Genom-bred analyse av kondensinbinding I Caenorhabditis elegans

Kondensiner i og II deler DE TO SMC-underenhetene MIX-1 og SMC-4, og er preget av tre ikke-SMC-underenheter (Figur 1a). Kondensin IDC skiller seg fra kondensin I med bare en underenhet, smc-4 varianten DPY-27. Vi brukte en eller to forskjellige antistoffer mot hver kondensin-underenhet For ChIP-seq og identifiserte de bindingsstedene som var vanlige i flere antistoffer og biologiske replikater (Tilleggsfil 1: Tabell S1). Antistoffvalidering og forventede samimmunopresipitasjonsinteraksjoner fra kondensin holocomplex er presentert I tilleggsfil 2. Parvis korrelasjon av median ChIP-berikelse score gruppert kondensin I-IDC og II underenheter separat, bekrefter fordelingen av individuelle underenheter mellom de tre kondensintyper (Figur 1b).

høyoppløselige bindingsmønstre av de tre kondensinkompleksene er like

C. elegans kondensin I OG II har delvis overlappende, men forskjellige kromosomale lokaliseringer i mitose og meiose , og kondensin IDC er spesielt rettet Mot X . Derfor forventet vi å finne forskjellige ChIP-seq-mønstre for kondensin I, IDC OG II. i Stedet var bindingsmønstre av kondensin I, IDC og II-underenheter generelt like (Figur 1c). Denne likheten skyldtes ikke antistoffkryssreaktivitet, fordi HCP – 6-antistoffet , som ikke viser noen kryssreaktivitet og ikke immunopresipiterer noen kondensin I-IDC-underenhet, viste omfattende ko-lokalisering med kondensin I-IDC-underenheter (se HCP-6 I Figur 1c). I tillegg, hvis overlappingen av kondensin II skyldtes kryssreaktivitet med kondensin IDC, ville vi ha forventet en anrikning av kondensin II bindingssteder På X, noe Som ikke var tilfelle (Figur 1d). Sammenlignet med kondensin II, kondensin IDC subenheter konsekvent hadde høyere ChIP score På X, noe som tyder på en forskjell i kromosom foreningen av de to kondensin komplekser som fanget Av ChIP(merk ulike skalaer På X og kromosom I I Figur 1c). Siden Vi utførte ChIP-seq i blandede trinnembryoer,var de fleste cellene (mer enn 95% estimert med 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) – farging) i interfase. Mangelen på kondensin I-underenheter på autosomer (Figur 1C og Tilleggsfil 3: Figur S1A) og den forrige observasjonen at kondensin i lokaliserer til mitotiske kromosomer etter kjernefysisk konvoluttbrudd tyder på at det meste Av ChIP-seq-signalet er fra interfase. Til støtte for dette ble kondensin II vist å være nukleær under interfase, og viste en mer lik fordeling av bindingssteder mellom alle kromosomer (Figur 1d).

KLE-2, HCP-6 OG CAPG-2 er kondensin II-spesifikke, og representerer dermed kondensin II-binding. Kondensin I og IDC deler alle tre ikke-SMC-underenheter, så heretter refererer vi Til ChIP-seq-signalet FRA DPY-26, DPY-28 og CAPG-1 som fra kondensin I-IDC. For å fokusere på områdene som er bundet som et komplekst, gjennomsnitt vi ChIP signal fra kondensin-type spesifikke CAP underenheter. I tillegg til å bruke gjennomsnittlig data, vi bekreftet at hver analyse holdt sant med enkle underenheter, og vi presenterer HCP-6 OG DPY-28 i supplerende tall. Vi identifiserte et sett med høy konfidens kondensin I-IDC og II bindingssteder ved å velge bare De ChIP-seq-toppene som var konsistente over to eller flere ikke-SMC-underenheter (Figur 1d). Som nevnt tidligere skjedde 97% av kondensin I-IDC-bindingen på X-kromosomet . Kondensin II ble tilsvarende fordelt mellom autosomer Og X. Kondensin II bundet til sterkere kondensin I-IDC-steder på X-kromosomet (Figur 1e og Tilleggsfil 3: Figur S1B).

Kondensinbindingssteder er beriket med aktive promotorer

for å identifisere områdene der kondensiner fortrinnsvis bindes, analyserte vi kondensinbindingssteder med hensyn til flere genomiske merknader. Kondensinbindingssteder ble signifikant beriket på promotorer, nær tRNA-gener og ikke-kodende Rna (Figur 2a, Tilleggsfil 4: Figur S2). For å eliminere muligheten for at kondensinbundne trna-gener bare forekommer hos promotorer, fjernet vi trna-gener som var innenfor 1 kb av et transkripsjonsstartsted (TSS) og fastslått at overlappingen av tRNA og kondensinbindingssteder forblir signifikant (23% og 6% av trna overlappes med henholdsvis kondensin I-IDC og II-steder, p = 0,0002). Kondensinbinding ved trna-gener antyder AT TFIIISK-mediert kondensinrekruttering kan konserveres mellom c. elegans og gjær .

Kondensinsider er beriket på promotorer og trnaer, og binding korrelerer positivt med transkripsjon. (A) Anrikning eller uttømming av kondensinbindingssteder ved ulike genomiske merknader er gitt. Tilfeldig berikelse og p-verdier ble beregnet ved en permutasjonstest som tilfeldig fordelte kondensatoppene 10.000 ganger. For både kondensin I-IDC OG II er det en betydelig berikelse av bindingssteder på 1 kb-promotorer og nær ikke-kodende Rna (P = 0.0002), uttømming i genlegemer (transkripsjonsstartsted (tss) til transkripsjonsstartsted (tes)) (P = 0,0002), og ingen signifikant anrikning eller uttømming ved 3 ‘ av gener (P > 0,05). (B) Kondensasjonsbrikkesignalet er justert Ved TSSs av uttrykte gener (topp 25% AV RNA-nivå, faste linjer) og ikke uttrykte gener (bunn 25% AV RNA-nivå, stiplede linjer). De omkringliggende punktene representerer 95% konfidensnivået. Som en kontroll, er immunglobulin G (IgG) ChIP signal På TSSs plottet i grått. (C) Spearman rank korrelasjonskoeffisient mellom Median ChIP score på 500 bp arrangører OG RNA nivå på respektive gener er gitt for hele genomet og X-kromosomet. Det er en liten positiv korrelasjon mellom kondensinbinding og transkripsjon. (D) Median ChIP score innen 500 bp oppstroms FOR TSS er plottet mot RNA-nivaet av hvert gen. Gener bundet av kondensinpromotor (definert ved overlapping med et kondensinområde innen 1 kb av TSS) er uthevet i oransje (kondensin I-IDC) og blå (kondensin II). (E) GC innhold av 50 bp vinduer er plottet over kondensin I-IDC OG II bindende toppmøter. SOM en kontroll ble GC-innholdet over 1500 tilfeldige koordinater bestemt og plottet på samme måte som de faktiske kondensin-toppene. Gjennomsnittlig GC-innhold er høyt rundt toppen av kondensinbindingen.

Bindingen var høyest innen 500 bp AV TSS (Tilleggsfil 5: Figur S3A) og 45% av kondensin I-IDC og 62% av kondensin II-toppene ble plassert på promotorer. Kondensinbinding hos promotorer korrelerte positivt med transkripsjonsaktiviteten til nedstrømsgenet (Figur 2b, C), men ikke alle aktive promotorer var bundet (Figur 2d). Gene Ontology term analyse av bundne promotorer viste en liten (1,3 ganger) men signifikant (P = 3,5 e-17) anrikning for gener med embryoutviklingsfunksjon (Tilleggsfil 6: Tabell S2). Omtrent 20% av høyt uttrykte gener (toppkvartil ved RNA-nivå) hadde et kondensin II-bindingssted innen 1 kb, og omtrent 70% Av X-kromosomgener hadde et kondensin I-IDC-bindingssted innen 1 kb. Derfor, selv om transkripsjonell aktivitet er viktig, er det ikke tilstrekkelig å forklare spesifisiteten av kondensinbinding hos visse promotorer.

vi la merke til at alle kondensbindingssteder viste en fremtredende anrikning av GC-innhold sammenlignet med omkringliggende regioner og tilfeldige koordinater (Figur 2e). I c. elegans ER GC-innholdet Av x-kromosompromotorer høyere enn for autosomale promotorer . Det er mulig at høyere GC-innhold er EN DNA-sekvensfunksjon for kondensinbinding, Og X-promotorer utviklet seg til å inneholde høyere gc-innhold for å støtte kondensin IDC-binding.

Kondensinbindingssteder sammenfaller signifikant med en delmengde av transkripsjonsfaktorer

for å bestemme tilleggsfaktorer som skiller kondensinbundne promotorer, sammenlignet vi kondensin-og TF-bindingssteder, og fant en delmengde Av TFs som bundet til de samme promotorene som kondensiner (Figur 3A). Tidligere studier viste at flere TFs binder seg til et sett med høy belegg bindingssteder (HOT) . Det var en overlapping på henholdsvis 5% og 22% av kondensin I-IDC og kondensin II med VARME områder (p = 0,0002). Betydningen av overlapping med TFs forblir den samme når VARME steder ble eliminert fra analysen (Tilleggsfil 5: Figur S3B). Prosenter av overlapping for HVER TF avhengig av antall bindingssteder, og er vist I Tilleggsfil 5: Figur S3C. Blant individuelle tfs, vi fant at 69% av kondensin II områder og 53% AV LIN-13 områder overlappet med hverandre, noe SOM GJØR LIN-13 den øverste TF som i betydelig grad overlappet med kondensin II.

Kondensin ii-binding overlapper med transkripsjonsfaktorer ikke-tilfeldig, og uttrykksanalyse antyder en repressiv funksjon for kondensin II. (A) Transkripsjonsfaktorsteder fra modENCODE er rangert etter fold-anrikningen av overlapping med kondensinbindingssteder. Fold berikelse bestemmes som forholdet mellom prosentvis overlapping i observert versus gjennomsnitt av tilfeldige fordelinger av kondensinsider 10.000 ganger over genomet. Resultatene indikerer at kondensinbinding ikke er tilfeldig med HENSYN TIL tf-bindingssteder. (B) Venn-diagrammer viser overlappingen av kondensin II-bindingssteder med LIN-13 (modENCODE_3342, embryoer) OG LIN-35 (modENCODE_3925, sene embryoer) (øverst), KUN LIN-13 (nederst til venstre) og KUN LIN-35 (nederst til høyre). Andelen overlapping mellom kondensin II OG LIN-13 OG LIN-35 er høyere på steder som er opptatt av begge proteiner. Den gitte overlappingen representerer antall kondensin II-topper som overlapper MED DE respektive LIN-13 OG LIN-35-stedene. (C) Gjennomsnittlig ChIP-seq-anrikning fra kondensin II, LIN-13 OG LIN-35 er plottet over toppen av hver kondensin II-topp. Kondensin II bindingssteder er delt inn i fire grupper. Den øverste gruppen består av kondensin II bindingssteder overlappende MED LIN-13 OG LIN-35, den andre overlapper MED LIN-13 bare, den tredje MED LIN-35 bare OG den siste gruppen overlapper ikke MED ENTEN LIN-13 ELLER LIN-35. Toppene er i avtagende rekkefølge basert på Deres Chipberikelse. Et stort antall kondensin II-steder viser høy LIN-13, MEN IKKE LIN-35, bindende. Kondensin ii binding er sterkere på steder bundet AV BÅDE LIN-13 OG LIN-35. (D) Differensial ekspresjonsanalyse (RNA-seq) i kle – 2 null heterozygot versus homozygot larvestadium 2/3 (L2/L3) larver. Andelene av gener bundet eller ubundet AV KLE-2 med økning eller reduksjon i transkriptnivå i homozygot mutant er vist. Transkripsjonsnivåer av proporsjonalt flere gener øker i kle – 2 mutant. Tf, transkripsjonsfaktor.

Lin-13 har et retinoblastomprotein (pRb) interaksjonsmotiv og fungerer i vulval utvikling med single prb homolog LIN-35 I C. elegans . I d. melanogaster reduseres kondensin II-subenheten dCAPD3-binding til kromatin ved pRb-mutasjon . HVIS, I c. elegans, LIN-13 rekrutterer kondensin II GJENNOM LIN-35, da DE LIN-13 områder som også er bundet AV LIN-35 (576) skal overlappe med kondensin II mer enn DE LIN-13 områder som ikke er bundet AV LIN-35 (1,033). Overlappingen AV LIN-13 OG LIN-35 co-okkupert områder med kondensin II områder var bare litt høyere ENN FOR LIN-13 områder uten LIN-35, 60% og 50%, henholdsvis (Figur 3b). Omvendt var overlapping AV LIN-35 med kondensin II høyere på de stedene som også var bundet AV LIN-13 (45%) sammenlignet med ubundne steder (9%). Dette antyder at den potensielle samspillet MELLOM LIN-13 og kondensin II er FOR det meste LIN – 35 uavhengig. LIN-35 fungerer innenfor et konservert multiproteinkompleks kalt DRM I c. elegans (hDREAM hos mennesker) som også inneholder EFL-1 og DPL-1 . DE 555 drm-bindingsstedene som var bundet AV LIN-13 viste en større overlapping med kondensin II (63%) sammenlignet med 787 DRM-steder som ikke var bundet AV LIN-13 (13%). Vi delte kondensin II-områdene i fire grupper i henhold TIL bindingsstedet overlapping MED LIN-13 OG LIN-35 (Figur 3C). Denne grupperingen indikerte at et stort antall kondensin II-steder viser høy lin-13-binding, men IKKE LIN-35, noe som tyder på at hvis pRb-mediert kondensin II-rekruttering er bevart I C. elegans, KAN LIN-35 avhenge av tilstedeværelsen AV LIN-13 for kondensin II-rekruttering.

Kondensin II-mutasjon forårsaker transkripsjonsfeil som antyder en undertrykkende funksjon

i gjær og d. melanogaster har kondensin vært involvert i transkripsjonell undertrykkelse . En nylig studie i d. melanogaster indikerte at kondensin II-underenheten CAPD3 er nødvendig for transkripsjonell aktivering av en klynge av antimikrobielle peptidgener . For å forstå rollen som kondensin II i transkripsjonsregulering, utførte VI RNA-seq i kle-2 null mutant l2 / L3 larver. MATERNALT lastet KLE-2 tillater kle-2 null mutant (ok1151 allel) å vokse opp til å være sterile voksne. Vi sammenlignet genuttrykk i heterozygote og homozygote kle – 2 mutanter I l2 / L3 larver før germline er proliferert, og inneholder dermed nesten helt interfasekjerner. Differensial ekspresjonsanalyse ved Bruk Av DESeq2 identifiserte 356 gener hvis uttrykk var signifikant forskjellig i homozygot sammenlignet med heterozygot larver (falsk oppdagelsesrate < 5%; DESeq2-resultater er presentert i tilleggsfil 7: Tabell S3). Flertallet av differensielt uttrykte gener økte (70%) i stedet for redusert (30%) i uttrykk. Gene Ontologi term analyse avslørte ikke en bestemt gruppe gener som ble påvirket av KLE-2 mutasjonen. I likhet med publiserte data for kondensin IDC, var det ingen direkte korrelasjon mellom KLE-2-binding og endringer i genuttrykk. Blant de 46 differensielt uttrykte OG KLE-2-bundne genene økte 83% i uttrykk sammenlignet med 67% av 310 gener som ikke var KLE-2 bundet (Figur 3D), noe som tyder på at den direkte effekten av kondensin II-binding i stor grad er undertrykkende.

Histon modifikasjoner assosiert med åpen kromatin positivt korrelerer med kondensin binding

for å forstå kromatin sammenheng med kondensin binding, analyserte vi forholdet mellom kondensin bindingssteder og kromatin funksjoner kartlagt av modENCODE . Vi observerte en generell positiv korrelasjon mellom kondensinbinding og merker av aktivt kromatin. I gjær korrelerer antall kondensinbindingssteder gjennom hele cellesyklusen direkte med kromosomlengde. Antall C. elegans kondensin II bindingssteder var ikke proporsjonal med kromosomlengde (Figur 4A), men positivt korrelert med lengden av kromosomer assosiert med aktive histonmerker (Figur 4B). X-kromosomet var et unntak, kanskje på grunn av doseringskompensasjonsmekanismer som endrer kromatinet . Kondensin I-IDC og II-binding over genomet korrelerte positivt med åpne kromatinmerker Som H3K27ac og negativt med heterokromatinmerker Som H3K27me3 Og H3K9me3 (Figur 4C og Tilleggsfil 8: Figur S4). Denne korrelasjonen var på domeneomfattende nivå (som analysert i 1 kb-vinduer), da vi ikke så en bestemt histonmodifisering som toppet på kondensinsider i en metagene-type analyse (data ikke vist). I immunfluorescensstudier overlappes sentromereproteiner med kondensin II-binding i mitotiske celler . Vi observerte ikke en positiv korrelasjon mellom CENP-A og kondensin II ChIP-seq-signaler i blandede stadie-embryoer, noe som tyder på at det i interfasekjerner (de fleste kjerner i blandede stadie-embryoceller) ikke er noen overlapping. Alternativt, gitt AT CENP-A binder seg til bare en liten delmengde AV CENP-a positive regioner i genomet per celle, kan overlappingen AV CENP-A med kondensin II bare være tydelig i enkeltceller. For å forstå hvilke kromatinfaktorer som best forutsier kondensinbinding, brukte vi en maskinlæringsmetode. I c. elegans er H4K20me1 svært beriket over X-kromosomet AV DCC, og Dermed Var H4K20me1 den mest diskriminerende faktoren for kondensin IDC-binding (Figur 4d). For kondensin II er svært prediktive kromatinfunksjoner H3K27ac og CBP, begge markører for aktive forsterkere, noe som tyder på at kondensinbinding er beriket ved aktive forsterkere . Blant 201 kondensin II-bindingssteder som var 2 kb unna en annotert TSS, overlappet 58 MED ET CBP-bindingssted (P = 0.0002).

Kromatinfaktorer assosiert med åpen kromatin og forsterkere korrelerer positivt med kondensinbinding. (A) antall kondensin II topper er plottet med hensyn til den lineære lengden av hvert kromosom. (B) antall kondensin II topper er plottet mot lengden av kromosomet som er dekket Av h4k8ac og H4K16Ac topper. En trendlinje tilpasset autosomale data indikerer en positiv korrelasjon (R2 = 0,9). (C) Kondensinbinding innenfor 1 kb sammenhengende vinduer over X-kromosomet (venstre) og autosomer (høyre) korrelerer positivt med aktive merker (For Eksempel H3K27ac, H2A.Z) og negativt korrelerer med repressive merker (For Eksempel H3K27me3, H3K9me3). (D) en ensemble klassifikator (tilfeldige skoger) ble lært å forutsi kondensinbinding over genomet. Topp 20 funksjoner (blant 92 totalt funksjoner, Ekstra fil 1: Tabell S1) med høyest prediktiv effekt er plottet for condensin I-IDC (venstre) og condensin II (høyre) med den viktigste funksjonen på toppen. Funksjonene er rangert basert på gjennomsnittlig reduksjon i nøyaktighet, som beskriver forskjellen mellom feilfrekvensen for den faktiske klassifiseringen og feilfrekvensen etter permutering av funksjonen, i gjennomsnitt over alle klassifiserere (trær).

DNA-sekvensmotiver beriket på kondensinbindingssteder viser spesifikke egenskaper

selv om kondensin II bundet til kondensin I-IDC-stedene På X, bundet kondensin I-IDC ikke til de fleste av de autosomale kondensin II-bindingsstedene (Figur 1d). For å forstå spesifisiteten av kondensat IDC OG II rekruttering, vi søkte ETTER DNA sekvens funksjoner som skiller kondensat II OG kondensat IDC binding. Tidligere studier har vist at kondensin IDC først rekrutteres til omtrent 100 steder, og sprer seg deretter til andre kromosomale steder . En 10 bp DNA sekvens motiv ble beriket på kondensat IDC rekrutteringssteder (Figur 5a) og mutasjon av motivet avskaffet kondensat IDC rekruttering på extrachromosomal arrays, indikerer at kondensat IDC DNA sekvens motiv spiller en viktig rolle i kondensat IDC rekruttering.

Vi fant ET GCGC-inneholdende DNA-sekvensmotiv som ble beriket under kondensin II-bindingssteder (Figur 5a). Det er interessant å merke seg at både kondensin II OG kondensin IDC motiv inkludert gcgc kjernen, men kondensin IDC motiv ble utvidet på den ene siden AV AGGG, noe som tyder På At X-spesifisitet av kondensin IDC rekruttering oppnås ved kofaktorer som gjenkjenner AGGG. I likhet med andre TFs (for eksempel) var bare en del av de potensielle DNA-sekvensmotivene bundet av kondensin II. Andre faktorer som kromatin tilgjengelighet og ukjente ko-faktorer kan være involvert i bindende spesifisitet. Faktisk, hvis vi tok de motivene som var i et 2 kb-vindu, betydelig beriket for et aktivt histonmerke, Som H4K16ac, økte prosentandelen motiver som var bundet fra 11% til 29%. I tillegg, i likhet med kondensin IDC motif , som er mer gruppert på de bundne nettstedene, fant vi at 1 kb genomiske vinduer som inneholdt mer enn ett kondensin II-motiv, var rundt 2,5 ganger mer sannsynlig å være bundet av kondensin II, sammenlignet med de med bare ett motiv. Derfor motiv clustering og åpne kromatin kontekst hjelp angi utvalg av motivene som er bundet.

Kromosomal rekruttering av kondensat Idcog kondensat II involverer både delte og distinkte regulatorer. (A) Motiv logoer av 10 bp DNA sekvens motiver beriket på toppen kondensin områder vises. (B) Overlapping mellom bindingssteder for kondensin I-IDC, kondensin II og SCC-2 er vist. Tall under hver faktor angir totalt antall bindingssteder. Overlappende tall er basert pa ANTALL SCC-2 topper. (C) university Of California Santa Cruz (UCSC) browser view eksemplifiserer SCC-2 ChIP-seq signal, som for det meste er begrenset til arrangører. (D) scc-2 og kondensin II binding på et veldefinert kondensin IDC rekrutteringssted På X (rex-1). (E) i sdc-2 null mutant (TY1072), kondensin I-IDC (DPY-26), kondensin II (HCP-6, KLE-2) og SCC-2 binding er redusert på rex-2 (venstre panel), men er fortsatt stort sett lik på autosomer (høyre panel). (F) Boksplott av forholdet Mellom Chipberikelse i sdc-2 mutant versus villtype innenfor bindingstoppene TIL SCC-2. Bindingssteder er klassifisert som å være på autosomer, På X med lav SDC – 2-binding og høy SDC-2-binding. (G) qpcr analyse AV Dpy-27 ChIP anrikning i embryoer isolert fra voksne som ble matet vektor (kontroll) OG PQN-85 RNAi. ChIP berikelse uttrykkes som i forhold til den negative kontroll locus. Feilfelt er standardavvikene fra tre til fem biologiske replikater. ChIP, kromatin immunoprecipitation; DCC, dosering kompensasjon kompleks.

ikke alle kondensin II bindingssteder har motivet. På de kondensin II-stedene uten motivet kan andre faktorer være ansvarlige for bindingen. Alternativt kan den lave andelen av kondensin II-steder (27%) som inneholder et motiv forklares med potensiell spredning av kondensin II etter rekruttering. Steder for spredning forventes ikke å inneholde motivet. For eksempel, for kondensin IDC, inneholder en høy prosentandel av potensielle rekrutteringssteder (56%) motivet, men ikke spredningssteder (8%) . En systematisk analyse av rekrutteringskapasiteten til de identifiserte kondensin II-lokalitetene er nødvendig for å ta opp om det er spredning.

SDC-2 er nødvendig for binding av kondensin I-IDC, kondensin II og cohesin loader Til x kromosomale dcc rekrutteringssteder

i metazoans, proteiner som er involvert i kondensin rekruttering til kromosomer er ikke godt forstått. I gjær overlapper kondensinbinding med kohesinbelastningskomplekset Scc2 / 4, noe som øker kondensinforeningen med kromosomer . For å teste om overlappingen Med Scc2 / 4 er konservert mellom gjær Og C. elegans, vi utførte ChIP-seq analyse AV SCC-2 (også kjent SOM PQN-85) og fant at en bemerkelsesverdig 95% AV SCC – 2 områder overlappet med kondensin I-IDC På X, og 60% med kondensin II genom-wide (Figur 5b). Overlappingen forblir lik når VARME områder ble utelukket (Tilleggsfil 9: Figur S5A). Ikke alle kondenseringssteder overlappes MED SCC-2, noe som tyder på at kondensin, i motsetning til gjær, ikke er avhengig AV SCC-2 for binding . Scc-2 binding var høyere hos promotorer, og positivt korrelert med transkripsjon (Tilleggsfil 9: Figur S5B). ET GAGA-inneholdende DNA-sekvensmotiv var tilstede i 58% AV SCC-2-bindingssteder (Tilleggsfil 9: Figur S5C). I motsetning Til Drosophila Nipped-B, og i likhet Med s. cerevisiae Scc2, SCC – 2 binding var ikke høy innenfor transkribert regioner, men forble intergenic (Figur 5c).

Nesten fullstendig overlapping (96%) av kondensin II-bindingssteder med kondensin I-IDC på X-kromosomet støtter eksistensen av felles mekanismer for kromosombinding av forskjellige kondensiner. Siden kondensin II OG SCC-2 bundet til kondensin IDC rekrutteringssteder På X (Figur 5D og Tilleggsfil 9: Figur s5d), hypotese vi at kondensin IDC rekrutterere også rekruttere kondensin II OG SCC-2. Hermafroditt – spesifikk rekruttering av kondensin IDC Til X-kromosomet oppnås VED SDC-2, SDC – 3 OG DPY-30 . VI utførte HCP-6 OG KLE-2 (kondensin II), DPY-26 (kondensin I-IDC) og SCC-2 ChIP-seq i sdc – 2 null mutant embryoer. I sdc – 2-mutanten ble dpy-26 -, HCP-6 -, KLE-2-og SCC-2-bindingen avskaffet på Et X-spesifikt kondensin IDC-rekrutteringssted (rex-2) (Figur 5e). DET er uklart hvorfor HCP-6 og KLE-2-bindingen ved rex-2 ble redusert i stedet for å ligne et autosomalt kondensinsted. Scc-2 binding på autosomer og X-kromosom områder som er uavhengig AV SDC – 2 forble lik i sdc-2 mutant sammenlignet med områder som var bundet AV SDC-2 (Figur 5f). Våre resultater tyder på AT SDC-2, den hermafrodittspesifikke TF som rekrutterer kondensin IDC Til X-kromosomet, rekrutterer også kondensin II OG cohesin-lastekomplekset SCC-2 til de samme stedene (Tilleggsfil 10: Figur S6). Tidligere genetiske studier viste at en sdc-2 null mutasjon ikke forårsaker embryonal dødelighet hos menn, og funksjonen av kondensin II OG SCC-2 rekruttering AV SDC-2 er derfor ikke avgjørende for generell kromosomkondensasjon og segregering . DET er mulig AT scc-2 og kondensin II rekruttering AV SDC-2 har en hermafroditt-spesifikk genregulerende funksjon.

for å teste OM SCC-2 har en effekt på kromosomal forening av kondensin IDC på rekrutteringsstedet, utførte vi kvantitativ PCR-analyse AV DPY-27 ChIP i kontroll versus SCC-2 knockdown embryoer. Ved å mate RNAi var vi i stand til å slå ned nivåene AV SCC-2 med ca 80% (Tilleggsfil 9: Figur S5E). Ved scc-2 knockdown, så vi ikke en signifikant endring I dpy-27 binding på rex-1 eller rex-2 (Figur 5G). Konsekvent viste immunfluorescensanalyse av kondensin i OG II-binding på meiotiske kromosomer ikke en signifikant forskjell mellom villtype og scc-2 mutanter .