Infeksiøs nekrotisk hepatitt forårsaket Av Clostridiumnovyi Type B i en hest: saksrapport og gjennomgang avlitteratur | Jiotower

Infeksiøs nekrotisk hepatitt (INH) er forårsaket Av Clostridium novyitype B. sykdommen påvirker vanligvis sauer, der det også refereres til som”svart sykdom” gitt den mørke misfargingen av det subkutane vevet forårsaket avintens venøs overbelastning sett i dyrene av dyr som dør av denne sykdommen.6 Selv OM INH også antas å forekomme hos andre arter, inkludert storfe, geiter og hester, er det svært begrenset informasjon om denne sykdommen hos andre dyr enn sauer.2,3,19,15 Dessuten,på grunn av sin strenge anaerob natur, isolering og identifisering Av c. novyi Type B er sjelden oppnådd.15 av denne grunn er rapporter om INH vanligvis begrenset til presumptivdiagnose basert på histopatologi, fluorescerende antistofftest (FAT) og / orimmunohistokjemi (IHC). Typen Av c. novyi er sjeldenbestemt. Her presenterer vi et bekreftet tilfelle av hest INH forårsaket Av C.novyi type B, og også gjennomgå litteraturen om sykdommen.

En 14 år gammel, 511 kg bay Quarter Horse vallak ble sendt Til San Bernardinobranch Av California Animal Health And Food Safety Laboratory System forpostmortem undersøkelse og diagnostisk workup. Dyret hadde en 3d-historie med progressive nevrologiske tegn, rektal temperatur på 38,8-40,5°C, og hadde ikke blitt behandlet uten hell med ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler før døden.En full obduksjon ble utført ~6 h etter døden.

ved obduksjon var hesten i god ernæringsmessig tilstand, med tilstrekkelig mengde fettreserver, og i moderat tilstand av postmortem nedbrytning. Det var gulmisfarging av sclera, subkutan og fettvev, og artikulærbrusk. Multifokale ekkymotiske-til-suffusive blødninger var tilstede i de flestemuskler, serosa i tarmkanalen, mesenteri, milt, pleura og inpapillære muskler i hjertet. Venøst blod var dypt rød-svart. Perikardialsac ble utvidet med en stor mengde serosanguineous væske, og det var ~5l av en lignende væske som inneholdt rikelig fibrinstrenger i bukhulen.Leveren var markert forstørret og hadde avrundede kanter; venstre lapp var fast, mørk rød til svart, og hadde mange subkapsulære og dype parenkymale gassbobler og rikelig fibrin over kapselen (Fig. 1A). På kuttet delen av denne lapp, var det en ~15 cm diameter, blek område omgitt av en tynn hemoragisk rim (Fig. 1B). Den meningesoverliggende hjernen og ryggmargen var diffust overbelastet, og det var petechial blødninger gjennom hjernebarken. Ingen andre signifikante grossesjoner ble observert i resten av slaktkroppen.

prøver av hjerne, lunge, hjerte, membran, lever, milt, mage,tarm, bukspyttkjertel, binyre, mesenteri, nyre Og urinblære ble samlet og festet i 10% bufret formalin (pH 7,2) i 48 timer og behandlet rutinemessig for produksjon av 4 µ tykt hematoksylin og eosin (H&E)-fargede seksjoner. Leverog nyreseksjoner ble også farget med Henholdsvis Gram og Okajima flekker.

Prøver av leveren ble samlet aseptisk og utsatt for aerob og anaerobicculture på 5% sau agar plater for 48 h. PCR ble utført For West Nile virus (WNV) på sentralnervesystemet samlet prøver og for equid herpesvirus 1 (EHV-1) på en nesepinne. En tungmetallskjerm inkludert bly, mangan, jern,kvikksølv, arsen, molybden, sink, kobber og kadmium ble utført på leverprøver.Cerebrospinalvæske ble testet for antistoffer Mot Sarkocystisneurona ved bruk av indirekte FETT. Leverutstryk ble behandlet Av Fettfor Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium sordelli og c. novyi ved hjelp av kommersielle konjugater (VMRD, Pullman, WA). I tillegg ble formalinfikserte, parafininnebygde deler av leveren behandlet av en indirekte immunoperoksidaseteknikk For c. novyi, ved hjelp av et kommersielt sett (RTU VECTASTAINElite ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroksidaseaktivitet ble slukket med en 3% hydrogenperoksidoppløsning, etterfulgt av pepsinbehandling for antigenhenting. Prøver ble deretter inkubert Med BackgroundPunisher (Biocare Medical, Concord, CA) for å blokkere ikke–spesifikk binding, førinkubering med geit anti-c. novyi polyclonal antistoff (vmrd) ved 37°C i 60 min. Vector novared chromogen ble brukt til visualisering (Vektorlaboratorier). Seksjoner av leveren inkubert med normalt geiteserum i stedet forprimære antistoffer ble brukt som negativ kontroll. Lever fra en ku derc. novyi hadde blitt identifisert av kultur, OG PCR ble bruktsom en positiv kontroll.

Leverprøver ble behandlet FOR DNA-ekstraksjon (QIAamp DNA FFPE tissue kit, Qiagen,Hilden, Tyskland) etter produsentens instruksjoner. Det ekstraherte DNA ble brukt som mal for en MULTIPLEX PCR-analyse for å forsterke segmenter av flagellingene (fliC) Av c. septicum, c. novyi Type A, C. novyi Type B, C. chauvoei, Og Clostridium haemolyticum, asbeskrevet tidligere.17 I Tillegg utviklet vi en konvensjonell PCR for å forsterke et segment av theC. novyi type b alfa toksin (TcnA) gen (genbank tiltredelse JENV01000127. 1), den viktigste virulensfaktoren av dettemikroorganisme. Følgende oligonukleotidsekvenser ble utformet: 5 ‘- TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3 ‘(CNtBaF) og 5 ‘- CCTTATGCAAAAGGGATGGCG-3 ‘ (CNtBaR), som forsterker et ~342-bp DNA-fragment av målgenet. Konvensjonell PCR ble utført i et totalt volum på 25 µ som inneholdt 5 µ av ekstrahert DNA, 0.25 µ av hver primer (10 µ), 7 µ av nuklease-fritt vann og 12,5 µ AV PCR Master Mix(2X, Promega, Madison, WI), som inneholder Taq DNA-polymerase (pH 8,5, 50 U/mL), dntp(400 µ) og MgCl2 (3 mM). Thermocycler-profilene var som følger:94 hryvnias C i 5 min, 30 sykluser av 94 hryvnias C i 1 min, 55 hryvnias C i 1 min og 72 hryvnias C i 1,5 min, etterfulgt av et endelig forlengelsestrinn på 72 hryvnias C i 7 Min. Prøvene ble holdt ved 4°Cuntil PCR-reaksjonene ble visualisert under ultrafiolett lys i ethidiumbromid (Amresco, Solon, OH) – farget 1% agarose geler (Agarose SFR, Amresco). DNAextracted Fra C. novyi TYPE B (ATCC 25758), c. novyi Type A, c. septicum, C. chauvoei og c. haemolyticum kulturer ble brukt som positive kontroller. Vann i stedet FOR DNA ble brukt i negativ kontrollreaksjoner.

Mikroskopisk var leverkapselen dekket av rikelig fibrin blandet med celledebris, og det var subkapsulære og dype parenkymale emfysematøse bullae av forskjellige størrelser. Det mest slående funn var multifokal til focally extensivecoagulative nekrose, omgitt av en kant av et stort antall levedyktige anddegenerate nøytrofiler, blødning, fibrin, celle rusk, og store aggregater ofgram-positive bakteriestenger, noen som hadde subterminal sporer(Fig. 1C,, D).D). I intervensjonparenchyma og i den mindre berørte leveren var det galle stasis, multifokalblødninger og segmental-til-diffus fibrinoid nekrose av blodkar, mange avsom også inneholdt fibrin trombi. Det renale tubulære epitelet hadde mildcytoplasmatisk vakuolering, og protein og granulære støper var til stede i lumenav nyretubuli. Støpene farget positivt Med Okajima flekk (Fig. 1E). I hjernen var det diffus overbelastning, multifokal og tilfeldig spredt perivaskulærblødninger og moderat til markert utvidelse Av Virchow-Robin-rom medacidofilt ødem. Det viscerale peritoneum var dekket av rikelig fibrin blandet med et stort antall levedyktige og degenererte nøytrofiler; de fleste peritoneale blodkarrene var overbelastede og / eller inneholdt fibrintromber. Noen få små arterier ogårer i cortex og medulla av binyrene hadde også fibrin trombi. Thespleen hadde vaskulær overbelastning og multifokal parenkymal og kapselblødninger. Lungene var diffust overbelastede og hadde multifokale blødninger ogødem, i tillegg til noen få blodkar som inneholdt fibrin trombi. Multiplesubendokardial, subepicardial og subpleural blødning ble sett.

det store flertallet av intralesional gram-positive stenger observert i leveren var positiv For c. novyi IHC (Fig. 1F). FETT var positivt For C.novyi, men negativ for de andre clostridiale artene testet. Leverprøver var positive For c. novyi type B fliCand TcnA-gener, og negative for fliC-genene fra de andre clostridiene som ble testet (Fig. 2). Prøver av cerebrospinalvæske var negative for S. neurona immunfluorescent antistoffanalyse. PCR for WNV OG EHV-1 varnegativ. Ingen signifikant bakteriell vekst ble oppnådd ved aerob eller anaerobkultur. Tungmetallskjermen viste en forhøyet konsentrasjon av jern i leverprøver (1500 ppm; referanseintervall: 100-300 ppm).

VI gjorde en presumptiv DIAGNOSE AV INH basert på brutto og mikroskopiske endringer, kombinert med resultater AV FETT og IHC For c. novyi. Diagnosen INH produsert Av c. novyi Type B ble bekreftet VED pcr-deteksjonav fliC-og TcnA-gener av dettemikroorganisme. Så vidt vi vet, har bare 6 tilfeller av mistanke OM IHN blitt rapporterttidligere hos hester. Tre tilfeller skjedde i Australia,8, 9, 11 og en hver I New Zealand,23 Skottland,19 Og Usa (Montana).16 i disse tilfellene var en presumptiv diagnose basert på brutto-og mikroskopisklesjoner kombinert med påvisning Av c. novyi VED FETT, 9, 16, 19 IHC, 23 og / eller kultur.9,19 imidlertid ble Typen c. novyiinvolved ikke bestemt i noen av disse tilfellene.

c. novyi er en gram-positiv, spore-forming, anaerob bacillus, som ofte finnes i jord og avføring av dyr.15 det er klassifisert i type A, B og C basert på rekkevidden av toksiner produsert.4C. novyi Type a produserer hovedsakelig dødelig, ødem-induserende alfatoksin (TcnA), og ikke-dødelig fosfolipase, gamma toksin; denne bakterien er assosiert med gass koldbrann av mennesker og dyr, vanligvis opptrer sammen medandre clostridia. C. novyi Type B produserer Også TcnA, i tillegg tiltil nekrotiserende og hemolytisk beta-toksin, selv om den førstnevnte vurderesviktigste virulensfaktor FOR patogenesen AV INH. C. novyi Type C anses å være ikke-toksigenisk ogikke-patogen.13,15 C. haemolyticum var tidligere kjent Som C. novyitype D, og det er fortsatt referert til av dette navnet av noen forfattere; derfor, viogså diskutere denne mikroorganismen her. C. haemolyticum ogsåproduserer beta-toksin, men i mye større mengder Enn c. novyitype B; dette toksinet regnes som den viktigste virulensfaktoren til denne mikroorganismen,og det er ansvarlig for bacillær hemoglobinuri (BH), en sykdom som påvirkerhovedsakelig storfe som er klinisk og patologisk svært lik INH.11,10,14

sporer Av C. novyi er svært motstandsdyktig mot miljøforhold og, gitt at sporene er ofte funnet i jord, beite dyrkan innta dem ofte.6,19 Selv om det ikke er fullt bevist, er dagens dogma at etter inntak absorberes sporer Av c. novyi Type B fratarmene og nå leveren via portalsirkulasjonen, hvoretter de erspredt seg til andre organer. Sporene er fagocytisert og forblir latente i Kupfferceller i leveren, og i makrofager i milten og benmargen.2,6 INH has commonly vært ansett for å være motstykket TIL BH fordi begge sykdommene aretrodde å oppstå etter leverskade, forårsaker nekrose og assosiertanaerobic forhold som kreves for spiring av latente sporer og theproduksjon av giftstoffer.14 Migrasjon av umodne Former For Fasciola hepatica gjennomleveren regnes som den viktigste predisponerende faktoren for BÅDE BH og INHin drøvtyggere, og begge sykdommene er vanligere i områder med høy forekomst av fascioliasis.1 INH av drøvtyggere har også vært assosiert Med Cysticercustenuicollis og andre parasitter, inkludert Fascioloidesmagna, Dicrocoelium dendriticum,Andthysanosoma actinoides,2, 6, 15, 21 selv om rollen til disse parasittene i patogenesen av sykdommen ikke er påvist.Imidlertid kan enhver leverskade som fører til generering av anaerobe forhold være apredisponerende faktor FOR INH. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, leverabscesser, biopsier, fettforandring, telangiektasi og giftige stoffer. Når TcnA erprodusert og utgitt av vegetative former Av C. novyi Type B, dets monoglykosyltransferaseaktivitet inaktiverer flere guanosin5 ‘ – trifosfat (GTP)-bindende proteiner i vertsceller, noe som resulterer iendring og omfordeling av actin cytoskelettet.3 TcnA forstyrrer også vimentin-og tubulinsystemet.7,18 Disse Endringene ser ut til å være mer dramatiske i kapillærendotel, noe som fører til utbredt væskeekstravasjon sett i INH15 og sannsynligvis den multisystemiske trombosen observert i hesten til ourreport. I sauer gjør den svært akutte naturen av sykdommen påvisning avkliniske tegn vanskelig, med dyr som vanligvis finnes døde. I tilfeller der tegnblir observert, de er uspesifikke, og inkluderer svakhet, sløvhet,anoreksi, hypertermi, tachypnea, hyperpnea og til slutt liggende. Kliniske patologiske endringer kan omfatte nøytrofili med venstre skift, azotemi, metabolsk acidose og forhøyet lever-og muskelenzymaktivitet.15,19

Gitt at bare 6 tilfeller av presumptiv INH tidligere er beskrevet hos hester, er tilgjengelig epidemiologisk, klinisk og patologisk informasjon snaut. Basert på dette begrensede antall tilfeller, er det ingen åpenbar kjønn eller rase predisposisjon i tilfeller av hest INH, og både unge og voksne dyr kan bli påvirket. Denklinisk kurs er vanligvis lengre hos hester enn hos drøvtyggere, som varer 12-72 h,og utfallet har alltid vært dødelig. Kliniske tegn varierer fra mild til alvorligdepresjon og motvilje mot å bevege seg, nevrologiske tegn inkludert ataksi og hodetilt, hyperemiske og / eller isteriske slimhinner og okulær sclera, magesmerter og liggende stilling.20,23 i ett tilfelle hvor abdominocentese ble utført, en økt mengde uklar væske med forhøyet proteinkonsentrasjon ogspesifikk tyngdekraft ble oppnådd.9

Klinikopatologiske profiler av hester med INH er svært variable, og de kan representere ulike stadier av toksemi og leverskade. Disse endringene kan inkludere nøytrofili med venstreforskyvning, forhøyet leverenzymaktivitet, trombocytopeni, hyperfibrinogenemi, hyperbilirubinemi og redusert konsentrasjon av elektrolytter.9,16,19 i tillegg økte aktiverte partielle tromboplastin -, protrombin-og trombintider er rapportert.23 disse endringene, i kombinasjon med kapillær mikrotrombi observert, er en antydning til disseminert intravaskulær koagulasjon, en prosess som sannsynligvis vil oppstå i løpet av toksemi og hemolyse hos store dyr.22,23 Detresulterende forbruk av koagulasjonsfaktorer, deres reduserte syntese på grunn avhepatisk svikt, og den synergistiske virkningen Av TcnA på vaskulært endotel erantagelig ansvarlig for de utbredte blødninger observert i tilfeller avinh.

selv om icterus ikke er beskrevet hos drøvtyggere, kan hester noen ganger vise dette tegnet forbundet MED INH.19,23 Icterus ser ut til å være relatert til alvorlighetsgraden avhepatisk skade og til en viss grad til hemolyse, som i vårt tilfelle, hvorhemoglobin ble visualisert I nyrene Ved Okajima flekk. Hesten i ourstudy hadde moderat økt jernkonsentrasjon i leveren, som tyder på ahemolytisk prosess.5 dette nivået av jern i leveren er imidlertid et vanlig funn i horsesdying fra en rekke årsaker, og det regnes ofte som en tilfeldig funn forbundet med overbelastning og postmortem autolyse (forfatteres upubliserteobservasjon).

selv om det kan antas at hester er mer mottakelige enn andre arter til virkningen av hemolytisk beta-toksin produsert Av c. novyitype B, har hemoglobinuriske endringer ikke blitt beskrevet i presumptive tilfeller ofINH.16,23 Sammenlignet Med c. haemolyticum produserer c. novyi Type B lavere nivåer av beta-toksin;15 derfor antas dets bidrag til patogenesen AV INH å væremindre, noe som forårsaker en viss grad av hemolyse hos hester, men ikke nok til å indusere signifikante hemoglobinuriassosierte endringer. I tillegg utelukket Ingen av de tidligere tilfellene Rollen Som c. haemolyticum som et forårsakende middel for sykdom, så endelige konklusjoner kan ikke trekkes fra disse tilfellene. C. haemolyticum har vært involvert i et tilfelle av septisk peritonitt ina mare ved identifikasjon MED MALDI-TOF; PCR eller toksinidentifikasjon ble imidlertid ikke forsøkt i det spesielle tilfellet.11

den predisponerende faktoren FOR INH hos hester har ikke alltid blitt bestemt, selv om de hepatiske migrasjonene Av F. hepatica og relaterte trematoder, så vel som medlemmer av Strongylidae-familien, har blitt foreslått.9,12,19 i Tillegg har anthelminthic behandling før theonset av kliniske tegn blitt foreslått som en potensiell utløser av sykdommen,9,16,23 antagelig ved å forårsake en viss grad av hepatisk nekroseassosiert med ødeleggelse av migrerende parasitter. Imidlertid er det ikke noe vitenskapelig bevis tilgjengelig for å støtte denne hypotesen. Dessverre, ingen kjentpredisponerende faktorer ble bestemt i vårt tilfelle.

som i vårt tilfelle beskrev de fleste tidligere rapporter et enkelt (flere i ett tilfelle19) fokus på nekrose som påvirker leveren, konsekvent plassert i venstreflippen. Dette står i kontrast TIL inh av sauer der tilfeldig fordelt, litennekrotiske foci er vanligere.6,15 årsaken til dettevariasjon i distribusjon er ukjent. Det er mulig at overvekt avlesjoner på venstre lobe er relatert til såkalt portal streaming, som er ansvarlig for differensialstrøm av portalblod til bestemte lober avleveren. Fordi c. novyi antagelig absorberes fra den småtarmen, og blodet fra dette organet følger portal streaming til venstrelobe, kan dette resultere i at denne lobe blir overveiende påvirket.6 fravær av endringer forbundet med hepatisk encefalopati (f. eks., Alzheimers type II astrocytose assosiert med hyperammonemi) 6 kan tyde på at nevrologiske tegn i dette og tidligere tilfeller varkonsekvens av blødninger, overbelastning og perivaskulært ødem notert i hjernen, relatert til toksemi og Virkningen Av TcnA på kapillærendotelet.

INH bør være på listen over differensialdiagnoser av hester med nevrologiske kliniske tegn, toksemi, akutt leversvikt og peritonitt. Selv ombehandling med høye doser penicillin og tetracykliner kan være effektiv motc. novyi, den avanserte produksjonen av toksiner resulterer vanligvisi en dårlig prognose.19 i områder der sykdommen er tydelig forbundet med leverflukterog / eller andre parasitter, kan det forsøkes å redusere parasittbelastningen og begrense tilgangen til dyr til dårlig drenert beite som forebyggende tiltak.15

Gitt at flere clostridiale sykdommer antas å være forbundet med akselerertpostmortem dekomponering, et viktig hensyn for riktig diagnose avinh er behovet for rask evaluering og bevaring av vev etter dødenav dyret.6,23 Klinisk historie, rutinemessig obduksjon, histopatologi og immunisering Av c. novyi ved leverlesjoner er avgjørende for å gi en presumptiv DIAGNOSE AV INH. Fordi isolasjon ikke alltid ervellykket, gitt de strenge anaerobe kravene til mikroorganismen, er molekylær identifikasjon AV PCR et verdifullt verktøy for å gi en etiologiskdiagnose og å skille C. novyi type B fra andreklostridiale patogener.