Stabilisering av heterochromatin VED KLOKKE fremmer stamcelleforyngelse og bruskregenerering

Antistoffer

for vestlig blotting: anti-KLOKKE (#5157, 1:1,000), anti-HP1a (#2616s, 1:1,000) og anti-HP1y (#2619, 1:3000) FRA CELLESIGNALTEKNOLOGI; anti-kap1 (Ab22553, 1:2000), anti-lamin b1 (ab16048, 1:1000) Og Anti-Lbr (Ab32535, 1:1000) fra abcam; anti-β-actin (sc-69879, 1:3000) fra santa cruz bioteknologi.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) Fra R&D-Systemer.

for flowcytometri: anti-CD73 (550257, 1:200), ANTI-CD90 (555595, 1:200), ANTI-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), ANTI-CD34 (555822, 1:200), ANTI-CD43 (560198, 1:200), anti-cd45 (555482, 1:200), anti-cd14 (555398, 1:200) og anti-cd19 (555415, 1:200) fra bd biovitenskap; ANTI-CD105 (17-1057-41, 1:200) og anti-pdpn (17-9381-42, 1:200) fra ebioscience (san diego, ca, usa); anti-CD29 (303004, 1:200) OG ANTI-CD13 (301705, 1:200), ANTI-CD166 (343903, 1:200) OG ANTI-CD164 (324805, 1:200) FRA BIOLEGEND (san diego, ca, usa).

Cellekultur

KLOKKE+/+ hESCs (hESCs, linje H9, Wicell Research Institute) og KLOKKE−/− hESCs ble opprettholdt på mater lag som besto av mitomycin C-inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) i hESC kultur medium. HESC kultur medium inneholdt DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific), 20% KnockOut Serum Erstatning (Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAX( Thermo Fisher Scientific), 55 µ β-merkaptoetanol (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin / streptomycin (Thermo Fisher Scientific) og 10 ng/mL bFGF (Leddproteinsentral, Incheon, Korea). Alternativt ble hESCs dyrket På Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)-belagte plater i mTeSR medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada).

både hesc-avledet hMSCs og primære hMSCs ble opprettholdt I MSC medium inneholdende MEMa (Thermo Fisher Scientific) supplert med 10% føtalt bovint serum (Fbs) (Cat# 10099-141, Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM NEAAs (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), og 1 ng/mL bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Korea).

CRISPR/Cas9-mediert genredigering i hESCs

CRISPR/Cas9-mediert genredigering ble utført via tidligere beskrevne metoder med noen modifikasjoner.33,34,65 kort sagt, en guide RNA målretting exon 5 AV KLOKKE (KLOKKE-gRNA) ble klonet i en gRNA kloning vektor (#41824, Addgene) (Supplerende informasjon, Tabell S1). Ved behandling Med EN STEINHEMMER Y-27632 (S1049, Selleck) i 24 timer ble hESCs (5 × 106) resuspendert i 100 µ Av Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) som inneholdt plasmid-cocktailen, som besto av donorplasmidet som inneholdt homologiarmene, CLOCK-gRNA og hCas9 (#41815, Addgene) og elektroporert I ET 4d-Nukleofektorsystem (Lonza). Celler ble deretter seeded PÅ MEF mater celler. G418 (100 µ / mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) ble lagt til for å initiere positiv seleksjon 2-4 dager etter elektroporering. Etter 2 ukers utvelgelse ble G418-resistente kloner plukket og overført til en 96-brønnplate for videre karakterisering og utvidelse. Genomisk PCR og western blotting ble brukt for genomisk redigering identifikasjon. I tillegg fjernet vi neomycin-motstandskassetten I KLOKKE – / – hESCs via elektroporasjon med pCAG-FLpo-2a-puro-vektoren. Tre dager etter transfeksjon ble 1 µ/mL puromycin (Thermo Fisher Scientific) brukt til å berike puromycin-resistente celler i 48 timer. etter 8-12 dagers seleksjon ble de fremvoksende koloniene plukket og utvidet for senere studier.

hMSC generasjon og karakterisering

hMSCs ble differensiert fra hESCs etter en tidligere publisert protokoll.25,86,87 kort sagt ble hESCs dissosiert i embryoide legemer (EBs) og behandlet med differensieringsmedium (MEMa (Invitrogen) supplert med 10% FBS (Cat# 10099-141,Lot# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mm NEAAs (ThermoFisher Scientific), 10 ng/mL bFGF, 5 ng/mL TGFß og 1% penicillin/streptomycin (Gibco)) på Matrigel-belagte plater i 10 dager til 95% samløp. DERETTER ble DE konfluente MSC-lignende cellene fordøyd og belagt På Matrigel-belagte plater behandlet MED MSC kulturmedium inneholdende MEMa (Invitrogen) supplert med 10% FBS, 0,1 mM NEAAs, 1 ng/mL bFGF og 1% penicillin/streptomycin (Gibco). DERETTER ble de konfluente MSC-lignende cellene sendt til gelatinbelagte plater. Hmsc – ene ble renset med forskjellige antistoffer tilsvarende hMSC – spesifikke markører (CD73, CD90 og CD105) AV FACS. CD73, CD90 og CD105 trippelpositive celler ble videre karakterisert av overflateantigenmarkører, inkludert positive markører, SOM CD44, CD166, CD29, HLA-ABC og CD13, og negative markører, SOM CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 og PDPN. Funksjonaliteten til hMSCs ble ytterligere verifisert ved differensiering mot kondrocytter, adipocytter og osteoblaster. Osteoblaster, kondrocytter og adipocytter avledet fra hMSCs ble preget av von Kossa-farging (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc. T3260, Sigma) og aggrecan farging (indikerer chondrogenesis), Og Olje Rød o (O1391, Sigma) farging (indikerer adipogenese) etter produsentens instruksjoner.

Isolasjon og kultur av primære hMSCs

Primære hMSCs ble isolert fra gingiva av forskjellige individer.23,33,34,65 vevene adskilt fra gingiva ble kuttet i små (1 mm2) biter ved hjelp av saks i TrypLE™ Express Enzym (1 ×) pluss Dispase IV og videre inkubert til 37 °C i 30 min. De fordøyede vevsuspensjonene ble nøytralisert AV MSC kulturmedium og sentrifugert ved 200 × g i 5 min ved romtemperatur. De resulterende pelletene ble resuspendert i MSC kulturmedium inneholdende MEMa (Invitrogen) supplert med 10% Fbs (Gibco), 1 ng/mL bFGF og 1% penicillin/streptomycin (Gibco) og belagt på gelatinbelagte plater for vekst av primære hMSCs.

Luciferase reporter assay

PER2-dLuc plasmidet var en snill gave fra E. E. Zhang.88 Celler husing PER2-dLuc ble dyrket til samløpet i 24-brønn kultur plater og synkronisert med 20 µ forskolin (S2449, Selleck) for 2 timer. mediet ble deretter erstattet MED MSC kultur medium inneholdende 0.25 mM luciferin (LUCK-1G, GoldBio). Cellene ble overvåket I Et LumiCycle luminometer ved 37 °C i 5-7 dager; de genererte dataene ble analysert med LumiCycle Analysis software (Actimetrics). Dataene fra den første 24-h-syklusen ble ekskludert fra vår statistiske analyse.

in vitro hMSC-synkronisering og sirkadisk analyse

hMSCs ble belagt på gelatinbelagte plater med MSC medium til 95% sammenløp. For synkronisering ble cellene deretter behandlet med 20 µ forskolin i 2 timer og lagret i MSC medium etter vask to ganger med PBS. Celler ble samlet fra 24 h post-synkronisering ved 3-h intervaller for 9 tidspunkter, etterfulgt AV RNA ekstraksjon og RT-qPCR deteksjon. Den ikke-parametriske testen JTK_CYCLE ble brukt til å verifisere sirkadiske svingninger som tidligere beskrevet.89 tid kurs tråder av hMSCs med både p og q verdier < 0,05 ble ansett rytmisk.

Western blotting

Celler ble lysert I SDS-buffer som inneholdt 4% SDS og 100mm Tris-HCl. Proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved HJELP AV Et bca-kvantifiseringssett (Thermo Fisher Scientific), og ~20 µ protein per prøve ble utsatt FOR SDS-PAGE og elektrooverført TIL PVDF-membraner (Millipore). Deretter ble membraner blokkert med 5% melk, og inkubert med primære antistoffer og deretter med pepperrot peroxidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer. Immunoreaktive bånd ble visualisert i Et Chemidoc XRS+-system (Bio-Rad). Statistiske analyser ble kvantifisert Av Image J software (NIH). Hver gruppe hadde tre uavhengige eksperimenter. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

Transmisjonselektronmikroskopi

Sen-passasje (P9) KLOKKE+/+ og KLOKKE – / – hmsc-er ble høstet enzymatisk med TrypLE (Thermo Fisher Scientific) og sentrifugert ved 500 × g i 5 min ved romtemperatur. De resulterende pellets ble festet med 4% paraformaldehyd (PFA) I pbs (pH 7.4) på is over natten. Cellene ble deretter dehydrert i en gradert serie av etanoler, permeabilized og innebygd I Lowicryl harpiks HM20. Seksjoner (200 nm) ble oppnådd og avbildet med Et Spirit transmission electron microscope (FEI Company) som opererer ved 100 kV.

immunfluorescensfarging

Celler sådd på dekkglass (Thermo Fisher Scientific) ble vasket to ganger med PBS. Deretter ble cellene løst med 4% PFA i 30 min, permeabilisert med 0.4% Triton X-100 I PBS i 30 min og blokkert med 10% eselserum i Pbs (Jackson Immuno Research) i 1 h ved romtemperatur. Etter blokkering ble celler inkubert med primære antistoffer ved 4 °c over natten. Deretter ble celler vasket tre ganger MED PBS, inkubert med sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 h og vasket tre ganger med PBS. Kjerner ble farget Med Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). Bildebehandling ble utført Med Et Leica SP5 konfokalt system. Statistisk analyse av antall, intensitet og område av fluorescenssignaler ble kvantifisert Av Image J software (NIH). Celler ble samlet inn fra tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test. 3d rekonstruksjon Av H3K9me3 farging som vist I Fig. 2f ble utført med seriell z-stack-snitting med 50 nm intervaller i konvensjonell modus for Opptil 50 bilder med Et Leica SP5 confocal-system og viderebehandlet FOR 3d-rekonstruksjon Av Imaris software (versjon 7.4.2) som tidligere beskrevet.90

SA-β-gal-fargeanalyse

SA-β-gal-fargeanalyse ble utført som beskrevet i tidligere studier.33,34 kort sagt ble celler festet med fikseringsbuffer (2% formaldehyd og 0.2% glutaraldehyd) i 5 min ved romtemperatur. Deretter ble faste celler farget med fersk fargeløsning ved 37 °C over natten. Synsfelt ble tilfeldig valgt i hver brønn, og prosentandelen AV SA-β-gal-positive celler ble bestemt ved Hjelp Av ImageJ-programvare. Hver gruppe hadde tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

Klonal ekspansjonsanalyse

en klonal ekspansjonsanalyse ble utført som tidligere rapportert.34,65 kort sagt ble 6000 celler per brønn sådd i 6-brønnplater og dyrket i 9-12 dager. Celler ble vasket to GANGER MED PBS, festet med 4% PFA og farget med 0,2% krystallviolett i 1 h ved romtemperatur. Synsfelt ble skannet av en skanner og videre målt Av ImageJ software (NIH). Hver gruppe hadde tre biologiske replikater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

Co-IP

HEK293T celler transfisert Med plasmider som uttrykker Flagg-Luc eller Flagg-KLOKKE og hMSCs ble lysert I CHAPS lysis buffer (120 mM NaCl, 0. 3% CHAPS, 1 mM EDTA, 40 mM HEPES (pH 7,5) og komplett proteasehemmercocktail (Roche)) ved 4 °C i 4 timer og ble deretter sentrifugert ved 14 500 × g ved 4 °C i 40 min. For Ko-IP med eksogene proteiner ble supernatantene blandet med antiflaggantistoffkoblede perler (A2220, Sigma) og rotert over natten ved 4 hryvnias C. For Ko-IP med endogene proteiner ble supernatantene blandet med de indikerte antistoffene over natten ved 4 °c med rotasjon og ble deretter inkubert med Protein A/G-Pluss Agaroseperler (sc-2003, Santa Cruz) i ytterligere 4 timer ved 4 °C med rotasjon. Perlene ble vasket seks ganger med CHAPS buffer og deretter eluert Med Flagg peptider eller ved å koke i 1× sds lastebuffer for 10 min for western blotting.

lc-MS/MS analyse og protein identifikasjon

eluerte proteiner oppnådd ved immunoprecipitation ble utsatt for 10% SDS-SIDE og farget Med Coomassie strålende blå (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Bioteknologi Co. Ltd). Gelbåndene som inneholdt proteinprøvene ble skåret ut, kuttet i små plugger, dehydrert( 100% acetonitril), redusert (10 mM DTT i 25 MM NH4HCO3 i 45 min ved 56 °C) og alkylert (40 mM iodoacetamid i 25 MM NH4HCO3 i 45 min ved romtemperatur i mørket). Deretter ble gelpluggene tørket og fordøyd med sekvenseringsgrad modifisert trypsin (40 ng per bånd) i 25 MM NH4HCO3 over natten ved 37 °C. til slutt ble maursyre til en 1% sluttkonsentrasjon brukt til å avslutte den enzymatiske reaksjonen. Den resulterende oppløsningen ble deretter overført til et prøvehetteglass for LC-MS / MS-analyse.

nanolc-MS/MS-forsøkene ble utført På Et Q-Eksakt massespektrometer (Thermo Scientific) i dataavhengig modus, som tillot ms-datainnsamling ved en høy oppløsning på 70.000 (m/z 200) over et m/z-område på 300-1600. Rådataene Fra Q Exactive analysis ble analysert Med Proteom Discovery (versjon 1.4) ved Hjelp Av Sequest ht-søkemotoren for proteinidentifikasjon og Perkolator for false discovery rate (FDR) analyse. Dataene ble søkt mot UniProt human protein database (oppdatert på 06-2013). FDR-analyse ble utført Med Perkolator, OG FDR < 1% ble satt som terskel for proteinidentifikasjon. Peptid tillit ble satt til høy for peptid filtrering.

RT-qPCR Og RNA-Seq

Totalt RNA ble ekstrahert fra dyrkede humane celler eller museledd ved Hjelp Av TRIzol (Thermo Fisher Scientific), og genomisk DNA ble fjernet ved HJELP AV ET DNA-fritt sett (Thermo Fisher Scientific). cDNA ble generert Med Go Script Reverse Transkripsjon System (Promega). RT-qPCR ble utført ved bruk av Qpcr Mix (Toyobo) i ET CFX384 Sanntidssystem (Bio-Rad). Hver gruppe hadde fire godt replikater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test. ALLE RT-qPCR-eksperimenter ble utført med minst tre eksperimentelle replikater og uavhengig gjentatt i minst to ganger. For museledd RNA-seq ble kneledd rna-prøver fra samme behandlingsgruppe av eldre mus injisert med lentivirus som uttrykte Luc (n = 12 mus) eller KLOKKE (n = 12 mus) blandet likt i masse, OG RNA-seq ble utført med to tekniske replikater. For hMSC RNA-seq ble to biologiske replikater undersøkt. Et sekvenseringsbibliotek ble konstruert ved Hjelp Av Et NEBNext Ultra Rna Library Prep Kit for Illumina etter produsentens protokoll. De genererte bibliotekene ble sekvensert På Illumina HiSeq X-Ten plattformer med parret-end sekvensering med 150-bp lese lengder. Kvalitetskontroll og sekvensering ble utført Av NoVo gene Bioinformatics Technology. Primere brukt for qPCR ble vist I Supplerende informasjon, Tabell S2.

RNA-seq databehandling

RNA-seq databehandling rørledningen har blitt rapportert tidligere.34 Raw paired-end leser ble trimmet I Trim Galore programvare (versjon 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Rene leser ble kartlagt TIL UCSC human hg19 genom eller mus mm10 genom ved hjelp av hisat2 (versjon 2.0.4).91 sam-filene ble konvertert til bam-filer av SAMtools med parameteren “- s-b-q 10”.92 deretter ble lesetallene beregnet av HTSeq (versjon 0.11.0), og bare kartlagte av høy kvalitet (kartleggingskvalitet > 20) ble beholdt.93 Fragmentene Per Kilobase Per Million (Fpkm) verdi for hvert gen ble beregnet ved Hjelp Av StringTie (versjon 1.2.3).94 Differensielt uttrykte gener (DEGs) ble beregnet Ved Bruk Av DESeq2 pakke (versjon 1.22.2) med cutoff “q verdi (justert p verdi, padj) < 0.05 og |log2 (fold endring)| > 1 for hMSCs eller |log2 (fold endring)| > 0.5 for mus ledd”. Gene Ontology (GO) anrikningsanalyse ble utfort med ToppGene.95 Gensettanrikningsanalyse ble utfort AV GSEA (versjon 2.2.4). SASP gensett ble hentet fra en tidligere studie.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam og pLgw EcoDam-V5-EMD var gaver fra Prof. Bas van Steensel (Det Nederlandske Kreftinstituttet (Nki)). DamID-seq ble utført som beskrevet,58 med modifikasjoner. Kort sagt ble Demningen og Demningen-EMD-lentivirusene generert fra HEK293T-celler konsentrert ved ultracentrifugering ved 19 400× g for 2,5 timer. viruspelletene ble resuspendert I PBS. CLOCK+ / + og CLOCK – / – hMSCs ble sådd i seks brønnretter ved 2 × 105 celler per brønn. Hver gruppe hadde tre biologiske replikater. Neste dag ble kulturmediet erstattet med 2 mL friskt kulturmedium som inneholdt Enten Dam ELLER Dam-EMD lentivirus. Ved 72 timer etter transduksjon ble celler høstet, og genomisk DNA ble isolert ved Hjelp Av Et DNeasy Blod & Vevssett (69504, Qiagen). DpnI (R0176S, New England Biolabs) fordøyelse, adapter ligering, DpnII (R0543S, New England Biolabs) fordøyelse, PCR forsterkning og rensing ble utført som tidligere beskrevet.58 for adaptertrimming ble det forsterkede DNA sonikert og fordøyd Med AlwI (R0513S, New England Biolabs). DNA-biblioteket ble konstruert ved Hjelp Av Et NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit For Illumina (E7370S, New England Biolabs). Bibliotekene ble samlet og utsatt for parret-end sekvensering med 150-bp lese lengder På Illumina NovaSeq sequencere.

DamID-seq databehandling

Rå leser Av Dam og Dam-EMD data FOR KLOKKE+/+ OG KLOKKE−/− hMSCs ble trimmet I Trim Massevis programvare (versjon 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmet leser ble kartlagt TIL UCSC human hg19 genom ved Hjelp Av Bowtie 2 (versjon 2.2.9).96 PCR duplikater ble fjernet Med MarkDuplicates.jar program I Picard verktøy. Deretter ble leser sortert Med SAMtools (versjon 1.6). For å minimere effekten av sekvensering bias og dybde, behandlet leser fra tre replikater for hver prøve ble slått sammen. Deretter ble det samme tallet (110 millioner) av høy kvalitet leser for hver celletype tilfeldig valgt for nedstrøms analyse. For å visualisere DamID-signalene beregnet vi log2-forholdet Mellom Lesene Per Kilobase Per Million kartlagte leser (RPKM) Av Dam-EMD-og Damsignalene (log2 (Dam− EMD/Dam)) I KLOKKE+/+ og KLOKKE−/-hMSCs for HVER 10-bp-bin ved hjelp av bamCompare-programmet i deepTools (versjon 2.5.4-2-5ee467f) programvare.

for identifisering AV LAD regioner I KLOKKE+ / + OG KLOKKE – / – hMSCs, vi først beregnet DamID signaler (log2 rpkm Av Dam-EMD og Dam signaler (log2 (Dam-EMD/Dam)) I KLOKKE+/+ og KLOKKE−/− hMSCs for HVER 2-kb bin bruker bamCompare program i deepTools (versjon 2.5.4-2-5ee467f) programvare. Deretter implementerte Vi r-pakken for skjulte Markov-modeller med t-utslipp (HMMt) (versjon 0.1), for å identifisere Gutter (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

for å sammenligne DamID-signalene i LAD-regioner mellom CLOCK+/+ og CLOCK−/− hMSCs, fusjonerte VI LAD− regioner identifisert i CLOCK+/+ og CLOCK−/− hMSCs til unionssignaler og beregnet det relative DamID− signalet (DamID-signal I CLOCK – / – hMSCs minus DamID-signal i CLOCK+ / + hMSCs) for hver union LAD-region. Deretter ble de relative DamID-signalene for LAD-regioner plottet ved Hjelp Av R-pakken RIdeogram (versjon 0.2.2), som vist I Tilleggsinformasjon, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR og ChIP-seq

kort sagt ble 1 × 106 KLOKKE+/+ OG KLOKKE−/− hMSCs kryssbundet i 1% (vol/vol) formaldehyd I PBS i 8 min ved romtemperatur, og reaksjonen ble avsluttet ved inkubasjon med 125 mM glycin i 5 min ved romtemperatur. Prøver ble deretter lysert på is i ytterligere 10 minutter. Etter sonikering i Covaris S220 fokusert ultralyd (Covaris) og sentrifugering i 10 min ved 12 000 × g ved 4 °C, ble supernatanter inkubert over natten ved 4 °C med Protein A-Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, 10004D) konjugert med ET ANTI-klokke antistoff, et Anti-H3K9me3 antistoff eller kanin IgG. Deretter ble eluering og omvendt tverrbinding utført ved 68 °C i 2 timer i en termomikser. DERETTER ble DNA isolert via fenol-kloroform-isoamylalkoholekstraksjon og etanolutfelling. Det rensede DNA ble utsatt for qPCR for evaluering AV KLOKKE Eller H3K9me3 yrke ved repeterende sekvenser. De berikede fragmentene ble konstruert i biblioteker uten inkorporering av spike-in kontroller via KAPA Hyper Prep Kits MED PCR Library Amplification / Illumina-Serien (KK8504, New England Biolabs) etter produsentens instruksjoner. Alle forsøkene ble utført minst to ganger med lignende resultater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

ChIP-seq databehandling

for behandling Av H3K9me3 ChIP-seq data, rå leser ble trimmet Med Trim Galore programvare (versjon 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmet leser ble kartlagt TIL UCSC human hg19 genom ved Hjelp Av Bowtie 2 (versjon 2.2.9).96 Dupliserte leser ble fjernet Med MarkDuplicates.jar program I Picard verktøy. Deretter ble leser sortert Med SAMtools (versjon 1.6). For å minimere effekten av sekvensering bias og dybde, behandlet leser fra tre replikater for hver prøve ble slått sammen. Deretter ble det samme tallet (130 millioner) av høy kvalitet leser for hver celletype tilfeldig valgt for nedstrøms analyse. For å visualisere ChIP-seq-signalene, beregnet vi de normaliserte lesetallene ved å bestemme rpkm-verdiene for hver 10-bp-bin. FOR H3K9me3 peak calling ble SICER (versjon V1.1) brukt med parameteren “-w 200-g 3”.98 bare kalt H3K9me3 topper med en cutoff FDR på 1% eller høyere ble beholdt.

for identifisering av “H3K9me3 fjell” ble h3k9me3-signalet i teller per million (CPM) i Hver H3K9me3-topp beregnet. Vi rangerte Deretter h3k9me3-toppene i rekkefølge av økende h3k9me3-signal og plottet h3k9me3-ChIP-seq-belegget I KLOKKE+ / + og KLOKKE – / – hMSCs, som vist I Tilleggsinformasjon, Fig. S4f. Disse tomter viste et klart punkt der H3K9me3 belegg signal begynte å øke raskt. Deretter ble bøyningspunktene til disse kurvene bestemt. Vi definerte Videre H3K9me3 topper over bøyningspunktene som “H3K9me3 fjell” og H3K9me3 topper under disse punktene som typiske H3K9me3 topper.

ATAC-seq

ATAC-seq ble utført som beskrevet tidligere.99 i korte trekk ble totalt 50 000 celler vasket to ganger med PBS og resuspendert i 50 µ lysebuffer (10 Mm Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) Nonidet P40 erstatning). Suspensjon av kjerner var så sentrifugerte på 500 × g i 10 min ved 4 °C, etterfulgt av tillegg av 50 µL av transposition reaksjonsblanding (10 µL 5 × TTBL buffer, 4 µL av TTE-blanding og 36 µL av nuclease-gratis H2O) fra en TruePrep DNA-Bibliotek Prep Kit V2 for Illumina (Vazyme Biotech). Prøver ble deretter inkubert ved 37 °C i 30 min. Bibliotekene ble deretter forsterket og renset ved Hjelp Av TruePrep DNA Library Prep Kit V2 For Illumina (Vazyme Biotech). Bibliotekets kvalitet ble vurdert ved hjelp av en fragmentanalysator. Til Slutt ble biblioteker sekvensert På Illumina HiSeq X-Ten plattformer med parret sekvensering med 150 bp leselengder.

atac-seq databehandling

for behandling av atac-seq data, raw leser ble trimmet Med Trim Galore programvare (versjon 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Trimmet leser ble kartlagt TIL UCSC human hg19 genom ved Hjelp Av Bowtie 2 (versjon 2.2.9) med parameteren “- X 2000-N 1-L 25-nei-blandet-nei-uharmonisk-t”.96 Dupliserte leser ble fjernet Med MarkDuplicates.jar program I Picard verktøy. Deretter ble leser sortert Med SAMtools (versjon 1.6) programvare. Deretter ble behandlet leser fra tre replikater for hver prøve slått sammen. For å visualisere atac-signalene utvidet vi hver les med 250 bp og normaliserte lesetallene med rpkm-verdien for hver 10-bp-bin. FOR atac peak-anrop ble MACS2 (versjon 2.1.1.20160309) brukt med parameteren – – nomodel-shift 0-extsize 250-call-summits”.100 bare kalt ATAC topper med q verdier < 0.01 ble beholdt. ATAC-topper identifisert i CLOCK+ / + men ikke I CLOCK−/− hMSCs ble definert som “Lukkede” atac-topper; ATAC-topper identifisert i CLOCK – / – men ikke I CLOCK+ / + hMSCs ble definert som “Åpnede” atac-topper. Estimering av genomisk fordeling av atac-topper som brukes annotatePeaks.pl program i homer programvare.101

Vurdering av reproduserbarheten av sekvenseringsdataene

for å evaluere reproduserbarheten Av H3k9me3-Brikken-seq og atac-seq-dataene ble Den Euklidiske avstanden mellom replikater beregnet som følger: leser ble talt og normalisert AV RPKM på en 2-kb bin størrelse. Deretter ble Den Euklidiske avstanden beregnet I r (versjon 3.5.1) for å evaluere reproduserbarheten. Lavere Euklidske avstander betyr høyere korrelasjoner. For å evaluere reproduserbarheten Av DamID-seq-data ble principal component analysis (PCA) utført I r (versjon 3.5.1). For å evaluere reproduserbarheten AV rna-seq-data ble spredningsplott trukket basert på den regulariserte logaritmen (rlog)-normaliserte lesetallet Med DESeq2, og Pearson korrelasjonskoeffisienten mellom replikater ble beregnet.

Dyreforsøk

FOR teratomformasjonsanalyse, NOD / SCID-mus (6-8 uker gamle, kjøpt fra Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) ble injisert med 3 × 106 KLOKKE+/+ eller KLOKKE – / – hESCs i En Matrigel:mTeSR (1: 4) oppløsning. Teratomer ble høstet 8-12 uker etter injeksjon for videre analyse.

for hMSC− transplantasjonsanalyser ble 1 × 106 KLOKKE+/+ eller klokke−/ – hMSCs transdusert med lentivirus som uttrykker Luc injisert I TA-muskelen hos nakne mus (6-8 uker gamle). Mus ble deretter behandlet Med D-luciferin (LUCK-1G, GoldBio) og avbildet med ET Ivis Spectrum imaging system (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, USA). Bioluminescensbilder ble kjøpt i” auto ” – modus. Hver gruppe hadde seks biologiske replikater. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

for aldringsassosiert klokkenivådeteksjon ble mus av forskjellige aldre (unge, 1 måned, n = 5 mus; gamle, 15 måneder, n = 10 mus) euthanized og leddene ble samlet for RT-qPCR-analyse. Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

for å vurdere om lentiviral administrasjon AV KLOKKE kunne lindre aldringsrelaterte syndromer, ble lentivirus som uttrykte Luc (n = 14 mus) eller KLOKKE (n = 13 mus) injisert i leddhulene hos 18 måneder gamle mus (kjøpt fra SPF (Beijing) Bioteknologi) og etterfylt etter 8 ukers injeksjon. Tredemølleforsøk ble utført 15 uker etter den første injeksjonen med lentivirus som uttrykte Luc eller CLOCK. I detalj ble mus trent på tredemølle (SA101, SANS) i en helling på 5° over 3 dager for 20 min hver dag, med hastigheten akselerert fra 0 til 20 m / min. På testdagen løp musene på tredemølle med en innledende hastighet på 0 m/min, og deretter ble hastigheten økt med 2 m / min til 20 m / min. Hele kjøretiden ble satt til 20 min. Frekvensen av mild elektrisk støtstimulus ble registrert og analysert (Luc, n = 14 mus; KLOKKE, n = 13 mus). Mikro-CT-skanning ble utført 16 uker etter første injeksjon(Luc, n = 14 mus, KLOKKE, n = 13 mus). Mus ble deretter euthanized, og leddene ble samlet for histologisk vurdering (Luc, n = 14 mus; KLOKKE, n = 13 mus) og mRNA kvantifisering (Luc, n = 12 mus; KLOKKE, n = 12 mus). Statistiske signifikanser ble vurdert av en to-tailed unpaired Students t-test.

Histologi og immunhistokjemi

for histologisk analyse ble høstet musefuger festet med 4% PFA i 2 dager og innebygd i paraffin etter avkalking i 14-21 dager. Seksjoner (5 µ) ble farget med rask grønn FCF (0.02%) og safranin O (0.1%) i henhold til produsentens instruksjoner.

Immunhistokjemisk farging ble utført ved HJELP AV DAB-fargemetoden som tidligere beskrevet, med noen modifikasjoner.33,34,102 først ble lysbilder deparaffinisert og rehydrert ved bruk av xylen og forskjellige konsentrasjoner av alkohol. Antigen henting ble utført Ved Bruk Av Trypsin (ZLI-9010, ZSGB-BIO) fordøyelse i 20 min ved romtemperatur. Hydrogenperoksid (3%) ble brukt til å blokkere endogen peroksidaseaktivitet ved å inkubere i 10 min ved romtemperatur. Lysbilder ble deretter blokkert med 10% eselserum i 1 time ved romtemperatur og inkubert med et Anti-P16-antistoff (Ab54210, Abcam, 1:200) ved 4 °c over natten og med et sekundært antistoff (PV-6002, ZSGB-BIO) i 1 time ved romtemperatur før dab-farging (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Etiske erklæringer

forsøkene som er involvert i denne studien fulgte Prinsippene for Søknadsformatet For Etisk Godkjenning For Forskning Som Involverer Dyr og ble godkjent på forhånd av Institutional Animal care And Use Committee Ved Institutt For Zoologi (Kinesisk Vitenskapsakademi). Anestesi av mus ble utført med isofluran og eutanisering ble utført MED CO2 etterfulgt av cervikal dislokasjon.

Statistisk analyse

Statistiske analyser ble utført Ved Hjelp Av Graph-Pad Prism Programvare. Data presenteres som midler ± SEM eller SD. Sammenligninger ble utført med to-tailed unpaired Studentens t-test. P-verdi (p) < 0,05 ble definert som statistisk signifikant.