Kollagen Syntese

Regulering Av Bein Kollagen Syntese

Kollagen syntese i organ kulturer av gnager calvariae og cellekulturer har blitt vurdert ved hjelp av flere forskjellige analyser . I den mest brukte analysen inkuberes calvariae og celler med radiomerket prolin i flere timer før kulturens slutt. Inkorporeringen av radiomerket prolin i kollagenase-fordøyelig protein (CDP-merking) og ikke-kollagenprotein (NCP-merking) måles i ekstrakter av kulturer ved bruk av høyrenset bakteriell kollagenase . Prosent kollagen syntese beregnes FRA CDP og NCP verdier etter korrigere for større overflod av prolin i kollagen i forhold til noncollagen proteiner . Kollagenproduksjon kan også bestemmes ved å måle hydroksyprolininnholdet i celle – eller organkulturer, siden hydroksyprolin er praktisk talt unikt for kollagener. Disse metodene skiller ikke mellom forskjellige typer fibrillært kollagen. Imidlertid er kollagenet syntetisert av beinorgankulturer og de fleste osteoblastiske cellekulturer i stor grad type i (>95%), slik at CDP-merkingsverdien vanligvis reflekterer type i kollagensyntese. Om ønskelig kan produksjonen av forskjellige kollagentyper skille seg ut ved ionbytterkromatografi og polyakrylamidgelelektroforese av radiomerkede ekstrakter av celle – eller organkulturer . Type i kollagenuttrykk i humane cellekulturer har også blitt vurdert ved å måle sekresjon av prokollagen I C-terminal propeptid . Endelig har spesifikke cDNA-prober I Nordblotting og allel-spesifikke primere i revers transkriptase-polymerasekjedereaksjonsanalyser blitt brukt til å vurdere kollagen mRNA-uttrykk i benmodeller. Måling av effekten av 1,25 (OH) 2D3 på kollagen syntese og mRNA nivåer har gitt sammenlignbare resultater ved hjelp av disse forskjellige analysene.

1,25(OH)2D3 hemmer kollagensyntese i organkulturer av 21-dagers føtalrotkalvariae og neonatal musekalvariae med liten eller ingen effekt på ikke-kollagenproteinsyntese. Maksimal inhibering av kollagensyntese ved 1,25 (OH) 2D3 i rotte calvariae (ca 50%) forekommer ved 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3d3 hemmer også kollagensyntese, men er mindre potent enn 1,25 (OH) 2D3 . 25 – (OH) D3 Og 24r,25 (OH)2D3 endrer ikke kollagensyntese under 100 nM . Vitamin d-metabolitter hemmer kollagensyntese og stimulerer resorpsjon av føtale rotte lange bein med lignende relative potenser som korrelerer med metabolitternes affinitet for Skjelett-VDRs . For å bestemme celleselektiviteten til 1,25 (OH)2D3-hemmingen av kollagensyntese, ble organkulturer av føtalrotkalvariae behandlet med 1,25(OH)2d3 for 22 h og deretter inkubert med tritiert prolin for den endelige 2 h av kulturen. Det sentrale benet (modne osteoblaster) ble dissekert uten periosteum (mindre modne osteoprogenitorer og fibroblaster) og begge avdelinger ble analysert separat for inkorporering av tritiert prolin. 1,25 (OH) 2d3 reduserer kollagensyntese i det sentrale benet, men ikke periosteumet, noe som indikerer selektivitet av 1,25 (OH)2d3-effekten for modne osteoblaster . Ved hjelp av en in vivo-protokoll der neonatale rotter ble gitt flere injeksjoner av tritiert prolin til radiomerket nylig syntetisert benmatrise, ble 25 ng av 1,25(OH)2D3 gitt på dag 1, 3 og 5 hemmet benmatrisesyntese vurdert ved histomorfometri av autoradiografer av tibia og calvariae .

1,25 (OH)2d3 hemmer også kollagenproduksjonen i rotte osteoblastisk osteosarkom ROS 17 / 2.8 celler , primære rotte og mus osteoblastceller , og en immortalized murine osteoblastcellelinje (MMB-1). 1,25 (OH) 2D3 har en større hemmende effekt på type i kollagen syntese under log fase vekst av primære murine osteoblastiske celler enn ved samløpet, kanskje fordi prolifererende celler inneholdt Flere VDRs . På samme måte er 1,25 (OH)2D3-hemming av kollagensyntese større i sparsomme kulturer AV MMB – 1-celler som har høyere vdr-nivåer enn konfluente MMB-1-celler . 1,25 (OH)2D3 inhibering av kollagensyntese er ekvivalent i sparsomme og konfluente rotte primære osteoblastceller, MEN VDR-tallet endret seg ikke under cellens vekst . Samlet viser disse dataene at omfanget av inhibering av kollagensyntese ved 1,25(OH)2D3 i stor grad bestemmes av den cellulære mengden VDRs. 1,25 (OH)2D3 hemmer kollagen mRNA nivåer i den proliferative fasen av langsiktige kulturer av rotte primære osteoblastiske celler og forhindrer dannelsen av mineraliserte bein knuter av disse kulturer . Disse studiene viser at 1,25 (OH) 2D3 hemmer differensiering av osteoprogenitors som danner mineraliserte knuter i primære rotte osteoblastiske cellekulturer . Imidlertid kan inhiberingen av noduldannelse ved 1,25 (OH) 2D3 være sekundær til undertrykkelsen av type i kollagensyntese i kulturer.

i motsetning til de hemmende effektene som er beskrevet ovenfor, stimulerer 1,25(OH)2d3 transiently kollagen og ikke-kollagenproteinsyntese (omtrent todelt), som topper mellom 12 og 24 h, I den immortaliserte murine osteoblastiske cellelinjen MC3T3-E1 . I denne studien ble ikke prosent kollagen syntetisert av kulturer (kollagen i forhold til total proteinsyntese) rapportert; som et resultat var det ikke mulig å bestemme selektiviteten av 1,25 (OH)2d3-effekten for kollagensyntese. 1,25 (OH) 2d3 øker også kollagenuttrykket i den humane osteoblastiske osteosarkomcellelinjen MG-63 OG primære kulturer av humane osteoblastceller . Interessant er økningen i kollagensyntese med 1,25(OH)2D3 I mg63-celler blokkert av insulinlignende vekstfaktorbindende protein 5, som interagerer direkte med VDR og forhindrer heterodimerization med retinoid X-reseptoren RXR . I andre studier har imidlertid 1,25 (OH) 2D3 vist seg å redusere prosent kollagen syntese I MC3T3-E1 celler . MC3T3-E1 og MG-63 representerer preosteoblastceller som gjennomgår in vitro osteogen differensiering med askorbinsyre; 1,25 (OH) 2D3 hemmer cellevekst og øker osteokalsinuttrykk og alkalisk fosfataseaktivitet i begge cellelinjer. MC3T3E1 celler, som de fleste immortalized osteoblastic cellelinjer, vise betydelig fenotypisk variasjon . Derfor kan noen av disse avvikende resultatene skyldes variasjoner i cellene som brukes til forsøkene. Samlet sett tyder disse dataene på at 1,25 (OH) 2D3 kan fungere som et differensierende hormon i tidlige celler i osteoblastlinjen, noe som resulterer i økt type i kollagenuttrykk. I kontrast hemmer 1,25(OH)2d3 type i kollagenuttrykk i modne osteoblaster.