Påvisning OG identifikasjon VED PCR AV Clostridium chauvoei i kliniske isolater, bovin feces og substrater fra biogassanlegg
Prøver fra mistenkte tilfeller av blackleg
for muskelprøver fra mistenkte tilfeller av blackleg, resultatene fra kultur PÅ FAA-plater etterfulgt av pcr fra kolonimateriale Var I Samsvar med, eller utført enda bedre, enn den biokjemiske identifikasjonsmetoden (tabell 2). Disse resultatene er i samsvar Med Uzal et al. . DENNE studien viste AT DNA-preparering fra kultur før PCR ga bedre resultater enn PCR brukt direkte på biomasse.
Kultur etterfulgt av biokjemiske identifikasjonsmetoder er komplisert i prøver med høyt innhold av forurensende flora på grunn av behovet for ren kultur og følsomheten var vesentlig lavere enn for kultur og PCR. I åtte tilfeller var Det umulig å oppdage c. chauvoei ved kultur og biokjemisk identifikasjon, men organismen ble detektert VED PCR (Tabell 2). For å gjøre en diagnose av blackleg, blir muskelvev tatt ved obduksjon siden mengden C. chauvoei sannsynligvis er høyere i muskelvev enn i blod. Enkeltblodprøven ble feil tatt, men spørsmålet var blackleg.
På Samme måte, i en tidligere studie av et blackleg-utbrudd, ga kultur og deteksjon av PCR bedre resultater enn biokjemisk analyse . I et av tilfellene ble primærkultur av en muskel på en blodagarplate overgrodd Av C. septicum, men ga klare positive resultater For C. chauvoei I PCR.
i de fleste kliniske tilfeller av blackleg er Mengden C. chauvoei i infisert vev er høyt og kan lett oppdages AV PCR-metoden uavhengig av forurensende flora. VIDERE ER PCR-metoden mye raskere enn den tradisjonelle biokjemiske deteksjonsmetoden, som tar minst fem dager, og det er viktig å ha en ren kultur av stammen, noe som kan kreve ekstra tid for kultur. For å unngå forurensende flora bør muskelvevet ikke være for lite; omtrent 100-200 g ville være tilstrekkelig. Uten ren kultur kan ingen stammer være for etterfølgende studier i fremtiden, noe som er en ulempe ved Å bruke PCR-deteksjon som eneste metode.
HOS storfe eksperimentelt infisert Med C. chauvoei BLE PCR-analyser utført på hakket muskel og andre organer, Og C. chauvoei ble påvist i alle testede organer . Hakkede muskelstykker fra mistenkte tilfeller av blackleg ble direkte testet AV PCR og sammenlignet med kultur. Deteksjonen ved PCR ga bedre resultater enn kultur og biokjemisk identifikasjon, noe som er i uenighet med resultatene i den foreliggende studien hvor bare 12% (3 av 24) av blod-eller muskelbitene var over deteksjonsgrensen FOR PCR, mens 9% av kjøttjuiceprøvene var over deteksjonsgrensen (Tabell 2). Inhibitoriske stoffer er sannsynligvis tilstede i muskelvev. Hemmere for DEN enzymatiske reaksjonen AV PCR-forsterkning er identifisert i lever, milt og nyre, og det kan være lignende hemmere tilstede i muskelvev. Resultatene fra muskelstykker macerated i sterile fysiologiske saltvannsprøver (26%) samsvarer ikke godt med de av den biokjemiske testen. Direkte PCR på muskelvev eller andre lignende prøver er sannsynligvis ikke egnet for å erstatte kulturtrinn etterfulgt av biokjemiske tester eller VED PCR.
muskelprøver innsamlet med vattpinner
for å undersøke om det er nødvendig å sende muskelvev for analyse Av C. chauvoei eller om det er tilstrekkelig å bruke vattpinner for prøveinnsamling, ble en posttjeneste simulert. Av de 22 undersøkte muskelvevene var 64% over deteksjonsgrensen FOR PCR. For vattpinner fra de samme prøvene etter postsimuleringen var 36% til 47% vattpinner over deteksjonsgrensen (Tabell 3). Det ville være mer praktisk å ta prøver med swabs i stedet for muskelvev hvis swabs er tilstrekkelig for analyse Av C. chauvoei. Muskelvev ga imidlertid flere positive prøver enn vattpinner da begge ble analysert etter kultur og PCR (Tabell 3). Forekomsten Av C. chauvoei på vattpinner fra de positive muskelvev tilfeller syntes å være tilfeldig. Derimot, det syntes å gjøre liten eller ingen forskjell om vattpinner ble lagret for 1, 3 eller 6 dager.
Prøver fra biogassanlegg
Clostridium chauvoei ble påvist i 3 prøver av 11 i biogass substrat før pasteurisering, men Det kunne ikke påvises etter pasteurisering eller etter fordøyelse (Tabell 4). Bakteriene i slike prøver kan stamme fra gjødsel eller fra animalske biprodukter fra slakteriet, da begge disse kildene brukes til biogassproduksjon. Ingen av gårdene som er samplet i denne studien, sender gjødsel til biogassanleggene på grunn av den geografiske avstanden, men dyr sendes til det lokale slakteriet. Det er også rapportert tilfeller av blackleg i nedslagsfeltet til biogassanlegget.
etter biogassbehandling brukes de fordøyede restene som gjødsel. Sporedannende bakterier kan overleve pasteurisering og fordøyelse i biogassanlegg, og fordøyede rester fra biogassanlegg kan derfor være i stand til å spre blackleg til nye områder. Men Ingen C. chauvoei ble påvist i bearbeidet produkt, så kanskje miljøet i kokeren ikke er egnet For C. chauvoei, eller floraen i kokeren vokser Ut C. chauvoei. Clostridial sporer kan overleve i lange perioder i jord, som må tas i betraktning i videre studier På C. chauvoei i fordøyer.
prøver fra gårder
til tross for at alle gårder undersøkt hadde rapportert mistenkte tilfeller av blackleg de siste årene, testet alle prøver fra avføring, jord og ensilasje negativt For C. chauvoei. Det kan være flere forklaringer for dette. Sporer kan fortsatt være tilstede i materialet, men under deteksjonsnivået. VIDERE KAN PCR-hemmere være tilstede i prøvene og PCR kan hindres . Storfe feces inneholder flyktige fettsyrer (VFA) og jordprøver kan inneholde spor av metall, som begge er kjent for å forstyrre PCR reaksjon. Kulturtrinnet før PCR reduserer imidlertid påvirkning av hemmende stoffer.
Siden C. chauvoei er en jordbakterie noen sesongvariasjoner kan forekomme, for eksempel kraftig nedbør kan bidra til spredning av sporene og mengden sporer i jorda kan være mer tilgjengelig for storfe. De fleste prøvetakingene ble utført tidlig på høsten når været var solrikt, og dermed ville konsentrasjonen av sporer i prøvene forventes å være lav. Antall prøver kan ha vært utilstrekkelig for påvisning av miljøforurensning. Av praktiske årsaker er imidlertid svært høye antall miljøprøver sjelden tilgjengelige fra feltet.
Mistenkte tilfeller av blackleg på gårdene hadde hovedsakelig forekommet hos kalver og kviger, men en gård rapporterte en sak hos en voksen ku. Syv av de elleve gårdene A-K hadde vaksinasjonsrutiner på plass ved prøvetaking (Tabell 1).
To av gårdene lagret gjødsel før spredning og de andre gjorde det ikke, men ingen av gårdene spredte gjødsel på beite. Lokale veterinærer har etter sigende sett flere tilfeller av blackleg etter rydding av busker på Øya Ö, spesielt På Alvaret(en ufruktbar kalksteinslette, nesten 40 km lang og 10 km bred, med spesiell flora avhengig av tynn jord og høy pH). Alvaret brukes vanligvis som beite ved nabogårdene. Ikke mye busking clearing hadde blitt gjort i året av prøvetaking.
PCR
Kulturelle prosedyrer er dyre og tidkrevende, og forurensning med andre anaerobe bakterier som vokser C. chauvoei forårsaker ofte problemer . VED BRUK AV PCR forsterkes DNA fra både levedyktige og ikke-levedyktige celler. Hvis bare levedyktige celler skal oppdages, kan et anrikningstrinn brukes . I denne studien ble KULTUR PÅ FAA-plater før PCR brukt for å unngå deteksjon av ikke-levedyktige bakterier og falske positive PCR-reaksjoner. DNA er lett å forsterke fra rene kulturer, men problemer oppstår med forurensede prøver, for eksempel prøver fra bioavfall. Påvisning AV DNA VED PCR kan hindres av mange stoffer, inkludert humic syrer, VFA, fett og proteiner . Kulturtrinnet før PCR ble imidlertid brukt som et anrikningstrinn og reduserer derfor påvirkning av hemmende stoffer. På grunn av den svermende floraen kunne INGEN rensing FRA FAA-platene gjøres.
Deteksjonsterskel FOR PCR-metoden
deteksjonsnivået var 200 cfu / g. Dette kan synes å være et dårlig deteksjonsnivå, men det kan forklares ved at prøver som gjødsel, jord og biogass substrat er sterkt forurenset av den omkringliggende floraen. Sasaki rapporterte et deteksjonsnivå på 10 cfu / g, tilsynelatende i renere prøver. Men siden deteksjonsnivået i vår studie var 200 cfu / g, og siden slike prøver var forventet å inneholde et lavt antall C. chauvoei. Metoden som brukes i denne studien er derfor ikke praktisk anvendelig.
Miljøaspekter
deteksjonsgrensen FOR PCR – metoden etter prekultur er neppe på nåværende stadium egnet for å garantere at dyr er fri for infeksjon eller for å bestemme status for beite. I stedet må de gjeldende anbefalingene brukes, siden metoden ikke kan brukes som grunnlag for vaksinasjonsrutiner. I områder hvor blackleg er endemisk, anbefales årlig vaksinasjon før beite, til tross for kostnadene og tiden som kreves.
denne studien ga noen indikasjon På At C. chauvoei ikke passerer gjennom biogassprosessen. Antallet C. chauvoei i bioavfall kanskje redusert i fordøyeren til under deteksjonsgrensen for metoden, og risikoen for å spre fordøyede rester er dermed ubetydelig. Flere studier om clostridial overlevelse gjennom biogassprosessen er nødvendig før klare konklusjoner kan trekkes. Fordelene med fordøyede rester som gjødsel oppveier imidlertid kanskje risikoen for spredning av blackleg.
