Makrofagdeplesjon Ved Klodronatholdige Liposomer Reduserer Neointimal Dannelse Etter Ballongskade Hos Rotter Og Kaniner

Inflammatoriske celler spiller en viktig rolle i vaskulær reparasjon, rekruttert umiddelbart etter skade.1,2 makrofaginfiltrasjon i atherektomivev og aktiveringsstatus for blodmonocytter korrelerer med økt restenose.3,4 effektene av makrofager i restenose er sannsynligvis forårsaket av deres evne til å uttrykke mange vekstfaktorer, cytokiner og enzymer som bidrar til utviklingen av restenose.5 Dermed hypotese vi at systemisk inaktivering av monocytter og makrofager kan føre til demping av neointimal dannelse og at makrofager spiller en sentral rolle i patogenesen av restenose.

makrofagdeplesjon kan oppnås ved systemisk injeksjon av liposomer som inneholder klodronat.6 Clodronat tilhører familien av bisfosfonater( BPs), bensøkende midler som er potente hemmere av osteoklaster. Som andre BPs har clodronat dårlig cellemembranpermeabilitet.7 Liposomer tas lett opp av celler i retikuloendotelialsystemet, spesielt makrofager. Liposommediert levering av klodronat inaktiverer og dreper makrofager etter effektiv fagocytose8, men er ikke giftig for ikke-fagocytiske celler.6

Metoder

Liposomer

Klodronat (Sifavitor) Og rhodamin RE (Avanti Polare Lipider) ble innkapslet i liposomer bestående av 50 µol/L distearoyl-fosfatidylglycerol (DSPG) (AVANTI), 100 µol/l kolesterol (Sigma-Kjemikalier) og 150 µ/L av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphocholine (Dspc) (Avanti) Ved Revers-Fase Fordampning Teknikk, Som Beskrevet Andre Steder.9 gjennomsnittlig størrelse på liposomer var henholdsvis 190±18 nm, 24,5 mmol/L og 20 mmol/L, klodronat og lipider.

Validering AV LC biologisk aktivitet ble bestemt på makrofaglignende RÅ 264 celler. LC, men ikke fritt klodronat, reduserte signifikant antallet og proliferasjonen av levedyktige celler på en doseavhengig måte og påvirket ikke levedyktigheten og proliferasjonen av glatte muskelceller (Smc) eller endotelceller (EC) ved konsentrasjoner opp til 500 µ/L (data ikke vist) i samsvar med publiserte data.8,10

Kaninmodell

New Zealand Hvite kaniner (Harlan Laboratories, Jerusalem, Israel) veier 2,5 til 3.5 kg ble brukt i samsvar med retningslinjene for dyrepleie ved det hebraiske Universitetet I Jerusalem og National Institutes Of Health (USA). Dyr ble matet et atherogent diett på 2% kolesterol og 6% jordnøttolje, som startet 30 dager før angioplastikk. Hyperkolesterolemi ble fastslått (plasmakolesterol > 1200 mg / dL). Dyr ble bedøvet av xylazin (7 mg / kg) og ketamin (40 mg/kg). Heparin (200 E/kg), atropin (0,05 mg) og norfloksacin nikotinat (70 mg) ble gitt. Ballongskade ble utført på venstre arteria carotis communis med et 3 mm angioplastikk ballongkateter (Cordis, 2×1-minutters inflasjon ved 8 atm). Dyr ble randomisert til intravenøst liposomalt eller fritt klodronat (15 mg/kg), tomme liposomer eller buffer. En etterforsker blindet til typen eksperimentell gruppe utførte forsøkene. Etter eutanasi med pentotal ble arteriene perfusjonsfastsatt in situ med 150 mL 4% formaldehydoppløsning (pH 7.4), behandlet for morfometrisk analyse, og farget Med Verhoeff elastin farging, Mayer hematoxylin og eosin, og modifisert Movat pentakrom.

Rottemodell

Mannlige Sabra-rotter (Harlan Laboratories), som veide 350 til 420 g, ble brukt. Rottkarotidskademodellen ble utført som beskrevet tidligere.11,12 Liposomalt klodronat (15 mg/kg) ble injisert på dag -1 og +6. Organer ble høstet på dag 14 og behandlet som beskrevet ovenfor.

Morfometrisk Analyse

Åtte til 10 seksjoner i hvert lysbilde ble analysert ved hjelp av datastyrt morfometrisk analyse (NIH-Bilde) av en etterforsker blindet til typen eksperimentell gruppe. Seksjonen med størst luminal innsnevring av neointima ble analysert som tidligere beskrevet.11 restlumen, området som er avgrenset av den indre elastiske lamina (original lumen), og området som er avgrenset av den ytre elastiske lamina (totalt arterielt område) ble målt direkte. Graden av neointimal fortykkelse ble uttrykt som forholdet mellom området av neointima og det opprinnelige lumen (%stenose) og som forholdet mellom det neointimale området og mediaområdet (N/M). Graden av remodeling, constrictive (negativ) og ekspansiv (positiv), og remodeling ratio (RR) ble estimert ved å sammenligne forholdet mellom det totale arterielle området av ballongskadet segment med det av et tilstøtende, ikke-skadet referansesegment.

Flowcytometri

Antikoagulert blod (200 µ) ble inkubert i 30 minutter (4°C, i mørket) med mus anti-human RPE-konjugert ANTI-CD14 (DAKO). FACS lysing løsning (1: 20 fortynning) ble tilsatt i 15 minutter. Restcellene ble vasket (×1500 O / MIN, 5 minutter, 4°C) I FACS medium (PBS, 1% bsa, 0,02% natriumazid) og suspendert i 1 mL FACS medium for flowcytometri. Monocytter ble identifisert i henhold til deres relative størrelse, sidespredning og fluorescens.

Distribusjon Av Liposomer

Kaniner ble injisert med rhodamin-merkede liposomer (0,4 mg / kg) og LC eller buffer ved dag -1 og avlivet ved dag +1 og +6. Blodmonocytter ble separert ved Bruk Av Ficollgradient (Sigma) og sentrifugering (×1500 RPM, 5 minutter). Høstet vev ble skyllet i saltvann; seksjoner ble montert på lysbilder og observert ved konfokal mikroskopi (Zeiss LSM 410).

Immunhistokjemi

Eksploderte prøver ble skåret ut etter kort saltvannsperfusjon og umiddelbart frosset i OCT-forbindelse for kryoseksjonering(Ted Pella, Inc). Lysbilder ble deparaffinisert, inkubert med 1% H2O2 i metanol (10 minutter) for å blokkere endogen peroksidase, og deretter med 10% hesteserum PBS i (20 minutter). Primære antistoffer for kanin RAM-11 (DAKO) eller PCNA (PC10, DAKO) ble brukt i 1 time ved 37°C. Seksjoner ble deretter vasket med PBS etterfulgt av biotinylert sekundært antistoff (hest anti-mus IgG, Vector Laboratory) og et avidin-biotin-peroxidasekompleks (ABC Elite kit, Vector Laboratory) i 30 minutter hver. Utvikling av farge ble oppnådd ved 5-minutters eksponering for 3,3 ‘ – diaminobenzidintetrahydroklorid (dab-peroksidasesubstrat, Sigma Chemical Co) i nærvær av peroksidasesubstrat (Sigma). Lysbildene var litt counterstained Med Gill no. 3 hematoxylin (Sigma). Positiv farging ble evaluert under et mikroskop (Olympus, BX40) ved 2×/0.25 10×/0.25 forstørrelse og digitaliserte videorammer. Utbredelsen av makrofager ble vurdert som gjennomsnittlig prosentvis areal okkupert av positivt farget celler i 5 til 6 høy effekt felt.

IL-1Β Produksjon Og Transkripsjon

Separate dyregrupper ble brukt til disse studiene. Arterier og lever ble homogenisert i kollagenasebuffer og ekstrahert IL-1Β ble målt ved bruk av kommersielle ELISA-sett (R&D-Systemer).

for analyse av revers transkripsjon–polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble RNA fra karoten arterier ekstrahert ved bruk AV Et rna-isolasjonssett (Life Technologies). Kvalitet, størrelse og kvantitet av RNA ble undersøkt, og verdiene av båndene ble normalisert til β-actin mRNA-uttrykk.13

Matrix Metalloproteinase – 2-Aktivitet

supernatanten av arteriehomogenat i kollagenasebuffer ble analysert for kollagenaseaktivitet. Prøver ble separert på gelatinimpregnert (1 mg / mL: Difco) SPS 8% polyakrylamidgeler under ikke-reduserende forhold, ristet 30 minutter i 2,5% Triton X-100 (BDH), inkubert i kollagenasebuffer (16 timer, 37°C) og farget med 0,5% Coomassie G 250 (BioRad) i metanol/eddiksyre/H2O (30:10:60). Båndintensiteten ble bestemt av datastyrt densitometri (Molekylær Dynamikk TYPE 300A).

Statistikk

Data er uttrykt som gjennomsnittlig±SD. Sammenligninger av histologiske funn mellom kontroll-og behandlingsgruppen ble gjort av Den uparede Studentens T-test. Sammenligninger av blodmonocytter og cytokiner over tid ble gjort med 2-veis ANOVA-analyse. Forskjeller ble betegnet statistisk signifikant ved P< 0,05.

Resultater

Forebygging Av Postangioplastikk Hyperplasi

Massiv proliferasjon Av Smc og ekstracellulær matriksdannelse ble sett hos kontrolldyr etter ballongskade (Figur 1, a og b). Ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom behandling med tomme liposomer, saltvann eller fritt klodronat i oppløsning (resultater samlet som kontroller). N / M-forholdet var 1.4±0.44 (Figur 1e), og luminal stenose var 75±8%. LC (15 mg/kg, dager -1 og +6) redusert N / m-forhold til 0,66±0,2 (Figur 1,c, d og e) og luminal stenose til 41±8%. Mild ekspansiv remodeling oppstod i begge kontroll (RR=1. 22±0.24) og LC-behandlede dyr (RR=1.29±0.25). Medialt område, benmorfologi og mineralsammensetning ble ikke påvirket av LC-behandling (data ikke vist). Ingen åpen infeksjon og ingen påviselige systemiske bivirkninger ble observert.

for å fastslå effekten av makrofagdeplesjon i en nonhypercholesterolemisk dyremodell (ingen skumceller) ble rottens karotidskademodell brukt.11 det markerte neointima ble undertrykt ved LC-behandling, uten signifikant endring i medial og total arteriell areal(Tabell).

Virkningsmekanisme

Reduksjon Av Blodmonocytter Og Vevsmakrofager

Monocyttnivå Ved Baseline var 2,8±0,5% av hvite blodceller (WBC). Før kirurgi, 24 timer etter LC-injeksjon, ble monocytter kraftig redusert til < 0,2% av total WBC (Figur 2, a og b), MENS WBC-tallet forblir uendret. Tre dager etter operasjonen økte blodmonocytter mildt til 3,5±0,4% hos kontrolldyr og 0,7±0,7% hos LC-behandlede dyr, tilbake til baseline-nivå etter 6 dager(Figur 2c).

Lever – og miltmakrofager ble redusert ved LC (RAM 11-farging) 6 dager etter skade (Figur 3). Det positivt farvede området i leveren ble signifikant redusert fra 21.5±4% til 14.7±2.9% og i milten fra 33.3±1.5% til 11.4±3% i kontroll og LC-behandlede kaniner, henholdsvis. Tilsvarende ble redusert arteriell RAM – 11-farging for makrofager observert hos lc-behandlede kaniner 3 og 6 dager etter skade (Figur 4).

Reduksjon av monocytter og makrofager ble også påvist ved injeksjon av fluorescerende liposomer (FL). Markert reduksjon av fluorescerende signal ble observert i blodmonocytter (samt redusert antall) og i lever og milt hos LC-behandlede dyr (Figur 5). FL ble påvist i skadede, men ikke i intakte arterier. FL samtidig med LC reduserte signifikant fluorescerende signal i den skadede arterieveggen (Figur 5).

PCNA, IL-1Β Og Matrix Metalloproteinase-2

området positivt farget FOR PCNA ved 6 dager Etter skade ble signifikant redusert fra 5.6±2.6% hos kontrolldyr til 1.7±1.3% hos LC-behandlede kaniner(Figur 6, a og b). Neointima ble knapt observert på dette tidlige tidspunktet HVOR smc-spredning er maksimal.

Analyse AV IL-1Β nivåer i arterielt vev etter skade viste et klokkeformet mønster topp 6 dager etter skade og tilbake til basale nivåer etter 30 dager (Figur 7a), og en signifikant reduksjon AV IL-1Β nivåer ble observert etter 3 og 6 dager hos LC-behandlede dyr. HOS kontrolldyr var IL-1Β mRNA-transkripsjon sterkere på dag 3 enn svakere uttrykk 1 dag etter skade, men begge ble signifikant redusert ved LC-behandling (Figur 7b). IL-1 hryvnias nivåer i leveren ble også redusert etter en enkelt injeksjon MED LC på dag -1, og skrånet til basale nivåer etter 30 dager (data ikke vist).

Arteriell matriksmetalloproteinase (MMP-2) – aktivitet økte etter skade, med et klokkeformet mønster som toppet seg etter 6 dager (292±46) og gikk tilbake til basale nivåer etter 14 dager(Figur 7c). LC lindret BETYDELIG MMP – 2-aktivitet, og på dag 6 var det bare 52±17.

Diskusjon

denne studien viser for første gang at inaktivering av makrofager ved systemisk administrasjon av liposominnkapslet klodronat hemmer luminalt tap etter ballongskade hos både rotter og hyperkolesterolemiske kaniner. Disse resultatene validerer vår hypotese om at makrofager spiller en sentral rolle i patogenesen av akselererte arteriopatier. Den observerte økningen i luminalområdet ble oppnådd hovedsakelig ved reduksjon av neointimal hyperplasi. En mild økning i ekspansiv remodeling ble også demonstrert, men bidraget til forskjellen i luminalområdet var minimal.

Clodronate tilhører familien Av BPs, legemidler som brukes klinisk i beinrelaterte lidelser, inkludert osteoporose. Å være svært hydrofil og negativt ladet, er fri BPs nesten ikke i stand til å krysse cellemembraner.7 BP opptak av beinresorberende osteoklaster (opprinnelse som makrofager fra blodmonocytter) oppstår når cellene sluker legemiddelbelagt ben.7 verken fritt klodronat eller LC hemmet SMC eller EC proliferasjon eller neointimal dannelse. Effektiv og selektiv endocytose av clodronat i makrofager oppnås ved innkapsling av clodronat i liposomer.9,10,14 etter fagocytose forstyrrer lysosomal virkning fettlagene av liposomet og fri klodronat slippes ut i cellen, forårsaker irreversibel funksjonell skade og apoptose.8,15

LC administrasjon sannsynligvis avbrutt tidlig fase respons på skade, som er mediert av makrofag migrasjon i respons TIL MCP-1 uttrykk.16 Injeksjon AV LC før skade kraftig uttømt blodmonocytt (Figur 2) og makrofag antall og aktivitet i leveren, milten, og skadet arterieveggen (Figur 3, 4 og 5). Reduksjonen i tilgjengelige monocytter ved skadetidspunktet reduserte intimal hyperplasi, kanskje tilsvarende effektene som ble sett ved deaktivering av blodmonocytter VED IL-10.17 – blokkering av monocytt/makrofag-migrasjon til det skadede kar fra lumen og / Eller adventitia (Figur 5) forhindret effekten av disse cellene på smc-migrasjon og-proliferasjon.

IL-1Β og MMP-2 nivåer ble redusert i skadede arterielle segmenter etter LC-behandling. Disse hovedproduktene av aktiverte makrofager, utskilt etter arteriell skade, bidrar til prosessen med neointimal proliferasjon.18-20 Redusert smc-spredning kan også bidra til reduksjon AV IL-1Β Og MMP-2.21 Likevel, SIDEN LC ikke påvirker SMCs og ECs og ikke har noen effekt på fibroblaster,9 er makrofagen sannsynligvis det primære målet for LC. Hemmingen av intimal hyperplasi i rottemodellen, uten skumceller i arterien, støtter videre systemisk uttømming av makrofager ettersom mekanismen driver redusert smc-proliferasjon og neointimal dannelse. Samlet sett reduserte denne forbigående systemiske immunmodulerende og antiinflammatoriske effekten smc-migrasjon og proliferasjon og arteriell restenose.

våre funn er samtidige med de gunstige effektene observert etter modulering av makrofagfunksjon ved ulike modaliteter. Redusert neointima-dannelse etter skade ble oppnådd hos kaniner ved blokade Av Mac-122 og Hos mac–1-mangelfulle mus.23 Således, i samsvar med nyere rapporter, 9,17,22,23 den inflammatoriske prosessen spiller en sentral rolle i kaskaden av neointima dannelse. Makrofagutarmning reduserer også hyperplasi av venetransplantater.24 Til tross for den forskjellige patologien når det gjelder trigger, berørt kar, den underliggende plakken i den angioplasterte arterien, sammensetningen av det stenotiske vevet og prosessens varighet, antyder den positive effekten i ventransplantasjonsmodellen en felles rolle makrofager har i å stimulere vaskulær intimal hyperplasi.

Implikasjoner Og Begrensninger

Fritt klodronat gjennomsyrer ikke celler og har kort halveringstid i systemisk sirkulasjon.6 Klodronat som lekker fra døde makrofager og liposomer, akkumuleres ikke i betydelig grad i andre vev enn bein. Ingen effekt ble sett på somatisk vekst eller på serummineralinnhold etter LC-behandling, da utfallet av liposomalformuleringen, som med de fleste andre liposomer og partikkelformuleringssystemer, var i retikuloendotelialsystemet. Videre skal to injeksjoner med 15 mg/kg fritt klodronat ikke ha noen effekt på normalt benvev.25

Inaktivering av makrofager bærer faren for immunosuppresjon og infeksjon. Som i studier På Mac-1-mangelfull mice26 og rotter ble det imidlertid ikke observert 24 åpen infeksjon i vår studie med forbigående makrofagdeplesjon. Blodmonocytter ble fullstendig restituert i denne studien 6 dager etter injeksjon, OG IL-1Β konsentrasjoner gikk tilbake til basale nivåer. Andre har vist at gjenvinning av makrofagfunksjon 4 til 6 dager etter lc-indusert deplesjon induserer ingen langsiktige toksiske effekter.6,14 de kliniske implikasjonene av forbigående, delvis uttømming av lever-og miltmakrofager med systemisk LC bør undersøkes nærmere i studier på mennesker.

et stort antall rapporter om farmakologiske forsøk på å hemme intimal hyperplasi hos dyr ble ikke oversatt til etterfølgende inhibering av restenose hos mennesker. Den nåværende studien bruker LC som et undersøkende verktøy for å belyse rollen som betennelse i vaskulær reparasjon og mulig verdi av modulerende medfødt immunitet i reduksjon av postinjury intimal hyperplasi. At fordelen ble observert i to dyremodeller, rotte og hyperkolesterolemisk kanin, med ulik skade og forskjellige grader av betennelse, støtter monocytes og makrofagers hovedrolle i vaskulær reparasjon og øker den prediktive verdien for hemming av restenose hos mennesker.

makrofagrike områder er utbredt i aterosklerotiske lesjoner hos pasienter med ustabil angina og akutt myokardinfarkt, 3 og makrofager sannsynligvis medierer ruptur av aterosklerotisk plakk og plutselig utbrudd av akutte koronarsyndrom.27 Videre studier er berettiget til å undersøke om makrofagdeplesjon ved liposomale bisfosfonater kan gi en strategi for å stabilisere andre inflammatoriske medierte vaskulopatier og kardiomyopatier, inkludert akutte koronarsyndrom.

som konklusjon hemmet administrering av LC neointimal proliferasjon etter ballongskade hos rotter og i hyperkolesterolemiske kaninmodeller. Den foreslåtte mekanismen er systemisk selektiv, forbigående modulering av monocytt / makrofagaktivitet. Makrofager, selv om det er relativt mager i neointimalt vev, spiller en viktig rolle i prosessen med neointimal proliferasjon. Derfor, tidlig modulering og inaktivering av makrofager i 1 uke etter skade betydelig redusere postangioplastikk arteriell innsnevring på et senere tidspunkt.

Fotnoter