Arabidopsis cmt3 kromometylase mutasjoner blokkere ikke-CG metylering og silencing av et endogent gen | Jiotower

Resultater Og Diskusjon

for å identifisere faktorer som styrer metylering Og silencing AV ws PAI-gener, isolerte vi en mutant variant AV ws, pai1C251Y, hvor silencing av det metylerte singlet PAI2-genet kan visualiseres ved intensiteten av en blå fluorescerende plantefenotype under ultra-violet (uv) lys (bartee og bender 2001). I pai1c251y-stammen er DE eneste potensielle kildene TIL pai-enzymaktivitet pai1-genet, som er krøllet av en missense-mutasjon, OG PAI2-genet, som er tavlet. På grunn AV DENNE pai-mangelen akkumulerer stammen fluorescerende tryptofanveis mellomprodukter, samt å vise gulgrønn bladpigmentering, redusert størrelse, økt bushiness og redusert fruktbarhet. Imidlertid vil andre sted mutasjoner som lindrer PAI2 silencing undertrykke pai-mangel fenotyper (Bartee and Bender 2001). Dermed mutageniserte vi pai1c251y-stammen og screenet for frøplanter med undertrykte svake fluorescerende fenotyper. Som en sekundær skjerm testet VI PAI-metylering Ved Southern blot-analyse med metyleringsfølsomme restriksjonsenzymer. Spesielt analyserte vi metylering med isoschizomerer HpaII og MspI, som gjenkjenner sekvensen 5 ‘- CCGG-3’. HpaII er følsom for metylering av både indre (CG) og ytre (cng) cytosiner, Mens MspI bare er følsom for metylering av ytre cytosiner. Disse enzymene spalter en GANG I HVERT WS PAI locus og avslører både tettheten og mønsteret av metylering for hvert gen (Bender Og Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

fra denne screeningsstrategien isolerte vi 11 tap av funksjon alleler I CMT3 genet (Se Nedenfor Og Materialer og Metoder). Cmt3-mutantene i pai1c251y-bakgrunnen viste sterkt redusert fluorescens i tidlig frøplanteutvikling og delvis redusert fluorescens hos voksne planter, med økt størrelse, redusert bushiness og økt fruktbarhet (Fig. (Fig.1).1). Disse mellomliggende fluorescerende cmt3-isolatene gikk ikke tilbake til nonfluorescence, som er diagnostisk for tap av gjenværende PAI2-metylering (Bender and Fink 1995), ved en detekterbar frekvens. De viste delvis økt spaltning med HpaII og sterkt økt spaltning med MspI for PAI-genene i forhold til foreldrenes pai1C251Y (Fig. (Fig.2A).2A). Spaltningsmønsteret antydet at cmt3-mutantene var mest påvirket ved vedlikehold AV CNG-metylering AV PAI-genene. For å avgjøre om cmt3-mutantene også påvirket metylering av en svært gjentatt genomisk sekvens, reprobed Vi Hpaii / MspI Southern blot med en sonde til 180-bp centromere-associated repeat (CEN) sekvenser (Vongs et al. 1993). Denne sonden viste liten effekt på HpaII-spaltning, men økte MspI-spaltning, i samsvar med mønsteret observert FOR PAI-gener (Fig. (Fig.2B).2B). Et lignende mønster av økt mspi-spaltning ble også observert ved gjentatt rDNA (data ikke vist). Alle 11 cmt3-alleler som ble testet hadde identiske metyleringsmønstre i disse analysene. Videre, da cmt3-allelene ble segregert bort fra pai1C251Y-allelet til en villtype WS-bakgrunn, viste de også identiske metyleringsmønstre i disse analysene (Fig . (Fig.2).2). PAI-og CEN-metyleringsmønstrene var forskjellige fra mønstrene indusert av de karakteriserte ddm1-og metyleringsdefekte mutasjonene (Fig. (Fig.2; 2; Bartee Og Bender 2001).

for mer nøyaktig å bestemme metyleringsmønstre i cmt3-mutantbakgrunnen, utførte vi genomisk sekvensering av metyleringsmønstre I PAI1 – OG PAI2-promotorregionene av en representativ cmt3-allel ved å bruke natriumbisulfittmutagenese (Frommer et al . 1992). Denne analysen viste at flertallet av metylerte cytosiner (87% I PAI1 og 70% I PAI2) oppstod VED CG-rester(Fig. (Fig.3; 3; Tabell Tabell1).1). Sammenlignet MED wild-type WS PAI1 promoter (Luff et al. 1999; Tabell Tabell1), 1), CG-metylering ble redusert 34%, CNG-metylering ble eliminert, og asymmetrisk metylering ble redusert 93%; I PAI2-promotoren ble CG-metylering redusert 8%, CNG-metylering redusert 92%, og ikke-CG-metylering redusert 75%. DERMED har TAP AV CMT3-funksjon en sterk effekt på vedlikehold AV CNG og asymmetrisk metylering og en svakere effekt på vedlikehold AV CG-metylering. Disse resultatene er i samsvar med rapporter Om At Arabidopsis CMT3 OG mais ZMET2 er viktige for vedlikehold AV CNG-metylering på ulike genomiske steder (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), men DE viser videre AT CMT3 også er viktig for vedlikehold av asymmetrisk metylering for PAI-genene. DETTE resultatet innebærer enten AT CMT3 direkte kontrollerer både symmetrisk og asymmetrisk metylering, eller at reduksjonen i symmetrisk metylering i cmt3-mutantbakgrunnen forårsaker redusert asymmetrisk metylering som en sekundær konsekvens. Fordi de metylerte sekvensene i promotoren og FØRSTE ekson AV pai2 reporter-genet (∼370 bp) bare inneholder 16 dispergerte CG-motiver, hypometylerer tap av ikke-CG-metylering signifikant denne regionen av genet (Fig . (Fig.3), 3), regnskap for forbedret PAI2 uttrykk i suppressor mutant.

den cmt3 mutant locus i pai1C251Y cmt3 suppressor isolater ble kartlagt av kors med polymorfe stamme Nd-0, som har en lignende ordning av tett metylert PAI gener som finnes I WS (Melquist et al . 1999). F2-avkom med svakt fluorescerende fenotyper som diagnostiserte homozygositet for både pai1C251Y og cmt3 ble identifisert ved visuell inspeksjon UNDER UV-lys og bekreftet Av Mspi Southern blot for sterk pai-spaltning tilsvarende det som ble observert i foreldresuppressorisolatene. En kartlegging populasjon Av F2 planter som oppfylte disse kriteriene ble deretter brukt til å score for genomisk loci knyttet til undertrykt fenotype. Kartleggingsanalysen viste kobling til et enkelt locus på underarmen av kromosom 1. FORDI CMT3-antatte cytosinmetyltransferase-genet kartlegger dette stedet, fokuserte vi på dette genet som kandidat. Innenfor hver kartleggingspopulasjon fant vi fullstendig kobling til en polymorf markør som ligger innenfor 100 kb AV CMT3-genet. For å bekrefte AT CMT3-genet faktisk var stedet for metyleringssuppressormutasjonene, klonet og sekvenserte vi genet fra de 11 mutantisolatene. Sekvensering avslørte en enkelt baseendring I CMT3-kodingssekvensen i hvert isolat. Tre av de mutante allelene påvirket absolutt konserverte aminosyrer i metyltransferasekatalytisk domene, inkludert det representative cmt3G456D allelet som ble brukt til bisulfittsekvensering. En annen allel ble spådd å for tidlig avslutte proteinet. To alleler skapte splice junction mutasjoner. De resterende fem alleler påvirket aminosyrer mellom metyltransferase motif IV OG C-enden av proteinet som er sterkt konservert blant CMT-genene (Fig. (Fig.4).4).

For ytterligere å bekrefte AT CMT3-genet var mutant locus, transformerte vi pai1C251Y cmt3 isolater med en villtype WS genomisk klon AV CMT3-genet. Transformant frøplanter var sterkt fluorescerende, på samme måte som de av pai1c251y stamme (Fig. (Fig.1).1). Transformantlinjer analysert Ved Southern blot-analyse i t2-generasjonen viste remetylering AV pai2-genet til nivåene observert i den opprinnelige pai1c251y-stammen (data ikke vist). Dermed kan DET klonede CMT3-genet utfylle de mutante metyleringsdefektene. Som en kontroll ble den representative pai1c251y cmt3G456D mutanten også transformert med en villtype WS genomisk klon AV CMT2-genet. CMT2 transformant frøplanter var svakt fluorescerende, på samme måte som de av untransformed foreldre stamme(Fig. (Fig.1), 1), og viste ikke påviselig remetylering AV PAI2. Denne analysen viser AT CMT2 ikke kan erstatte CMT3-funksjonen. I denne forbindelse er DET interessant å merke SEG AT CMT2 skiller SEG fra CMT3 primært I Sin n-terminale sekvens (Fig. (Fig.44).

tidligere karakterisert metylering-mangel Arabidopsis stammer med defekter I ENTEN SWI2 / SNF2 kromatin remodeling faktor-relaterte genet DDM1 (Jeddeloh et al. 1999) Eller Dnmt1-relaterte MET1 cytosin metyltransferase genet vise progressive utviklingsmessige abnormiteter (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Vår foreløpige analyse av seks generasjons-innavlet pai1C251Y cmt3 og to-generasjons-innavlet cmt3 stammer viste ingen åpenbar segregering av morfologiske endringer. Denne forskjellen mellom cmt3 og andre metyleringsdefinerte mutanter vil trolig gjenspeile DET faktum AT CG-metylering beholdes i høyere grad i cmt3 enn i ddm1 eller met1 (Fig. (Fig.2; 2; Bartee Og Bender 2001). Fordi mange av de endogene metylerte områdene i Arabidopsis-genomet, som CEN-repetisjonene (Fig. (Fig.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), og promotøren AV fwa homeo-domain-genet (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), bære primært CG-metylering, cmt3-mutasjoner forventes ikke å påvirke disse loci sterkt. I stedet VIRKER CMT3 mest sannsynlig som en forsterkende metylase som legger til et ekstra lag av metylering til bestemte genomiske regioner som PAI-genene, hvor den økte metyleringstettheten fører til økt silensering. En spesifikk modell er at basallaget AV CG-metylering levert av andre funksjoner SOM MET1 kan tjene som en veiledning FOR CMT3, som deretter vil dekorere basallaget med ekstra CG og ikke-cg-metylering. CMT3 rekruttering til målrettede regioner kan innebære kromatinproteininteraksjoner med kromodomainmotivet (Henikoff and Comai 1998), sammen med interaksjoner mediert av de unike N-terminale sekvensene.

fordi sopp som Neurospora crassa Og Ascobolus immersus kan opprettholde ikke-CG metylering (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), kan disse organismene kode CMT-gener. Omvendt, fordi dyr som mennesker og mus mangler ikke-CG-metylering, forventes disse organismene å mangle CMT-gener, som det er tilfelle fra analyser av nåværende sekvensdatabaser. DEN tilsynelatende mangelen PÅ CMT-lignende metylaser i dyregener (Finnegan og Kovac 2000) antyder at dyr har utviklet alternative mekanismer for å forsterke kromatintilstander.