hvordan designe gRNA for CRISPR genom redigering?
gRNA leder CRIPR Cas9-systemet til riktig genomisk plassering for å utføre en dobbel strandbrudd.Targerting-spesifisiteten TIL CRISPR Cas9-systemet bestemmes av 20-nukleotidene ved 5 ‘ – enden av gRNA. GRNA-basen par til den komplementære strengen av målsekvensen og Cas9 nuklease utfører en dobbel strengbrudd.
ved utforming av en gRNA må følgende ting tas i betraktning.
1) GC-innhold: Typisk rekkevidde er mellom 40% – 80% . Et høyere GC-innhold stabiliserer RNA-DNA-duplekset mens destabiliserende off-target hybridiseringer
2) Lengde: lengden kan justeres og variere fra 17-24 basepar. En kortere sekvens fører til minimert off target effekter. (17 bp er den laveste grensen på lengden på styringssekvensen, hvilken som helst lengde av styringssekvensen, hvilken som helst lengde kortere enn 17, har en statistisk sjanse for å målrette mot flere genomiske loci.)
3) Potensielle off-target effekter: Mismatch toleranse og målet området er det som fører til off-target effekter. Dette kan reduseres ved genom-wideoff mål effekt søk.
det er mange nettsteder som hjelper i utformingen gRNAs. Noen av dem Er Chop Chop (Harvard), Broad Institute sgrna designer og Biotools.
jeg forklarer hvordan Du bruker Chop Chop nettsted her,
1) gå til https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Velg Arter
3) Velg artsspesifikk gen-id eller klipp og lim inn nukleotid av interesse, og start analyse.
når analysen er gjort grafisk fremstilling av stedsspesifikke gRNA vil bli vist. Hver potensielle gRNA vil også vise mulige off target effekter. Velg de med mindre off target effekter.
