Kolonihybridisering
Kolonihybridisering begynner med å dyrke tynt befolkede bakteriekolonier på en næringsagarplate. Disse koloniene blir symmetrisk replikert på et nitrocellulosefilter ved direkte kontakt, hvoretter cellene på filtermembranen lyseres og DERES DNA denatureres, slik at det kan binde seg til filteret. DISSE DNA-klyngene hybridiseres deretter til en ønsket radioaktivt merket RNA eller DNA-probe (valgt spesielt på forhånd) og screenes ved autoradiografi. DNA-klynger som viser et ønsket gen, matches deretter opp til de tilsvarende (levende) bakteriekoloniene, som kan isoleres for videre vekst og eksperimentering.
Definisjon Av Kolonihybridisering: – Kolonihybridisering er “Blotanalyseteknikken” der bakteriecellene overføres fra det faste næringsmediet til det absorberende materialet. Kolonihybridisering kan defineres som metoden for isolering av spesifikke DNA-sekvenser eller gener fra bakteriecellene som inneholder hybrid DNA, ved hjelp av et nitrocellulose membranfilter. Overføringsmediet går deretter gjennom flere kjemiske og fysiske behandlinger.
Overføringsmedium Av Kolonihybridisering: – nitrocellulose filterpapiret er overføringsmediet av kolonihybridiseringen som danner replikaer av hovedplaten. Nitrocellulose fungerer som en membran som inneholder de eksakte kopiene av genet til hovedplaten. Nitrocellulose filterpapir fungerer som “Blotting pad”.
kolonihybridisering innebærer følgende trinn:
Klargjøring Av Hovedplate:- Først inokuler bakteriecellesuspensjonen på det faste agarmediet for å forberede hovedplaten. Etter inokuleringen vil antall bakteriekolonier utvikle seg med forskjellige plasmider som refererer til “Master eller Referanseplate”.
dannelse av replikaer over et nitrocellulosefilter: – overfør deretter bakteriecellene fra hovedplaten til membranen eller filteret ved hjelp av “Nitrocellulosefilter”. Trykk nitrocellulose filterpapiret over overflaten av hovedplaten. Denne komprimeringen av filtermembranen vil danne kopier eller kopier av bakteriecellene som hovedplaten.
Behandling av filtermedium MED SDS: – deretter behandles nitrocellulosefilterpapiret med vaskemiddelet som Sds (Natriumdodecylsulfat) for å lyse bakteriecellene.
Behandling av filtermedium med alkali: – Behandle filtermediet med alkali som natriumhydroksyd for å skille DNA i enkeltstrenger.
Fiksering AV DNA på filtermediet:- For å fikse DNA på nitrocellulose filterpapiret, enten bake filterpapiret ved 80 grader Celsius eller utsett DET FOR UV-lyset.
Tillegg av radioaktiv sonde: – Hybridisere nitrocellulose filter papir som inneholder avtrykk av plasmid DNA ved tilsetning av radioaktiv RNA probe. Denne radioaktive rna-sonden vil kode det ønskede genet av sekvens fra bakteriecellene.
Vask Og Autoradiografi: – Vask filterpapiret for å fjerne ubundne sondepartikler. Deretter utsetter nitrocellulosefilterpapiret Til Røntgenfilmen ved hjelp av metoden som “Autoradiografi”. Kolonien som vises etter autoradiografi vil referere til som “Autoradiogram” som bærer genene av interesse.
Identifikasjon av ønsket gen:-sammenlign deretter det utviklede autoradiogrammet med hovedplaten for å identifisere koloniene som inneholder et gen av interesse.
cellene som inneholder det ønskede genet kan vokse i det flytende medium og kan videre prosess for isolering av rekombinant plasmid DNA.
Konklusjon:- Derfor kan vi konkludere med at kolonihybridiseringsmetoden er “Screeningsteknikken” som gjør bruk av den radioaktive sonden. Den radioaktivt merkede sonden skjermer eller isolerer det bestemte genet fra antall bakteriekolonier.
