lastekontrollen etter stripping som beskrevet før54, 64.

Western blot data ble analysert Ved Hjelp Av ImageJ analyseverktøy. Bildeintensiteter ble normalisert og forholdet mellom proteinet av interesse for belastningskontroll (dvs., Mapk eller α-tubulin) ble beregnet, gjennomsnittlige forhold ble plottet. Uncropped blots er inkludert som supplerende tall (Supplerende Fiken. 5–7).

Cellekulturer

HeLa-celler (Leibniz Instituttets Samlinger Av Mikroorganismer OG Cellekultur, DSMZ, Tyskland) ble dyrket I DMEM supplert med 10% føtal kalv serum (Life Technologies, CA, USA) ved 37 °C i en fuktig atmosfære på 10% CO2 og transfisert som angitt Ved Hjelp Av Rotifect (Carl Roth, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.

Xenopus embryonale fibroblaster (XTC, en slags gave Fra Ana Losada) ble dyrket i 67% DMEM / H2O supplert med 10% føtalt kalveserum ved 25 °C i en fuktet atmosfære på 5% CO2 og transfisert som indikert ved Bruk Av Viafect (Promega, USA). Plasmider for transfeksjon var som indikert og 10-20 Hela-eller XTC-celler ble analysert for hver tilstand per eksperiment.

for siRNA-eksperimenter ble en kombinasjon av tre siRNA rettet mot BTF3 transfisert som beskrevet ovenfor. En standard siRNA (scrambled siRNA fra Sigma) ble brukt som en kontroll. Katalognummer for disse kommersielle siRNA mot BTF3 er: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Celler ble samlet 48 h etter transfeksjon og behandlet for qPCR, western blot, Eller Immunhistokjemi eksperimenter. Som beskrevet i de respektive avsnittene.

alle cellelinjer ble testet for mykoplasmaforurensning.

Immunhistokjemi og falloidinfarging

for proteindeteksjon ble pattedyrceller eller nevrale kameksplantater festet i 4% formaldehyd i 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) i 10 minutter og blokkert med 10% NGS i 1 time. Primære antistoffer ble inkubert ved 4 °C i 10% NGS. Følgende antistoffer ble brukt: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µ/ml anti-n-cadherin (MNCD2 Utviklingsstudier Hybridoma Bank), og 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) i 10% NGS og inkubert på ved 4 °C. Eksplanter ble vasket 3 ganger MED PBS + 0,2% Tween-20 og inkubert på ved 4 °C med sekundært antistoff, fortynnet ved 1:350 i 10% ngs. DAPI ble fortynnet ved 1: 1000 og blandet med sekundære antistoffer.

Massespektrometri

for koimmunopresipitasjon Av Den FLAGGMERKEDE Cx43Tail for massespektrometriske analyseceller ble lysert og lysater ble inkubert over natten med anti-HA og ekvilibrerte høyaffinitetsperler ved 4 °C, ble immunopresipitatene deretter vasket og eluert27. Etter syreeluering med 0,1 m glysin pH 2,5 ble eluatenes pH justert til pH 8,0 med 0,5 M Tris. For proteinfordøyelsesprøver ble inkubert over natten med 2 µ trypsin (Trypsin Gold, Promega, USA) etterfulgt av tilsetning av 0.1 µ Lys-C (Roche, Tyskland) og inkubasjon for ytterligere 6 timer. peptidene ble avsaltet På C – 18 reverserte fasetrinnspisser (Nest Group, USA), tørket i vakuum og lagret ved -20 °C til analyse. Tørkede peptidblandinger ble gjenfunnet i 3 µ 30% maursyre og fortynnet med vann til 23 µ. Fem µ av sammendraget ble injisert på Et Nano-Lc-system (Eksigent425 2d Nano-LC; Sciex, USA) og peptider ble separert med reversert fasekromatografi på C-18 kolonner utarbeidet internt (Reprosil-Pur C18-AQ, 1.9 µ, Dr. Maisch, Tyskland, PicoFrit Kolonner, 75 µ i.d., New Obejctive, USA) i en lineær gradient på 100% eluent A (0,1% maursyre) til 55% eluent B (60% actenitril, 0,1% maursyre) i 120 min. LC-systemet ble satt opp som ventilert kolonne og prøven ble last og avsaltet ved en strømningshastighet på 400 nl / min og separasjon ble utført ved en strømningshastighet på 200 nl / min. Nano-lc-systemet ble bindestreket til massespektrometeret (Q-Exactive HF, ThermoScientific, Tyskland) som ble operert i dataavhengig modus. Datatolkning ble utført med Mascot V2.2 (Matrixscience, UK) og Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK). Data tolkning ble utført Med MaxQuant V1.6.1.0 Og Perseus V1.6.1.3 (Mpi Av Biokjemi, Tyskland).

Koblingsanalyse

Gap junction intracellulær kommunikasjon ble testet ved hjelp av en fargestoff koblingsanalyse. Her ble det fluorescerende fargestoffet Calcein-AM (Sigma, 17783) brukt. En neural crest populasjon dissekert fra uinjiserte embryoer ble inkubert med fargestoffet Calcein-AM i omtrent 10 min eller til fargestoffet ble lastet inn i alle cellene. En annen neural crest populasjon fra embryoer injisert med en nukleær markør (nRFP mRNA injeksjoner, se ovenfor) ble dissekert separat. Etter at de to populasjonene ble dissosiert i fravær av kalsium og magnesium, ble de blandet og inkubert i 1 time ved 14 °C i et reagensrør. Etter mild sentrifuge, nevrale crest explants ble kuttet i tilsvarende størrelse stykker og dyrket som beskrevet ovenfor, og deretter filmet. For å teste kanalaktiviteten til gapskryss, gapskryss blokkere; meklofenaminsyre (Sigma, M4531) og flufenaminsyre (Sigma, F9005) ble brukt. Cellekommunikasjon ble vurdert ved å estimere forholdet mellom antall celler som viser både sporstoffer, nukleærmarkøren og Kalseinet til det totale antall celler som har nukleærmarkøren.

Statistisk analyse

estimeringen av utvalgsstørrelsen ble gjort ved å følge tidligere publisert arbeid og ingen spesifikk statistisk metode ble brukt. Eksperimenter ble ikke randomisert, og på grunn av forsøkets natur ble forfatterne ikke blindet for allokering under både eksperimenter og resultatanalyse. Bare levedyktige embryoer og explants ble analysert. Feilinjiserte embryoer ble ikke inkludert for in situ hybridiseringsforsøk. Korrekt injeksjon ble bestemt ved injeksjon av lineære sporstoffer. Våre eksperimentelle parametere ble målt tilfeldig når levedyktige og riktig injiserte embryoer ble valgt.

Sammenligning av prosenter ble utført ved hjelp av beredskapstabeller66. Normalitet av datasett ble testet Ved Hjelp Av Kolmogorov-Smirnovs test, D ‘ Agostino og Pearsons test og Shapiro-Wilks test ved Hjelp Av Prism6 (GraphPad). Datasett etter normalfordeling ble sammenlignet Med Studentens t-test (to-tailed, ulik avvik) ELLER ANOVA med en dunnetts flere sammenligninger etter test ved Hjelp Av Excel Eller Prism6 (GraphPad). Datasett som ikke fulgte en normalfordeling ble sammenlignet Med Mann Whitneys test Eller en nonparametric ANOVA (Kruskal Wallis med Dunns multiple sammenligninger post-test) ved Hjelp Av Excel Eller Prism6. Kryss-sammenligninger ble utført bare hvis den totale p-verdien AV ANOVA var mindre enn 0,05. I alle figurlegender n = antall uavhengige eksperimenter; n = total prøvestørrelse.

X. laevis n-cadherin partial promoter identification

for å identifisere Grunnleggende promoter Av Xenopus n-cad brukte vi følgende strategi. Den grunnleggende promoter regionen fra chick og pattedyr n-cadherin gener har blitt beskrevet på 5 ‘ – UTR regioner, i posisjon -3000 til -1 bp respektere oversettelse initiering site41, 67. Ved Å bruke X. Laevis Genome Project resource (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) identifiserte vi en region på 2800 bp i 5 ‘ – UTR Av x. laevis n-cadherin genet (Supplerende Fig. 4). Siden våre data indikerer At CX43TAIL, BTF-3 og Pol II danner et kompleks, bruker Vi ElemeNT tool68 for å søke etter potensielt aktive TATA-bokser i regionen som vi isolerte. Vår i silico analyse avsløre EN TATA boks rik region mellom posisjonene -166 til -618 bp, i forhold til oversettelse start site (Supplerende Fig. 4). Til slutt designer vi overlappende primere for å forsterke fragmenter av 200 bp over hele denne regionen. Primers sekvenser er oppfort i ChIP-delen og deres bindende regioner er uthevet I Supplerende Fig. 4.

Kromatinimmunprecipitasjon (ChIP)

for kromatinimmunprecipitasjon (ChiP) fulgte vi en standard prosedyre For x. laevis embryos69, 70. For hvert uavhengig eksperiment brukte vi to tekniske replikaer og 250-300 Xenopus-embryoer per tilstand. Kort fortalt ble neurula stages X. laevis-embryoer fikset i 15 min og 3 µ Av Pol II-antistoff (Diagenode, C15100055) eller GFP-ChIP-antistoff (Abcam, ab290) ble brukt. FOR DNA-ekstraksjon fulgte vi en standard protokoll69, 70. Ved Hjelp Av Elementanalyseressursen søkte vi etter antatte tata-bokser I X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′-GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

og deres relative bindingssteder er vist I Supplerende Fig. 4b. ChIP eksperimenter ble kvantifisert som følger: normalisert forholdet mellom bandet intensitet for hver tilstand var i gjennomsnitt det og fold økning respekt IgG kontroll ble beregnet og plottet som fold berikelse. Band intensitet ble registrert ved Hjelp ImageJ Gels analyse plugin. Uncropped geler er vist I Supplerende Fig. 7c, d.