Minimumsinformasjon For Rapportering Av KOMETANALYSEN (MIRCA): anbefalinger for beskrivelse av kometanalyseprosedyrer og resultater

MIRCA-retningslinjene er laget av medlemmer av hCOMET COST Action med mål om å forbedre analysen og rapporteringen av kometanalyseresultater (http://www.hcomet.eu/). Forfatterne er kometanalyseeksperter med minst åtte års erfaring med disse analysene (15 av forfatterne har >20 års relevant erfaring). Vi har brukt et internettbasert spørreskjema for å prøve meninger fra forfatterne om viktigheten av rapporteringsdetaljer (Tabell 1; Supplerende Data). Hver del av informasjonen ble gradert av forfatterne som ‘essensiell’,’ ønskelig ‘eller’ ikke viktig’, og en terskel på ≥75% kongruens ble brukt for klassifiseringene. Hvis antall ‘essential information’ – svar ikke nådde terskelen til 75% – avtalen, ble’ essential information ‘og’ onskelig information ‘ – svar kombinert, og informasjonen ble klassifisert som ‘ønskelig informasjon’ hvis ≥75% – forfattere var enige om at det var enten ‘essensielt’ eller ‘ønskelig’. I Tabell 1 inneholder vi forklarende notater for hver anbefaling.

Spesifikke MIRCA-anbefalinger for hvert trinn i kometanalysen

Trinn 1A: Isolering av celler og fremstilling av enkeltcellesuspensjoner

når kometanalysen bruker suspensjoner av enkeltceller, må prøver som ikke er oppnådd som enkeltceller behandles mekanisk eller enzymatisk for å forstyrre feste av celler til en ekstracellulær matrise eller til hverandre. Homogenisering av vev ved mekanisk forstyrrelse kan i seg selv forårsake DNA-skade, mens den enzymatiske fordøyelsen av vev kan føre til fjerning AV DNA-lesjoner på grunn av aktiviteten til endogene DNA-reparasjonsenzymer, eller øke DNA-skadenivåene ved å frigjøre nukleaser fra cellene. Sammensetningen av homogeniseringsbufferen er ‘ønskelig’ informasjon, spesielt med hensyn til komponentene som er nødvendige for å bevare DNA-integritet (f.eks. etylendiamintetraeddiksyre)24,25. En beskrivelse av prosedyren for isolering av enkeltcellesuspensjoner, inkludert homogenisering av vevet, anses å være’ ønskelig ‘ informasjon å rapportere i artikler.

Blodprøver brukes ofte i humane biomonitoringstudier. Fordi blod representerer en heterogen populasjon av celler, er detaljert informasjon om cellepopulasjonen ‘viktig’ i publikasjoner. Teksten skal nøyaktig beskrive om prøvene er fullblod( inkludert røde blodlegemer), leukocytter, mononukleære blodceller eller en undergruppe av celler (f.eks. lymfocytter). Det kan også være nyttig å inkludere informasjon om prosedyren for venepunksjon, type antikoagulant og påfølgende metode for celleisolasjon (dvs. sentrifugering og vasketrinn) for de som gjentar eksperimentet, så dette er klassifisert som ‘ønskelig’ informasjon. Informasjon om lagringsforholdene til celler eller vev hvis de er kryopreservert, samt frysemetoden (f.eks. snapfrysing på tøris eller i flytende nitrogen, eller en langsom fryseprosedyre) og tiningsprosedyre, anses som viktig informasjon å rapportere, da disse prosessene har vist seg å påvirke basalnivået AV DNA-migrasjon26.

Trinn 1B: Fremstilling av substratceller for IN vitro DNA repair assay

enhver eukaryotisk celletype kan brukes som en substratcelle for IN vitro DNA repair assay, og celletype og tetthet er ønskelig informasjon å rapportere. Det er viktig å rapportere metode og type gentoksisk forbindelse som brukes til å indusere DNA-lesjoner i substratcellene og påfølgende cellelagringsforhold, mens det totale NIVÅET AV DNA-lesjoner som kan detekteres i substratcellene (f. eks., antall formamidopyrimidin DNA glykosylase-sensitive steder i celler behandlet Med Ro19-8022 plus lys) anses å være ‘ønskelig’ informasjon.

Trinn 1c: Analysekontroller

i denne artikkelen refererer analysekontroller til prøver som inngår i hvert kometanalyseeksperiment; disse kalles noen ganger referansestandarder, interne kontroller eller tekniske kontroller16,27. Analysekontrollene er typisk kryopreserverte alikvoter fra en enkelt gruppe celler som har blitt utsatt FOR ET DNA-strengbrytende middel (f. eks., ioniserende stråling, hydrogenperoksid eller metylmetansulfonat) eller en behandling som forårsaker en bestemt TYPE DNA-lesjon (f. eks. fotosensibilisatoren Ro19-8022 pluss lys, eller kaliumbromatbehandling, for å indusere DNA-oksidasjon). Det er forskjellige analysekontroller for standard alkalisk kometanalyse og enzymmodifisert kometanalyse. Forbindelsen som brukes til den enzymmodifiserte analysen, bør ikke generere DNA-trådbrudd, da disse reduserer det dynamiske området for de enzymfølsomme stedene. I biomonitoringstudier, samt tverrsnittsstudier, intervensjonsstudier og kliniske studier, kan ueksponerte celler brukes som analysekontroller. Det er viktig å rapportere skadenivåer i analysekontroller og analysevariasjon (standardavvik) i både standard-og enzymmodifisert kometanalyse.

IN vitro DNA repair assay bruker interne eksperimentelle kontroller, som også brukes i beregningen av reparasjonsaktiviteten, i stedet for analysekontroller per se. Det er viktig informasjon å rapportere NIVÅET AV DNA – reparasjonsinnsnitt i nukleoider fra (i) ikke-eksponerte substratceller inkubert med reaksjonsbuffer, for å bestemme basalnivået FOR DNA-skade i substratets DNA (dvs. ‘bakgrunnskontrollen’); (ii) eksponerte celler inkubert med reaksjonsbuff, for å avsløre nivået av eventuelle ikke-spesifikke DNA-strengbrudd eller abasiske steder som følge av behandlingen med det skadelige stoffet (dvs. behandlingskontrollen); (iii) ikke-eksponerte substratceller inkubert med proteinekstrakt fra prøven, for å sjekke for ikke-spesifikk snittaktivitet eller spaltningsaktivitet( dvs. ‘spesifisitetskontroll’); og (iv) eksponerte substratceller inkubert med lesjonsspesifikt enzym, tilsvarende analysekontroller for enzymmodifisert kometanalyse (dvs. ‘inkubasjonsreaksjonskontroll’).

Trinn 1d: Negative og positive kontroller

i denne artikkelen refererer negative og positive kontroller til forsøksgruppene, som beskrevet I OECD-retningslinjen (TG 489)for in vivo-kometanalysen i dyrevev18. Dermed gjelder negative og positive kontroller for hele eksperimentet. En positiv kontroll refererer til en direkte eller indirekte virkende gentoksisk forbindelse som produserer DNA-strengbrudd eller enzymfølsomme steder oppdaget med kometanalysen. For den enzymmodifiserte kometanalysen er det ingen liste over positive kontroller tilgjengelig som tilsvarer forbindelsene OECD lister som positive kontroller for alkalisk kometanalyse (for å indusere DNA-trådbrudd) i spesifikt animalsk vev. I tillegg eksisterer det ikke en positiv kontroll for humane biomonitoreringsstudier, da friske mennesker ikke bevisst kan bli utsatt for et gentoksisk middel. Positive kontroller er allerede ansett som obligatoriske i cellekulturforsøk i genetisk toksikologi og vil de facto være ‘viktig’ informasjon i artikler som bruker kometanalysen. I dyrestudier, men for praktiske formål komet data på analysekontroller (dvs., prøver nevnt i avsnittet ovenfor med tittelen ‘Trinn 1c, Analysekontroller’ ) er tilstrekkelig, mens resultater fra ekte negative og positive kontroller anses å være ‘ønskelig’ informasjon.

Trinn 2: Embedding av cellene i agarose

kometanalysen ble opprinnelig utviklet ved hjelp av tre lag agarose på glassglass, med mellomlaget som inneholder cellene. Det øverste laget av agarose er imidlertid ikke nødvendig, og visse prosedyrer bruker ikke et bunnlag(F. Eks. Det er ønskelig å rapportere type lysbilder og størrelse (dvs., overflateareal) av gelene, da andelen av cellene nær kanten av gelen øker etter hvert som gelstørrelsen minker og DNA i nukleoider ved kanten av gelen kan migrere forskjellig fra det i nukleoider mot midten av gelen22. Den endelige konsentrasjonen av agarose (med cellene innebygd deri) er ‘viktig’ å rapportere, da migrering AV DNA avhenger av tettheten av gelen.

Trinn 3: Lysis av cellene

det er flere prosedyrer for lysing av celler i kometanalysen. Informasjon om sammensetningen av lysisløsningen er ‘viktig’. Et ekstra enzyminkubasjonstrinn (f. eks. med proteinase K) kan være nødvendig for visse typer celler, og detaljer om inkubasjonen bør også rapporteres som viktig informasjon. Noen rapporter tyder på at varigheten av lysis kan påvirke stabiliteten til VISSE TYPER DNA-lesjoner28,29, 30, så varigheten av lysis og temperaturen til lyseoppløsningen er ønskelig informasjon å rapportere.

Trinn 4A: I den enzymmodifiserte kometanalysen

da lyseoppløsningen kan hemme aktiviteten til reparasjonsenzymet, er det ønskelig å fastslå om et vasketrinn ble utført mellom lysetrinnet og enzymbehandlingen (dvs. sammensetning av vaskebufferen, antall vasker og varighet). Det er viktig å videresende informasjon om kilden til reparasjonsenzymer, da enzymer fra forskjellige produsenter har vist seg å variere i både deres aktivitet og deres spesifisitet mot nukleobase lesjoner16. I de fleste kometstudier utføres titreringskurveeksperimenter for å identifisere optimale forhold for enzymbehandling31; resultatene av enzymtitreringskurver rapporteres imidlertid sjelden og klassifiseres her som ‘ønskelig’ informasjon (referanse til en tidligere studie kan gjøres i stedet), selv om vi anser det som ‘viktig’ å rapportere behandlingens varighet og temperatur. Konsentrasjonen av enzym påført gelen er viktig informasjon; det er å foretrekke å rapportere konsentrasjonen i enzymatiske enheter (U/ml), selv om proteinkonsentrasjonen (mg/ml) også er nyttig. Inkubator, lysbilde vollgrav eller 12-gel system) og modus for inkubasjon er ‘ønskelig’ informasjon å rapportere. Det skal angis om inkubasjonen ble utført (i) i et enzymbad eller med en dråpe og deksel på lysbildet, (ii) i en standard 2-gel-versjon, 12-gel eller flere brønnsystem eller (iii) i en fuktet boks i en inkubator, på en varmeplate eller i en oppvarmet glidegrave.

Trinn 4B: For IN vitro dna repair assay

er det ønskelig å rapportere antall celler eller masse av vev som brukes til å forberede proteinekstraktene, mens det er viktig å rapportere den endelige proteinkonsentrasjonen av celle – eller vevekstrakter som legges til substratets DNA. Sammensetningen av ekstraksjonsbufferen (‘ønskelig’ informasjon) er mindre avgjørende enn sammensetningen av inkubasjonsbufferen (‘essensiell’ informasjon), fordi sistnevnte kan påvirke bakgrunnsnivået FOR DNA-migrasjon. I tråd med informasjonen for den enzymmodifiserte kometanalysen, er det ønskelig å rapportere resultatene fra titreringsforsøk eller referere til tidligere studier fra samme laboratorium, hvor disse er utført. Volumet av ekstrakt tilsatt til gel-embedded substrat celler er ‘ønskelig’ informasjon. Det er viktig å rapportere varigheten og temperaturen i inkubasjonsperioden fordi disse påvirker antall reparasjonsinnsnitt. Når det gjelder den enzymmodifiserte kometanalysen, er inkubasjonsmodusen ‘ønskelig’ informasjon å rapportere for in vitro reparasjonsanalysen. Informasjon om identiteten til enzymet som brukes som inkubasjonsreaksjonskontroll (indikerer mengden AV DNA-lesjoner i substratcellene) og sammensetningen av bufferen som brukes til bakgrunnsnivået FOR DNA-reparasjonsinnsnitt i ueksponerte substratceller er ‘essensielle’, fordi de er nøkkelen til å demonstrere påliteligheten AV DNA-reparasjonsinnsnittaktiviteten.

Trinn 5: Alkalisk behandling

den høye alkaliske ph-løsningen forstyrrer hydrogenbindingen som holder DNA-trådene sammen og omdanner også visse nukleobaselesjoner til DNA-strengbrudd. Således kan varigheten av alkalisk behandling påvirke nivået AV DNA-migrasjon i den etterfølgende elektroforese32, 33, 34. Spesifikk informasjon om sammensetningen av den alkaliske oppløsningen, pH, temperatur og varighet av behandlingen er derfor viktig informasjon å rapportere.

Trinn 6: Elektroforese

de viktigste driverne FOR DNA-migrasjon er varigheten av elektroforese og det elektriske potensialet (spenningsfall over elektroforese tankplattformen)35. Det er’ viktig ‘ at sammensetningen av elektroforese buffer, styrken av elektroforese (spenningsgradient (V/cm) over elektroforese tank plattform) og varigheten av elektroforese er rapportert. Høy temperatur under elektroforese kan påvirke DNA-migrasjonen36; dermed er informasjon om temperaturen i elektroforeseoppløsningen ‘viktig’, og dette kan ledsages av beskrivelser av trinn som er tatt for å holde temperaturen konstant (f.eks. kjøling av plattformen eller sirkulering av bufferen).

Trinn 7: Nøytralisering

dette trinnet innebærer å fjerne overflødig alkalisk løsning fra lysbildene for å sikre effektiv farging. Det er ønskelig å beskrive sammensetningen av nøytraliseringsløsningen.

Trinn 8: Farging og visualisering

DNA-bindende fargestoffer har ulik bindingsaffinitet TIL DNA og kan derfor påvirke beregningen av de primære kometanalysebeskrivelsene i bildeanalyseprogramvaren forskjellig36,37,38. Typen fargestoff er ‘viktig’ informasjon, mens konsentrasjonen er ‘ønskelig’ informasjon, som er tiden mellom farging og visualisering. Lysets intensitet fra forskjellige typer mikroskoplamper varierer. I tillegg varierer det på grunn av lampens alder og tiden den er slått på under scoring av kometer. Det er imidlertid ingen standard prosedyre for å måle intensiteten av lys og korrigere NIVÅET AV DNA-migrasjon tilsvarende. Videre kan den samme kometen synes å ha forskjellige NIVÅER AV DNA-migrasjon ved forskjellige mikroskop-forstørrelser. Dermed er det ‘ønskelig’ å rapportere mikroskop forstørrelse brukes for scoring. Det er ønskelig å vise representative bilder av kometer (f. eks., kontroll med liten eller ingen migrasjon, moderat OG omfattende DNA-migrasjon) sammen med de rapporterte NIVÅENE AV DNA-migrasjon.

Trinn 9A: Scoring og dataanalyse

dette trinnet krever rapportering av ‘viktig’ informasjon for den primære kometanalysebeskrivelsen (f. eks.. %DNA i hale, hale lengde, hale øyeblikk eller visuell score), antall kometer som analyseres per prøve og hvordan det totale NIVÅET AV DNA-migrasjon uttrykkes(f. eks. Det er ikke viktig å rapportere det individuelle resultatet av hver komet i hver gel; de er kombinert for å beregne det totale skadenivået. Da det ikke kan utelukkes at ulike programvarepakker for bildeanalyse kan ha forskjellige måter å beregne den primære kometanalysen, er det viktig å rapportere programvaren som brukes (programvarenavn, produsent, versjon). Alle primære beskrivere deler begrensningen at det er nødvendig å ha kompetanse i kometanalysen for å forstå hva de betyr, mens hvis en kalibreringskurve opprettes (ved hjelp av ioniserende stråling, som induserer brudd ved en kjent frekvens), kan resultatene konverteres til relativ lesjonsfrekvens sammenlignet med uendrede nukleotider eller nukleobasepar; slike data er utvetydige og formidler informasjon som alle forskere kan forstå39. Prosedyren for å oppnå en kalibreringskurve, ved hjelp av ioniserende stråling, og konvertere DNA-migrasjonsnivåer til lesjonsfrekvensen i forhold til uendrede nukleotider eller nukleobasepar har blitt rapportert tidligere40. Det er derfor ønskelig å rapportere resultatene som nivåer av lesjoner per 109 uendrede nukleotider eller 106 nukleobasepar.

Trinn 9B: Beregning av enzymsensitive steder eller netto antall snitt i substrat DNA for IN vitro DNA repair assay

inkubasjonen med DNA repair enzymer øker NIVÅET AV DNA-migrasjon, da både basalnivået AV DNA-trådbrudd og enzymspesifikke lesjoner bidrar til totalt ANTALL DNA-trådbrudd. ETTERSOM dna-migreringen som tilskrives basalt nivå AV DNA-skade og enzymspesifikke lesjoner kan stamme fra forskjellige mekanismer for gentoksisitet, er DET ikke tilstrekkelig å kun rapportere det totale NIVÅET AV DNA-skade etter enzymbehandling. I stedet er det viktig å rapportere gentoksisiteten som enzymfølsomme steder, hvor DET basale NIVÅET AV DNA-migrasjon har blitt trukket fra DNA-migrasjonen i de enzymbehandlede lysbildene.

DA IN vitro DNA repair assay bruker de samme substratcellene med alle celle – eller vevsekstraktprøver, er det unødvendig å ha samtidige bakgrunns-og behandlingskontroller for hver prøve i samme eksperiment (dvs.analysekjøring). Det kan være mer enn ett substrat (f. eks., ved analyse av både base-og nukleotid-eksisjonsreparasjonsaktivitet), og derfor er det nødvendig med separate kontroller for HVER TYPE DNA-reparasjonsanalyse. Det er’ viktig ‘ å rapportere netto snitt av reparasjon ekstrakt i substratet DNA.

Trinn 9C: Statistisk analyse av resultatene

Statistiske analyser er ‘essensielle’. Typen statistisk analyse avhenger av utformingen av studien og følger de generelle forutsetningene i statistisk testing i genetisk toksikologi og biomonitoring41,42.