Raffinering av phylum Chlorobi ved å løse fylogeni og metabolsk potensial av representanten for en dypt forgrening, utmattende avstamning | ISME Journal

Genomisk rekonstruksjon AV NICIL-2

Mikrobiell fellesskapskomposisjonsanalyse av termofile bakterielle konsortier tilpasset å vokse på biomassesubstrater (cellulose, xylan Og Switchgrass) som deres eneste karbonkilde ved 60 °c identifiserte konsekvent en allestedsnærværende OTU97 som var fjernt knyttet til kultiverte medlemmer Av phylum Chlorobi (Eichorst et al., 2013, 2014). Metagenomisk sekvensering av et konsortium tilpasset å vokse på ionisk-væske forbehandlet switchgrass, der Klorobi-relatert OTU97 var rikelig, ble utført for å forstå fylogeni og metabolsk potensial av befolkningen som var representert ved DENNE OTU97. Montering (Se Materialer og metoder) og automatisert binning (Wu et al., 2014) av metagenomet til dette konsortiet ga 20 genomiske hyller (Supplerende Tabell S3), blant hvilke de mest omfattende hyllene var en befolkning nært knyttet TIL Chitinophagaceae-stammen NYFB (61,8%), som ble isolert fra en relatert anrikning dyrket på cellulose (Eichorst et al., 2013), Og Klorobi-relatert bin (23,1%). Binger til stede på > 1% inkluderte flere ukultiverte populasjoner gruppering Med Paenibacillaceae (binger 003 og 006), en ukultivert populasjon gruppering Med Verrucomicrobia underavdeling 3 (bin 004) og en befolkning nært knyttet Til Thermobipora bispora (bin 005), en actinobakteriell termofil.

Klorobi-relaterte bin ble kalt NICIL – 2 (For Newby Island Kompost Ionisk Væske-2.i overflod). Analyse av proteiner spådd FRA NICIL – 2 genomet var i samsvar med sin identifikasjon som en populasjon fjernt relatert til medlemmer AV FCB superphylum, Med Bacteroidetes (33%) Og Ignavibacteria (15.7%) har de mest nært beslektede protein sekvenser (Figur 1). DET gjenopprettede NICIL – 2-utkastgenomet var relativt lite (2,67 Mbps) og nær komplett (95,3%; 102 av 107 enkeltkopimarkørgener i 152 stillaser). N50-lengden for NICIL-2-utkastgenomet var 168 929 bp og den største contig var 1.1 MB, noe som tyder på at de fleste stillasene representerte en høyverdig montering (Tabell 1).

fordelingen av den best matchede linjen for ALLE NICIL – 2 proteiner. Prosenter er estimert ved å dele protein teller som matchet til hver avstamning mot antall ALLE NICIL – 2 proteiner. Se Materialer og metoder for detaljer.

Fylogenetisk analyse AV NICIL-2

et 16s rRNA-gen (1451 bp) ble gjenvunnet fra NICIL – 2-utkastgenomet. Ribotypen som er mest relatert TIL 16S rRNA-genet AV NICIL-2 (> 99% identisk)ble sekvensert fra en fosmid-klon (JFF029_06) gjenvunnet fra en termisk strøm (70 °C) I En Japansk gullgruve-sekvens (Nunoura et al., 2005). 16s rRNA-gener fra dyrkede representanter For Bacteroidetes og Chlorobi var <85% identiske MED NICIL – 2-sekvensen. Et fylogenetisk tre konstruert ved å justere 16s rRNA gensekvenser relatert TIL NICIL-2 viste at linjen som inneholdt NICIL-2 var forskjellig fra Bacteroidetes og Chlorobi (Figur 2). NICIL – 2-linjen inneholdt to nedstigningslinjer basert på temperaturen i prøvetakingsmiljøet. Høy temperatur klyngen (avbildet i rødt I Figur 2) inkludert ribotyper primært utvinnes fra høy temperatur miljøer fra 55 °C til 80 °C, slik som klone OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). Den andre klyngen inkluderte ribotyper som hovedsakelig ble gjenvunnet fra moderate temperaturmiljøer fra 20 °C til 32 °C (vist i grønt I Figur 2). SIDEN OPB56 var den første klonen oppdaget som er tilknyttet DENNE fylogenetiske klyngen, er linjen som inneholder NICIL-2 referert TIL SOM OPB56 clade. En utvidet visning AV 16s rRNA genet treet er avbildet I Supplerende Figur S1.

maksimal sannsynlighet fylogenetisk tre bygget for romanen avstamning NICIL-2 ved HJELP av 16s ribosomal RNA-genet. Kladen nærmest ARTEN NICIL-2 var fra en fosmid isolert fra En Japansk gullgruve (Nunoura et al., 2005). Arter temperaturområder ble bestemt fra litteraturen knyttet til HVER NCBI tiltredelse nummer. Innbyggertemperaturen for artene var markert med rødt (>55 °C), grønt (20-32 °C) eller svart (ubestemt). Skala bar angir 0,05 endringer per nukleotidsted. Detaljer for trebygging er gitt I Materialer og metoder. Det utvidede fylogenetiske treet som viser alle noder finnes I Supplerende Figur S1. En fullfarge versjon av denne figuren er tilgjengelig PÅ ISME Journal online.

for å fastslå fylogenetisk tilknytning AV NICIL-2 OG OPB56 clade mer fullstendig, ble ytterligere ribosomale proteinsekvenser oppnådd fra data gjenopprettet fra naturlige prøver. Homologer av 22 konserverte ribosomale gener I NICIL-2 ble funnet i To Japanske fosmid-kloner (JFF029_C06 OG JFF027_B02). Dette settet med 22 ribosomale proteiner ble brukt til å søke metagenomiske datasett fra høytemperaturmiljøer. Komplette sett med disse konserverte ribosomale gener ble identifisert i fire metagenomiske datasett oppnådd fra høytemperaturmiljøer. Automatisert binning av disse datasettene gjenvunnet seks nesten komplette (>90% komplette) utkast til genomer som inneholdt sekvenser for de konserverte 22 ribosomale proteinene i NICIL-2-genomet og Den Japanske gullgruven fosmid kloner (Supplerende Tabell S4). Fem av de seks sammenkoblede protein sekvenser gruppert MED I OPB56 avstamning MED NICIL-2, mens en av sekvenser Fra Yellowstone Fairy Faller gruppert Med Ignavibacteria (Figur 3a). Dette fylogenetiske treet viste At Klorobea, Ignavibakterier OG OPB56 dannet en monofyletisk klade med høy tillit (97%). De Bacteroidetes dannet en distinkt klynge, og familien Rhodothermaceae, hvis tilknytning Til Bacteroidetes har blitt avhørt (Nolan et al., 2009), var tilknyttet Bacteroidetes med høy tillit (>80%). Et andre fylogenetisk tre ble konstruert ved å sammenkoble en justering av 86 enkeltkopiergener delt mellom Bacteroidetes, Chlorobi og Fibrobacter (Figur 3b). Dette treet reproduserte topologien observert for genet bygget fra de 22 ribosomale gener, som videre støtter tilknytningen Til Chlorobea, Ignavibacteria OG OPB56.

maksimal sannsynlighet fylogenetisk tre bygget for romanen avstamning NICIL-2 ved hjelp av (a) 22 ribosomale proteiner og (b) 86 enkeltkopierte proteiner delt Mellom Bacteroidetes, Chlorobea, Ignavibacteria, OPB56 Og Fibrobacter klynger. Skala bar betegner 0,1 endringer per amino-syre nettstedet. Detaljer for trebygging er gitt I Materialer og metoder.

en komplementær tilnærming til å forstå evolusjonære forhold mellom Bakteriodeter og Klorobi har vært å identifisere indels i konserverte proteiner (Gupta og Lorenzini, 2007). Innsettinger I DNA polymerase III (28 aa) og alanyl-tRNA syntetase (12-14 aa) som er konservert blant GSB og fraværende blant Bakteriodetene ble tilskrevet som karakteristisk For phylum Chlorobi. Justeringer av disse to proteinene (Supplerende Tall S2 og S3) indikerer AT DNA-polymerase III-innsetting i GSB-proteinsekvensene ikke er tilstede i de forutsagte proteinene Fra Ignavibacteriae – og NICIL-2-genomene, mens 2-3 aminosyrer fra innsetting i GSB alanyl-tRNA-syntetasesekvensene er konservert i Ignavibacteria-og NICIL-2-proteinsekvensene.

Metabolsk rekonstruksjon AV NICIL-2

fysiologien TIL NICIL-2 ble utledet av metabolsk rekonstruksjon og dets metabolske potensial sammenlignet med representanter FOR GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus og Salinbacter ruber) Og Ignavibacteria (Ignavibacterium album Og Meliobacter roseus). Gener som koder for fotosynteserelaterte proteiner, inkludert homologer Av C. tepidums fotosyntetiske reaksjonssenterunderenheter (CT1020, pscB, psC, pscD), klorosom konvoluttproteiner (csmABCDEFHIJX) og bakterioklorofyll a-proteiner (fmoA), er fraværende i alle de andre genomene, og skiller GSB i dette komparative settet (Eisen et al., 2002). En visuell oppsummering av metabolsk rekonstruksjon er presentert i Figur 4. For fullstendig geninformasjon, boksnummer og forkortelser, se Supplerende Tabeller S5 og S6.

Rekonstruert metabolisme AV NICIL-2 utledet fra det reassembled genomet. For fullstendig geninformasjon, boksnummer og forkortelser, se Supplerende Tabeller S5 og S6. Rød tekst representerer enzymer eller biosyntetiske veier som mangler fra genomet. Blå, grønne og lilla piler indikerer HENHOLDSVIS ATP, NADH og NADPH flow.

Karbonmetabolisme

NICIL-2-genomet koder for et komplett sett med gener for glykolyse, tca-syklusen og glukoneogenese (Figur 4). Gener for rTCA-syklusen, som er tilstede og uttrykt for autotrofisk karbonfiksering I GSB, er fraværende. Videre antyder tilstedeværelsen av gener som koder for liposyreholdige kofaktorer i pyruvatdehydrogenase – og α-ketoglutarat-dehydrogenasekompleksene at TCA-syklusen fungerer i oksidativ retning. Det meste av rTCA-syklusen har blitt rekonstruert I R. marinus og I. album, inkludert flere pyruvat-ferredoxinoksidoreduktaser og α-ketoglutarat-ferredoxinoksidoreduktaser, to nødvendige enzymer for rTCA-syklusen. I. album og r. marinus-genomene mangler ATP-avhengig citratlyase, et kritisk enzym for å fullføre rTCA-syklusen (Buchanan and Arnon, 1990). Det har blitt foreslått at i. album kan bruke EN ATP-uavhengig citratlyase for å fungere i rTCA-syklusen i stedet, selv om denne påstanden ikke er testet eksperimentelt og verken i. album eller r. marinus har vist seg å vokse autotrofisk (Liu Et al.( 2012a).

TIL Tross for sin høye relative overflod i tilpassede kulturer som vokser på plantebiomasse, HADDE NICIL-2 en overraskende begrenset enzymatisk kapasitet til å dekonstruere kompleks biomasse. Sammenligningen av det metabolske potensialet for polysakkaridhydrolyse blant de 20 hyllene ekstrahert fra metagenomet fra forbehandlet-switchgrass-anrikning viste AT NICIL-2 har relativt færre gener for cellulose og hemicellulose dekonstruksjon sammenlignet med andre medlemmer av det mikrobielle samfunnet (Supplerende Figur S4). Spesielt stamme NYFB, den verrucomicrobial populasjonen og flere Gram-positive Firmicutes har mer omfattende repertoarer av gener for polysakkaridhydrolyse. Ytterligere inspeksjon AV de rekonstruerte OPB56-tilknyttede genomene fra naturlige prøver med høy temperatur viste at mangelen på gener for polysakkaridhydrolyse var vanlig for denne kladen. Blant genomene clustering Med Bacteroidetes Og Chlorobi, R. marinus, M. roseus og Yellowstone Obsidian Pool Bin 062, som klynger Med Ignavibacteria, hadde et omfattende repertoar av glykosidhydrolaser for å dekonstruere plantebiomasse. Disse analysene tyder på AT NICIL-2 og relaterte medlemmer AV OPB56 clade er sannsynligvis ikke involvert i den primære dekonstruksjon av biomasse i tilpasset samfunnet og naturlige miljøer. DET er tenkelig AT NICIL-2 kan vokse på sukkermonomerer eller oligomerer; imidlertid ble bare ett spådd disakkaridtransportørgen identifisert i genomet.

selv om utvalget FOR NICIL-2 skjedde under aerobe forhold, kan det ha kapasitet til gjæring. Gener for fermentativ produksjon av etanol er tilstede (via alkoholdehydrogenase, EC 1.1.1.1), mens gener for formiat (via pyruvatformiatlyase, EC 2.3.1.54), laktat (via laktatdehydrogenase, EC 1.1.1.27) og propionat (via metylmalonyl-CoA karboksyltransferase, 2.1.3.1) er fraværende. NICIL – 2-genomet koder et gen for fosfotransacetylase (EC 2.3.1.8), men ikke acetatkinase (EC 2.7.2.1), som begge er nødvendige for fermentativ acetatproduksjon. Både i. album og m. roseus inneholder gener for produksjon av laktat og acetat, Mens C. tepidum ikke gjør det.

Nitrogen-og svovelmetabolisme

Gener for ammoniumassimilering, glutaminsyntase (EC 6.3.1.2) og glutamatsyntase (EC 1.4.1.13) ble påvist i NICIL – 2-genomet. Ingen gener ble identifisert for dissimilatorisk nitratreduksjon, assimilatorisk nitratreduksjon, denitrifisering, nitrogenfiksering og nitrifisering. C. tepidum koder nif-gener som kreves For n2-fiksering, mens M. roseus (Kadnikov et al., 2013), i. album (Liu et al., 2012a) og R. marinus (Nolan et al.(2009) ikke. C. tepidum er en obligatorisk svoveloksidant og kan derfor oksidere sulfid, tiosulfat, sulfitt og elementært svovel. C. tepidum oksiderer fortrinnsvis sulfid til elementært svovel, deretter elementært svovel og tiosulfat til sulfat (Chan et al., 2008). I tillegg kan sulfitt oksyderes når det leveres i vekstmediet, men det kan ikke opprettholde C. tepidum som eneste elektrondonor (Rodriguez et al., 2011). NICIL-2, i. album, M. roseus og R. marinus mangler alle gener som kreves for oksidasjon av reduserte svovelforbindelser.

Aminosyrebiosyntese

NICIL-2-genomet mangler mange nøkkelgener for biosyntese av aminosyrer. Komplette veier er kodet for alanin, arginin, asparagin, aspartat, β-alanin, glutamat, glycin, lysin og metionin. NICIL-2 mangler ilvC og leuABCD og har derfor ufullstendige veier for biosyntese av valin, leucin og isoleucin. Tilsvarende I. albumgenomet manglet alle gener som kreves for biosyntese av valin, leucin og isoleucin fra pyruvat, bortsett fra forgrenet aminotransferase (ilvE), Mens M. roseus og C. tepidum inneholder komplette veier. VERKEN NICIL-2 eller i. album koder gener som kreves for prolinbiosyntese fra glutamat( proBAC), mens Både C. tepidum og m. roseus gjør det. Det serbiske genet for biosyntese av serin mangler I NICIL-2, i. album, m. roseus, og finnes i noen GSB, inkludert C. tepidum. NICIL-2 kan også bruke aminosyrer som vekstsubstrater. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).

Electron transport

The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). I stedet er de fleste gener arrangert uavhengig gjennom DE største NICIL – 2 stillasene (nuoGHI, nuoJK ,nuoF, nuoD, nuoE og nuoMN), og de gjenværende gener finnes på tre mindre stillas (nuoAB, nuoL og nuoC), noe som indikerer at fraværet av en operonstruktur ikke er en gjenstand for montering. C. tepidum inneholder ett sett gener som koder FOR NADH: ubiquinonoksidoreduktase som mangler nuoEFG (11 underenheter). I. album og m. roseus inneholder to sett med nuoABCDHIJKLMN og ett sett med nuoEFG hver (Supplerende Figur S6). Interessant Er Kompleks i FRA NICIL-2 nært knyttet til De Av Rhodothermus marinus og Salinibacter ruber Av Bacteroidetes, som begge inneholder et komplett sett med gener FOR NADH: ubiquinonoksidoreduktase (Figur 5a). Homologer for De 11 Komplekse I-underenhetene ble også identifisert i alle seks NICIL-2-relaterte hyller gjenvunnet fra Yellowstone og Great Boiling Spring, og en sammenkoblet samling av disse proteinsekvensene gruppert med sekvensene FRA NICIL-2.

Nabo bli unrooted sammenkjedede protein trær Av Kompleks I (a) og alternativ Kompleks III (b). Tall i parentes angir antall underenheter som brukes til å bygge treet. Skala bar angir x endringer per amino-syre nettstedet.

ACIII ER en ny klasse av bakterielle membranoksidoreduktaser som finnes i organismer som ofte mangler bc1-komplekset (Yanyushin et al., 2005). DEN ACIII fra R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) og filamentøs anoksygen fototrofisk bakterie Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) har blitt renset og studert. Nylig ble et stort antall genklynger som koder FOR ACIII-underenheter, med variasjoner i grunnlov og organisasjon, funnet i en rekke bakterielle genomer (Refojo et al., 2013). For eksempel inneholder r. marinus genene actABCDEF i en operon som koder for seks ACIII-underenheter; homologer av denne genklyngen har blitt identifisert i flere medlemmer Av Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Et fylogenetisk tre viser forholdet MELLOM ACIII FRA NICIL-2 til sine nærmeste slektninger (Figur 5b). GSB har IKKE ACIII og derfor er de ikke representert i dette treet. Men ‘ Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, som ikke er MEDLEM AV GSB, koder FOR EN ACIII som sannsynligvis fungerer i aerob respirasjon (Liu et al.( 2012b). Det er viktig å merke seg at Både i. album og m. roseus er unike blant DETTE SETTET AV ACIII, da DE inneholder fem underenheter, med actDE-underenhetene identifisert som et fusjonsprotein. Et komplett komplement av gener som koder for ALLE ACIII-underenhetene, som ble gjenvunnet fra to NICIL-2-relaterte genomkasser fra Yellowstone-metagenomene, ble funnet å inneholde actDE-fusjonen og gruppert med I. album og m. roseus. NICIL – 2 inneholder ikke denne fusjonen, og genene for ACIII-Komplekset er nærmere knyttet Til R. marinus og S. ruber.

NICIL-2 terminal elektron akseptorer inkluderer en type-aa3 cytokrom c oksidase (Kompleks IV) og mulige alternative cytokrom c oksidaser, merket Som CoxMOP. NICIL – 2 er usannsynlig å være mikroaerofil fordi type cbb3 oksidaser ikke ble påvist i genomet. I tillegg var cytokrom bd uoppdaget. Til sammenligning inneholder både i. album-og m. roseus-genomene gener for cbb3-type cytokrom c-oksidase og et cytokrom bd-kompleks.

NICIL-2-genomet inneholder et ufullstendig sett med menns gener for syntese av menakinon. En komplett menaquinone biosyntetisk bane inneholder menFDHCEBAG (Bentley Og Meganathan, 1982) OG NICIL – 2 genomet inkluderer bare menBAG. Til sammenligning, C. tepidum Og Jeg. albumet inneholder komplette menn pathways, mens M. roseus og r. marinus genomer har merknader for alle nødvendige gener unntatt menB og menH, henholdsvis. Homologer av gener som koder for enzymer av den alternative menaquinonbiosyntetiske banen, futalosinveien (Arakawa et al., 2011), ble uoppdaget I NICIL-2. Ubiquinonbiosyntetiske gener er også fraværende. NICIL – 2-genomet kan ha ufullstendig dekning i dette området, og flere menngener kan bli funnet med et fullstendig montert genom. ALTERNATIVT KAN NICIL-2 engasjere seg i kinonutveksling med andre fellesskapsmedlemmer, som observert for phototrophic consortium ‘ Chlorochromatium aggregatum ‘(Liu et al., 2013).

Flagella og kjemotaksis

Gener som koder for proteiner for basal kropp, krok og filamentmontering er tilstede i NICIL-2-genomet. NICIL – 2 mangler imidlertid gener som koder for kjemotakseringsmaskiner, bortsett fra ett regulatorisk protein, CheY. GSB anses å være ikke-motile og mangler kjemotakse og flagella, mens i. album, m. roseus og r. marinus har flagellar og kjemotakse maskiner.