Kloramfenikol acetyltransferase som seleksjonsmarkør for chlamydial transformasjon
PGFP:: SW2, shuttle-vektoren konstruert Av Wang et al., inneholdt et β-laktamase-gen som seleksjonsmarkør. DET bærer også ET KATTGEN som er smeltet til gfp-genet . VI fant At E. coli transformert med pGFP::SW2 plasmid var i stand til å vokse i medium som inneholdt kloramfenikol (endelig konsentrasjon: 170 µ / ml), noe som tyder på AT KATTEGENET også kan brukes som seleksjonsmarkør for chlamydialtransformasjonsforsøk. Som advart Av Wang et al., en negativ effekt av kloramfenikol på verts mitokondrier, som demonstrert Av Li et al. kan påvirke bruken av dette antibiotika for chlamydial transformasjon . I Li et al.s rapport var den minimale toksiske konsentrasjonen av kloramfenikol 10 µ / ml, noe som førte til en mild 20% reduksjon AV ATP-produksjonen. Vi har fastslått at den tilsynelatende laveste kloramfenikolkonsentrasjonen som helt hemmet inklusjonsdannelsen I plasmid-Fri C. trachomatis l2 stamme betegnet L2R var bare 0,05 µ / ml( data ikke vist), som var langt under konsentrasjonene toksiske for vertsceller. Derfor begrunnet vi at dette antibiotikumet kunne brukes til å velge KATTUTTRYKKENDE transformanter uten å understreke vertsceller betydelig.
vi transformerte L2R med pGFP:: SW2, og valgte halvparten av de transformerte cellene med ampicillin, og den andre halvparten med kloramfenikol. Antibiotikaene (2 µ / ml ampicillin eller 0,1 µ / ml kloramfenikol) ble tilsatt til kulturene ved 10 timer etter transformasjon. Fra og med passasje 2 ble konsentrasjonene økt til henholdsvis 5 og 0,2 µ/ml, og de ble tilsatt ved inokuleringstidspunktet. Splitting forholdet mellom passasjer forble 1: 1 fra passage 1 om passage 4. Selv om MIC av kloramfenikol, som ble bestemt ved lav multiplikasjon av infeksjon (~0,1 inklusjonsdannende enheter per celle), var 0,05 µ / ml, var noen av de ikke-transformerte klamydiaene forventet å danne inklusjoner i nærvær av 0,1-0.2 µ/ml antibiotikumet, fordi vi brukte et høyt EB til celleforhold for transformasjon, og effekten av klamydial veksthemming av antibiotika påvirkes av mangfoldet av infeksjon . Med den ovenfor beskrevne seleksjonsprotokollen, i kulturer valgt med ampicillin, under et fasekontrastmikroskop, ble nesten 100% celler funnet å inneholde en inklusjon med avvikende RBs ved den første passasjen. De avvikende rb-holdige inneslutninger var fortsatt tilstede i en liten andel celler ved passasje 2, men ble for det meste erstattet av tilsynelatende normale inneslutninger ved passasje 3. Normale inneslutninger ble funnet i ca 20% celler, og unormale inneslutninger ble sjelden observert ved passasje 4. Ved passasje 5, som resulterte fra inokulering med 10% høst fra passasje 4, ble inneslutninger funnet i 80% celler; tilsynelatende inneholdt ingen av disse inneslutninger avvikende RBs.
siden kloramfenikol ikke forårsaker chlamydiae til å danne avvikende RBs, vurderte vi resistens mot antibiotika ved inklusjonsstørrelsen. Inklusjoner av mindre enn normale størrelser ble påvist i nesten alle celler ved passasje 1. Noen, men svært små, inneslutninger ble funnet ved passasje 2, og de fleste av disse inneslutninger ble erstattet med normale inneslutninger ved passasje 3. Normale inneslutninger ble funnet i mer enn 20% celler ved passasje 4. Ved passasje 5, avledet etter inokulering med 10% passasje 4-innhøsting, og en økning i kloramfenikolkonsentrasjon (fra 0,2 µ / ml til 0,5@g / ml), ble inklusjoner av normal størrelse funnet i nesten 100% celler 0000000.
i tillegg til tilsynelatende motstand mot seleksjonsmidler, brukte VI gfp-uttrykk og restaurering av glykogensyntese som ekstra markører for vellykket transformasjon . EBs høstet fra passasje 5 ble brukt til å infisere McCoy-celler ved en 1: 100 fortynningshastighet (cellenummer ekvivalens) for eksperimenter som bestemmer GFP-uttrykk og glykogensyntese (Figur 2). Som forventet uttrykte Verken villtype plasmid-fylt C. trachomatis L2 (434/bu) (Figur 2A) eller ikke-transformert plasmid-fri L2R (Figur 2b) GFP. I samsvar med etablerte funn som glykogen syntese I C. trachomatis krever sitt plasmid, jod flekk viste at glykogen ble akkumulert i inneslutninger av villtype L2 (Figur 2a), Men IKKE DE AV L2R (Figur 2b). I nærvær av 5 µ/ml ampicillin, som hemmer rb-divisjon, dannet ikke-transformerte l2r (Figur 2c) inneslutninger som inneholder gigantiske RBs uten å produsere glykogen; mens kloramfenikol (endelig konsentrasjon: 0,5 µ/ml) fullstendig hemmet dannelsen av synlige inneslutninger I L2R-infiserte celler (Figur 2d). I samsvar med data publisert Av Wang et al. , pGFP::SW2-transformert L2R valgt med ampicillin dannet GFP-positive inneslutninger med glykogen (Figur 2e). PGFP:: SW2-transformert L2R valgt med kloramfenikol dannet OGSÅ GFP-positive inneslutninger som inneholder glykogen (Figur 2f). Som forventet, ampicillin-utvalgte transformanter var i stand til å danne normal størrelse, GFP-positive, glykogenholdige inneslutninger i nærvær av kloramfenikol (Figur 2g); likeledes kloramfenikol-utvalgte transformanter var helt resistente mot ampicillin, uttrykt GFP og produsert glykogen (Figur 2h). Disse resultatene tyder på AT KATTGENET i pGFP::SW2 plasmid er funksjonell i chlamydiae, og kloramfenikolresistens kan brukes som en markørmarkør for chlamydial transformasjon.
Inkludering, gfp uttrykk og glykogen syntese av pGFP:: SW2 transformanter Av C . trachomatis L2. Ikke-transformert plasmid-fylt stamme 434/bu (A), ikke-transformert plasmid-fri stamme L2R (BD) og transformert L2R valgt med enten ampicillin (E, G) eller kloramfenikol (F, H) ble dyrket enten med medium inneholdende et indikert antibiotikum eller med antibiotikafritt medium. Bilder av inneslutninger i unstained og jod-farget kulturer ble ervervet med fase kontrast mikroskopi eller fluorescens mikroskopi 48 h post-inokulering. I alle paneler er fasekontrast og GFP-bilder overlegne.
Vi fjernet neste eneste laktamase-genet fra pGFP::SW2 plasmid som beskrevet i avsnittet “Metoder”, og brukte det resulterende pgfp-CAT::SW2 plasmid for å transformere L2R. Transformerte chlamydiae ble utsatt for seleksjon med kloramfenikol ved bruk av samme regime som beskrevet ovenfor. Kloramfenikolresistente inneslutninger dukket opp i ca 20% av de infiserte cellene i kulturen i passasje 4. Fluorescensmikroskopi og jodflekk avslørte GFP – og glykogen-positive inneslutninger i celler som ble infisert Med EBs høstet fra passasje 5, og dyrket i nærvær av kloramfenikol (Figur 3, øvre panel). Som et resultat av mangel på β-laktamase i pgfp-CAT::SW2 plasmid, var transformantene imidlertid ikke i stand til å danne normale inneslutninger i nærvær av ampicillin; i stedet ble deres inneslutninger fylt med avvikende RBs. Mens de uregelmessige inneslutninger fortsatt var positive FOR GFP, var de stort sett fri for glykogen (Figur 3, nedre panel). Etter passasje 5 ble pGFP-CAT::SW2-transformantene dyrket med 0,5 µ/ml kloramfenikol for ytterligere fire passasjer med et splittringsforhold på 1:100 for hver passasje. Alle inneslutninger ved passasje 9 hadde samme utseende som inneslutninger av plasmid-fylt chlamydiae og ikke den av plasmid-fri L2R, og alle ble funnet å uttrykke GFP (data ikke vist). DISSE resultatene viser AT CAT-genet i pgfp-CAT::SW2 plasmid, som ligner på pGFP::SW2 plasmid, fungerer som en seleksjonsmarkør For c. trachomatis-transformasjon.
Inkludering, gfp uttrykk og glykogen syntese I L2R transformert med pGFP-CAT:: SW2. Celler infisert med kloramfenikol-selekterte transformatorer ble eksponert for enten kloramfenikol eller ampicillin. Bilder av inneslutninger i unstained og jod-farget kulturer ble ervervet med fase kontrast mikroskopi eller fluorescens mikroskopi 48 h post-inokulering. Fasekontrast og GFP-bilder er overlegne.
Det bør bemerkes At Tam et al. har tidligere forsøkt å utvikle et transformasjonssystem med CAT-genet som en selektiv markør . I den studien ble en shuttle-vektor som inneholdt ET KATTGEN elektroporert i EBs Av C. trachomatis E (stamme UW-5 / CX) Og L2 (stamme 434 / Bu). Selv OM BÅDE KATT mRNA og enzymaktivitet var detekterbar i de første kulturer av transformerte chlamydiae, klarte forfatterne ikke å oppnå stabile transformanter etter utvelgelse med kloramfenikol for 4 passasjer. Det er viktig å merke seg at begge elektroporerte stammer inneholder et naturlig plasmid som deler samme replikasjonsopprinnelse med rekombinant plasmid som brukes til transformasjon . Siden Wang et al. var i stand til å oppnå stabile penicillinresistente transformanter bare FRA L2R, en plasmid-fri C. trachomatis L2 variant, men ikke vill-type, plasmid-fylt 434/Bu, under ellers identiske eksperimentelle innstillinger, er det i ettertid ikke overraskende At Tam et al. klarte ikke å utlede stabil kloramfenikolresistent chlamydiae.
