Injiserbare humane rekombinante kollagenmatriser begrenser ugunstig remodeling og forbedrer hjertefunksjonen etter hjerteinfarkt

Studiedesign

Her gjennomførte vi en studie for Å (i) designe klinisk relevante kollagenhydrog ved bruk av rekombinante humane kollagener type i og TYPE III; (ii) karakterisere og sammenligne de fysiske egenskapene til rHCI og rHCIII-materialene.; (iii) evaluere det terapeutiske potensialet til materialene for BEHANDLING AV MI hos mus; og (iv) identifisere mekanismer som ligger til grunn for de observerte terapeutiske effektene av rHC-behandling. FOR in vivo eksperimenter BLE LAD artery ligation hos mus valgt som en klinisk relevant og veletablert dyremodell AV MI. For funksjonelle, histologiske og molekylære evalueringer ble antall dyr per gruppe minimert til tre til femten mus, som angitt i figurlegendene. Mus ble randomisert til behandlingsgrupper og alle analyser ble utført på en blindet måte.

Fremstilling og karakterisering av rHC matriser

En 1% kollagenløsning ble fremstilt ved oppløsning av 0,1 g lyofilisert kollagen (rHCI og rHCIII, Fra Fibrogen) i 10 ml ultrarent ddH2O. Kondroitinsulfat (CS; Wako), n-etyl-n-(3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) og n-hydroksysuccinimid (NHS) ble lagt til for å produsere en endelig blanding med et masseforhold På 1:4:0,5:0,3 for kollagen:cs:nhs:edc. Materialene ble tilberedt på is ved hjelp av et lukket system som tillater homogen blanding uten å legge til bobler. Etter grundig blanding ble pH justert til 7.4 Av NaOH (1.0 N). Matriser uten CS ble fremstilt på samme måte, men MED pbs tilsatt for å kompensere for VOLUMET AV CS. Matriser merket Med Alexa-Fluor®594-NHS ble tilberedt ved å tilsette 20 µ av fargestoffoppløsningen (1 mg/mL I DMSO) til gelene før naoh ble tilsatt (25 nmol fargestoff per hydrogel), etterfulgt av 20 blandingstrinn.

materialviskositet

Viskositetsmålinger ble utført ved Bruk Av En Brookfield R/s pluss rheometer (Brookfield) ved 37 °C. A C25-2/30 konisk spindel ble brukt til å komprimere materialet (50 µ forskyvning) på en temperaturstyrt sokkel. Viskositeten ble målt med en rampe rotasjonsblokk med en hastighet på 1 / min enheter forhåndsinnstilt med en skjærhastighet på fem enheter over en tid på 30 min.

grad av kryssbinding

differensial scanning calorimetry (DSC) eksperimenter ble utført for å vurdere graden av kryssbinding. Kort fortalt ble målinger utført I et q2000 differensialskanningskalorimeter (TA-Instrumenter) i området 8 til 80 °C ved bruk av en skannehastighet på 5 °C min−1. Kollagenmatriser (5-20 mg) ble overflatetørket med filterpapir og hermetisk forseglet med et aluminiumslokk (Tzero; TA Instrumenter) i en aluminium prøve pan (Tzero; TA Instrumenter). Denatureringstemperaturen (Td) ble målt ved starten av den endoterme toppen.

Vanninnhold

Vanninnholdet i materialene ble målt ved å veie våtvekten (W0) av prøven, equilibrated I PBS for 96 h ved 4 °C. materialet ble deretter vakuumtørket ved romtemperatur i 96 h for å oppnå tørrmassen (W). Det totale vanninnholdet i hydrogelene (Wt) ble deretter beregnet i henhold til ligningen:

Degradering

Enzymatisk degradering ble målt ved bruk av 50-100 mg hydrogel plassert i 5 ml type i kollagenase (10 E/ml I PBS) ved 37 °c. gjenværende fast masse ble målt over en periode på opptil 24 timer. degraderingshastigheten beregnes ut fra den innledende helningen av plott av gjenværende masse vs. tid og rapportert som mg/min.

materialporøsitet

Målinger av lavtemperatur skanningelektronmikroskopi (Cryo-SEM) ble utført ved -50 °C ved Bruk av En Tescan (Modell: Vega II – XMU) utstyrt med en kaldtrinns prøveholder, en backscatterelektrondetektor (BSE) og en sekundær elektrondetektor (SE). Porestørrelser ble målt fra minst 250 individer fra 4 til 6 tilfeldige områder i prøven ved Hjelp Av ImageJ® programvare. Diameter for porene ble kvantifisert ved hjelp av lengdeaksen til porene ved hjelp av rettlinjeverktøyet. Arealet av bildet ble justert mot størrelsen skala bar hentet fra Tescan Vega II system65.

Dyreforsøk

alle prosedyrer ble godkjent Av University Of Ottawa Animal Care Committee, og utført i Henhold Til National Institute Of Health Guide For Omsorg og Bruk Av Laboratoriedyr.

MI modell

MI ble indusert i 9 uker gamle kvinnelige c57bl / 6 mus (Charles River; antall mus/gruppe er i figuren legender) og behandling levering ble utført ved hjelp av en etablert protokoll26,27. Mus ble bedøvet (2% isofluran), intubert, og hjertet ble eksponert via fjerde intercostal thorakotomi. Den venstre fremre nedadgående kranspulsåren (LAD) ble deretter ligert like under fremveksten fra venstre atrium. Denne prosedyren resulterer i et stort MI som involverer de anterolaterale, bakre og apikale delene av hjertet, som ble bekreftet ved kirurgi ved myokardisk blanchering i regionen som leveres av arterien. Korttidsvirkende buprenorfin ble administrert minst en time før kirurgi, og langtidsvirkende buprenorfin ble administrert subkutant umiddelbart før kirurgi for perioperativ analgesi. Ved 1-ukers post-MI (baseline) ble mus randomisert til å motta behandling AV pbs (kontroll), rHCI eller rHCIII matriser, levert i fem ekvivalente intramyokardiale injeksjoner (10 µl hvert sted, 50 µ totalt) gjennom en 27-G kanyle ved hjelp av en ultralydstyrt lukket brystprosedyre. Sprøyten er festet i En mikromanipulator (VisualSonics), og før injeksjonsprosedyren er både nålen og RMV scanhead-sonden justert langs hjertens langakse. Via ultralydfeltet brukes mikromanipulatoren til å plassere nålespissen på ønsket sted i myokardiet for levering av injeksjonene (Se Supplerende Fig. 1 Og Supplerende Video 1). Mus ble drept av terminal anestesi 2 dager eller 4 uker etter behandling og hjerter ble samlet for histologi og / eller målinger av de mekaniske egenskapene.

Ekkokardiografi

Transtorakal ekkokardiografi ble utført på langaksevisninger ved hjelp Av Et Vevo770-system I B-modus med EN 707b-serie sanntids mikrovisualisering scanhead probe (VisualSonics). Bildebehandlingen ble utført ved baseline før behandlingsinjeksjon (7 dager ETTER MI) og 28 dager etter injeksjon for å bestemme venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon (LVEF), fraksjonal områdeendring (FAC), endesystolisk volum (ESV), endediastolisk volum (EDV), slagvolum og minuttvolum. MERK AT LVEF, ESV og EDV brukes som kliniske prediktorer FOR HF og overlevelse etter MI44.

Ex vivo-avbildning Av Alexa-Fluor®594-merket matrise

de kjemisk merkede rHC-matrisene (25 nmol fargestoff per hydrogel) ble injisert i det infarkterte musehjerte, som beskrevet ovenfor. Dyr ble drept ved 2 timer, 2 dager og 7 dager etter behandling, og hjerter ble høstet og avbildet ex vivo ved IVIS® Spectrum (PerkinElmer) for å visualisere rHCI og rHCIII-distribusjon i hjerter (λ: 570 nm; λ: 640 nm). For histologi ble vevsseksjoner fremstilt i aceton og deretter beiset MED DAPI etterfulgt av avbildning ved Bruk Av En Leica Aperio Versa-glideskanner med en endelig forstørrelse av ×20 og En Z-stabel med åtte trinn ved 1,5 µ.

Stamme analyse

Transtorakal ekkokardiografi ble utført på langaksevisninger ved hjelp Av Et Vevo3100-system I B-modus med en mx400-serie sanntids mikrovisualisering scanhead probe (VisualSonics). Bildebehandlingen ble utført ved baseline før behandlingsinjeksjon (7 dager ETTER MI) og 2 dager etter injeksjon for å bestemme langsgående endokardial belastning ved tidspunktet for lukking av aortaklaffen (som representerer endesystol). Stamme I Segment 5 (det fremre midtsegmentet), som tilsvarer grensesoneområdet målrettet for behandlingsinjeksjon, ble analysert ved Bruk Av Vevostrain-applikasjonen Av Vevo LAB 3.1.1 software (VisualSonics)41. Representative eksempler på de utførte målingene er inkludert I Supplerende Fig. 10 for alle eksperimentelle grupper pluss et sunt (ikke-infarkt) dyr.

Elektrokardiografi

Elektrokardiogram ble oppnådd samtidig med ekkokardiografi ved Bruk Av Et Vevo3100-system (VisualSonics) ved baseline før behandlingsinjeksjon (7 dager ETTER MI) og 2 dager etter injeksjon. Elektrokardiogrammer ble eksportert fra Vevo LAB 3.1.1. programvare (VisualSonics). Lengden PÅ pr -, QT-og QRS-intervallene ble bestemt ved Hjelp Av ImageJ-programvare (Supplerende Tabell 1).

myokardets Mekaniske egenskaper

Mus ble avlivet ved terminal anestesi 2 eller 28 dager etter behandling, og hjertene ble høstet. Rektangulære stykker (2,5 × 5 mm) i venstre ventrikkel som omfatter arr og grensesone ble skåret ut. For å bestemme strekkelasticiteten til vevet (Youngs modul) ble prøvene utsatt for mekanisk testing i En Instron mekanisk universell tester (Modell 3342, Instron) utstyrt Med Serie IX/S-programvare, ved hjelp av en krysshodehastighet på 10 mm min-1.

Histologi / Immunhistokjemi

Lysbilder av myokardvevsseksjoner ble fremstilt fra en delmengde av hjerter som ikke ble brukt til mekaniske egenskaper målinger. På 28 dager etter injeksjon, hjerter ble høstet, perfusert MED PBS, innebygd I OKTOBER, og snap-frosset i flytende nitrogen. Seksjoner på 10 µ ble kuttet ved hjelp av en kryostat. For å vurdere arrstørrelse ble vevsseksjoner løst i 4% PFA for 1 h og farget Med Massons trikromprosedyre (Sigma). Bilder tatt Med Et Olympus BX50-mikroskop ved hjelp av et 2 × mål, og åtte seksjoner per mus ble brukt til å måle ekstern veggtykkelse og for å bestemme arrstørrelse ved hjelp Av mid-line arc-metoden ved Hjelp Av MIQuant software66. For immunhistokjemi ble vevsseksjoner festet i aceton i 20 min, permeabilisert med 0,1% Triton i 10 min og deretter blokkert i 10% serum i 1 h ved romtemperatur. Primære antistoffer ble påført over natten ved 4 °C i 10% serum, og deretter ble lysbilder skyllet og behandlet med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur, før de ble montert med Fluorescerende monteringsmedium (Dako). FOR påvisning av blodårer og myofibroblaster, PECAM-1 (OGSÅ KJENT SOM CD31; Santa Cruz 101454, 1: 50) og α-SMA (Abcam 5694, 1:200) antistoffer ble brukt og påvist med HENHOLDSVIS AF594 anti-rat (Life Technologies A11008, 1:500) og AF488 anti-rabbit (Life Technologies A11007, 1:500). M2-makrofager ble påvist AV AF488-konjugert anti-CD206-antistoff (Biolegend 141710, 1:50). Ved kardial troponin i-farging ble seksjoner inkubert MED AF488-merket hvetekimagglutinin (ThermoFisher, W11261) i 1 time ved 37 °c etterfulgt av inkubasjon med geitkardial troponin i primært antistoff (Abcam ab56357, 1:200) og oppdaget av esel anti-geit AF594 sekundært antistoff (Life Technologies A-11058, 1:500). Til slutt, for connexin 43-farging, ble seksjoner inkubert med connexin 43 / GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) og hjerte troponin I (Abcam ab188877, 1:200) primære antistoffer etterfulgt av deteksjon med HENHOLDSVIS AF488 anti-kanin (Life Technologies A11007, 1:500) og esel anti-geit AF594 sekundært antistoff (Life Technologies A-11058, 1:500). Fluorescerende bilder ble oppnådd ved Bruk Av Et Zeiss Axio Observer-mikroskop med et ×20-mål og For connexin 43-fargete seksjoner ble Det brukt En Leica Aperio Versa-glideskanner med et 20 × – mål. FOR ALLE IHC-flekker ble fire seksjoner per mus analysert, og for hver seksjon 2-4 bilder innenfor grensesonen ble infarkt og fjernområder brukt til analyse. For H & e-farging ble vevsseksjoner løst i 10% formalin. 2 I 7 min, etterfulgt av syrealkoholdifferensiering, og deretter 0,5% eosin i 7 min, etterfulgt Av dehydrering (Alle løsninger Fra Sigma). Bilder ble tatt Med Et Olympus BX50 mikroskop. Grensesonen ble betegnet SOM FOV rett ved siden av hver side av infarktområdet som begynner når 50% AV LV er fibrotisk arrvev (se Supplerende Fig. 11 for en skjematisk skildring).

cx3cr1-EGFP museksperimenter

for å evaluere rekruttering av sirkulerende mononukleære celler til myokardiet etter rHC-behandling, ble B6.129p-Cx3cr1 tm1Litt/j mus (Cx3cr1-EGFP) kjøpt fra Jackson Laboratory. Disse musene uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein i monocytter, dendritiske celler, nk-celler og hjernemroglia, og er en modell rapportert for studiet av mononukleære cellerekruttering til hjertet67. Ved 1-ukers post-MI fikk mus behandling med 50 µ AV PBS, rHCI eller rHCIII, som beskrevet ovenfor. Dyr ble drept 2 dager etter behandling, og blod ble samlet inn I EDTA-rør. Også hjerter ble perfusert MED PBS og høyre ventrikel og den apikale regionen i venstre ventrikel ble samlet. Vevet ble skyllet MED HBSS og fordøyd i 2.4U / ml dispase I (Roche) og 1 mg/ml Kollagenase B (Roche) i 40 min ved 37 °C. Prøver ble vasket tre ganger med PBS, sentrifugert i 5 min ved 400 g, og de isolerte cellene ble forberedt for flowcytometri (FACS ARIA III; Becton Dickinson). Cellene ble merket MED APC Anti-mus/human CD11b (Biolegend 101211), PE anti-mus Ly-6g/6c (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti-mus F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 ANTI-mus CD38 (Biolegend 102717) Og Alexa Fluor® 700 ANTI-mus CD206 (Biolegend 141733), etter PRODUSENTENS anbefalte fortynninger (0.25@g / L per 1 × 106 celler til CD11b, Ly-6g / 6C, CD38 og CD206 og 1 µ/L per 1 × 106 celler Til F4/80). Se Utfyllende Fig. 12 for sortering / gating strategi.

celleisolering og flowcytometri for monocytt-undergrupper

to dager etter injeksjon ble mus drept VED CO2-inhalasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon. Blod ble samlet fra mus gjennom hjertepunktur i en 50 mM EDTA-løsning, Og Rbc ble lysert med røde blodlegemer (rbc) lysebuffer i henhold Til produsentens protokoll (Biolegend 420301). Celler ble isolert fra høstede musehjerter ved hjelp av en fordøyelsesbuffer som inneholdt: DNAse i (50 e/µ; Sigma D5025), kollagenase TYPE II (400 E/mL; ThermoFisher 17101015), kollagenase D (0,15 e/mL; Sigma 11088866001) og hyaluronidase (10 E/mL; Sigma H3506). Etter en time med fordøyelse ved 37 °C ble isolerte hjerteceller sendt gjennom et 70 µ filter. Til slutt ble høstet musemelter moset og triturert gjennom et 70 µ filter etterfulgt av inkubasjon med røde blodlegemer (RBC) lysebuffer. Cellepellets ble samlet inn ved sentrifugering ved ×400g til 5 min ved 4 °C. Isolerte celler fra alle vev ble inkubert Med Zombie Aqua fixable levedyktighet fargestoff (1: 500, Biolegend 423101) i 20 min ved romtemperatur. Deretter Ble Fc-reseptorer blokkert Med TruStain x reagens (1: 100, Biolegend 103319) i 10 min ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med en antistoffcocktail i 45 minutter ved romtemperatur som inneholdt CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1a8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17a2), B220-af488 (1:50, biolegend ra3-6B2), F480-Af647 (1:100, BIOLEGEND BM8) Og Ly6C-BV421 (1: 80, BD Biovitenskap AL-21). Flowcytometri ble utført ved BRUK AV EN BD FACS Aria III, og data ble analysert Med FlowJo V10.5.2 programvare (Se Supplerende Fig. 12 for sortering / gating strategi). Det totale levedyktige celletallet for hver vevsisolasjon ble bestemt ved trypanblå ekskludering ved bruk av et hemocytometer. Det totale antall celler i hver leukocyttpopulasjon ble bestemt ved å bruke prosentandelen levende celler for en gitt cellepopulasjon, og det totale antall levende celler talt etter isolering som deretter ble normalisert til mg vev eller mL blod samlet. Gating strategi: Enkeltceller ble gated basert PÅ FSC-A og FSC-H. Levende enkeltceller ble gated på lav farging For Zombie Aqua live / dead dye. Fra denne levende enkeltcellepopulasjonen var leukocytter CD45+. Leukocytt-undergrupper ble karakterisert som følger: nøytrofile CD45+CD11b+Ly6G+, Ly6C lave monocytter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C høye monocytter CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, makrofager CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T−celler CD45+CD11b−Ly6G− CD3+B220−OG B−celler CD45+cd11b−ly6g-Cd3-B220+. Merk for blood F480 uttrykket ble ikke brukt i gating strategi. Gates ble satt i forhold til isotype kontroller.

Neonatale kardiomyocyttstudier

Neonatale rotteoventrikulære myocytter (Nrvm) ble nylig isolert ved hjelp av en etablert protokoll68. Venstre ventrikler samlet fra 2-dagers Sprague–Dawley-rotter (Harlan) ble fordøyd av trypsin (Amersham Biosciences) OG kollagenase TYPE II (Worthington Biochemical). Isolerte celler ble re-suspendert i m-199 medium (Life Technologies) supplert med 10% FBS, 19,4 mM glukose, 2 mM l-glutamin, 2 E/mL penicillin, 0,8 µ/mL vitamin B12, 10 mM HEPES og 1 × mem ikke-essensielle aminosyrer (Sigma-Aldrich). To runder med 60 min pre-plating ble utført, hvor hjertefibroblaster festes til parabolbunnen, og beriker dermed den ikke-tilstøtende befolkningen for NRVMs. De nonadherent cellene (NRVMs) ble deretter sådd på de forskjellige kollagenmatrisene i 24-brønnplater (40.000 celler/cm2). For overlevelsesanalysen ble 3-dagers Dyrkede Nrvmer utsatt For m-199-medier som inneholdt 50 µ hydrogenperoksid i 3 timer, hvoretter En Terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick-End Merking (TUNEL) – analyse ble utført og døde celler ble talt i tre tilfeldige synsfelt.

Cellekulturer

ved hjelp av en etablert protokoll ble benmarg-avledede makrofager isolert fra 8-12 uker GAMLE C57BL / 6J mice69. Mus ble euthanized AV co2 innånding og cervical dislokasjon, og tibia bein ble samlet og spylt med media for å isolere beinmarg. Benmargsisolatet ble pipettert gjentatte ganger for å oppnå en enkeltcellesuspensjon, som deretter ble ført gjennom en cellesil. Nylig isolerte celler ble dyrket i 1 uke I DMEM supplert med 10% FBS, 20% L929-kondisjonerte medier og penicillin-streptomycin, og deretter belagt på rHC-hydrogelene i 3 dager. Celler ble samlet fra rHC hydrogeler ved hjelp Av 3 mM CaCl2 Hank buffer saltløsning inneholdende 250 enheter av kollagenase I (Gibco). Makrofagpolarisering ble vurdert ved flowcytometri (FACS ARIA III; Becton Dickinson) ved HJELP AV CD86 og CD206 (Biolegend) for å identifisere Henholdsvis m1 og M2 makrofager. For mononukleær celleisolasjon ble benmarg fra tibia bein samlet som beskrevet ovenfor. Mononukleære celler ble renset ved tetthetsgradientsentrifugering ved Bruk Av Histopaque® (Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble merket med 0.5 µ / ml Dapi (Sigma) i 30 min ved 37 °C.

makrofagadhesjonsanalyse

Mononukleære celler ble isolert ved å skylle tibia og lårben av 6 til 12 uker gamle mus. Cellene ble renset ved tetthetsgradientsentrifugering ved Bruk Av Histopaque® (Sigma) i henhold til produsentens instruksjoner. Mononukleære celler ble talt og merket MED DAPI. Celler ble belagt på de forskjellige biomaterialene i en konsentrasjon på 50.000 celler / cm2 for 24 timer. Celler ble løst med 4% PFA i 5 min, og celler ble talt. Dataene ble uttrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønner, dvs., TCPS) for å minimere effekten av inter-donorcellevariabilitet.

makrofag migrasjon assay

Benmarg mononukleære celler ble dyrket I DMEM supplert med 10% FBS, 20% L929-kondisjonert medium, Og Pen / Strep i 7 dager for å generere benmarg-avledet makrofager (BMDMs) og merket MED DAPI, som beskrevet ovenfor. Bmdmer (2 × 105) ble deretter suspendert i EBM uten vekstfaktorer og serum, og lastet inn i det øvre kammeret på En Transwellplate (Life Technologies) belagt med 100 µ av rHCI eller rHCIII. Bunnkammeret inneholdt fulle makrofagmedier som beskrevet ovenfor. Etter 24 timer ble innsatsene fjernet, og antall Bmdmer som migrerte gjennom biomaterialet ble kvantifisert på en blindet måte ved hjelp Av Et Zeiss Z1 fluorescensmikroskop. Dataene ble uttrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønner, dvs. TCP) for å minimere effekten av inter-donorcellevariabilitet.

makrofagpolarisasjonsanalyse

Bmdmer ble generert I DMEM supplert med 10% FBS, 20% L929-kondisjonert medium og Penn / Strep i 7 dager, som beskrevet ovenfor. For makrofagaktiveringsforsøk ble celler stimulert i 3 dager med lipopolysakkarid (1 µ/ml; Sigma) pluss IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) For m1-aktivering, eller MED IL-4 (20 ng / ml; R& D-systemer) For m2-aktivering. Det totale RNA ble ekstrahert ved Hjelp Av Tri-Reagens (Zymo Research), i henhold til produsentens protokoll. Første-tråd cDNA ble syntetisert Med Smartscribe Revers Transkriptase (Takara Bio USA) og tilfeldige heksamer primere (Fisher Scientific). Målgen-mRNA-nivåene ble vurdert ved kvantitativ RT-PCR med LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) og Et LightCycler 480 Real-Time PCR-System (Roche). Sekvenser for primerpar er oppført I Supplerende Tabell 2. Relative endringer i mRNA-ekspresjon ble bestemt ved den ∆ ∆ ct-Metoden, uttrykt som nivåer i forhold til 18s. Dataene ble uttrykt i forhold til kontrollen (ikke-lakkede brønner, dvs. tcp) FOR å minimere effekten av inter-donorcellevariabilitet.

Overlevelse etter h2o2 eksponering

Celler ble dyrket i 7 dager I DMEM supplert med 10% FBS, 20% L929-kondisjonert medium og Pen / Strep. På dag 7 ble mediet endret til DMEM som inneholdt 0,5 mM hydrogenperoksid, og celler ble dyrket i 3 timer før de ble farget med 7-AAD for analyse ved flowcytometri. Dataene ble uttrykt i forhold til kontrollen (ikke-belagte brønner, dvs. TCP) for å minimere effekten av inter-donorcellevariabilitet.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført med Kaleida Graf 4.5® Alle data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. For sammenligning av in vivo-data mellom behandlinger ble EN ANOVA brukt etterfulgt av Holms korreksjon for flere sammenligninger. Scar størrelse ble analysert ved hjelp av en multippel regresjon, inkludert behandlingsgruppe (rHCI, rHCIII, OG PBS) og baseline LVEF. rHCI og rHCIII sammenlignet MED PBS var signifikante prediktorer for infarktstørrelse, i tillegg til BASELINE LVEF. Korrelasjonskoeffisienten for modellen er 0,6 ved BRUK AV stata multiple lineær regresjon. IN vitro NRVM, makrofag og hjerte fibroblast data ble analysert enten Ved En Student t test eller ved en enveis ANOVA Med En Holm korreksjon for flere sammenligninger, som angitt i figuren legender.

Rapporteringssammendrag

Ytterligere informasjon om forskningsdesign er tilgjengelig I Nature Research Reporting Summary knyttet til denne artikkelen.