Transformasjon Av trassig plantevernmiddel klordecone Av Desulfovibrio sp.86 med en bryter fra ringåpningsdeklorering til reduktiv sulfidasjonsaktivitet

Isolering Av Desulfovibrio sp.86

Isolering Av Desulfovibrio sp.86 ble oppnådd fra klordecone-nedverdigende konsortium 865 ved bruk av sulfatreduserende forhold. Som bakteriell konsortium 86, i stand til å transformere klordekon, ble oppnådd fra et beriket mineralmedium (MM) KALT MM + 5, supplert med klordekon, ble den viktigste kjemiske sammensetningen holdt, men elektrondonorer og akseptorer ble modifisert. Flere medieformuleringer som brukes til å berike sulfatreduserende bakterier, bruker organiske syrer, f. eks. laktat, som karbon-og energikilder (elektrondonor) og sulfat som brukes som eletron-akseptor for vekst15,16,17,18. I denne sammenheng ble pyruvat i MM + flytende medium erstattet av laktat og sulfat ble tilsatt (MMD flytende medium, se avsnittet” Metoder”). Anrikningen ble spredt PÅ MMD agar og de brune vibrio-lignende bakteriekoloniene (observert under optisk mikroskop)ble renset videre gjennom to ekstra platestreker (Fig. S1). En isolert bakteriestamme ble funnet å være identisk Med Desulfovibrio sp.86 fra consortium 86 basert pa 100% identiteter av DERES 16s rRNA-gener(1538 bp hver).

Genomanalyse Av Desulfovibrio sp.86

hele genomet består av et enkelt 3.464.070 bp sirkulært kromosom. CheckM analyse19 utført med 61 genomer og 284 linjer indikerer at genomet tilhører Deltaproteobacteria og CheckM Fullstendighet er 100% (null viktig markør mangler). Gjennomsnittlig G + C – INNHOLD for DNA er 58,06%. Totalt 3342 kodende DNA-sekvenser (CDSs) ble spådd for kromosomet, 4 pseudogener og 10 diverse Rna( misc-RNA), 3 rrna-operoner og 54 trna-gener.

De tre 16s rRNA-genene Av Desulfovibrio sp.86 er identiske. Deres beste BLAST hits (NCBI) var fra uncultured Desulfovibrio sp. kloner Fra Mikrobielle Brenselceller som MFC63A04 (Genbank tiltredelsesnummer : FJ823865; dekning 98%; identitet 99,87%)20. Et fylogenetisk tre ved hjelp av tilgjengelige 16s rRNA av dyrkbare bakterier bekreftet likhetene Mellom Desulfovibrio sp.86 Og Desulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16s rrna tiltredelsesnummer: NR_117110; dekning 99%; identitet 99, 22%; genomisk sekvens utilgjengelig) (Fig. S2) 21. På genomisk nivå, Desulfovibrio sp.86 rangerer først Med Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27,774 genom (GenBank: NC_011883). Likevel, Desulfovibrio sp.86 deler bare 1,408 gener (43%) Med d. desulfuricans (over 80% aminosyreidentitet og 80% justeringsdekning). I tillegg er gjennomsnittlig nukleotididentiteter (ANI) Mellom Desulfovibrio sp.86 og sekvenserte Desulfovibrio genomer er lavere enn 95% ANI cut-off verdi generelt akseptert for art avgrensning (Fig. S3) 22. Disse resultatene indikerer At Desulfovibrio sp.86 er sannsynligvis en ny art Av Desulfovibrio-serien. Tilstedeværelsen av to superoksiddismutaser og ett katalasegen står for dens relative oksygentoleranse. Som forventet, Desulfovibrio sp.86 genom viser et omfattende genkomplement for svovelmetabolisme, som omfatter svovelpusteveiene med uorganiske kilder som sulfat, sulfitt, bisulfitt og tetrathionat som elektronacceptorer. Organiske svovelkilder kan tilveiebringes ved fermenteringsprodukter av svovelbiomasse (sulfoquinovose av sulfoquinovosyllipider) sulfoacetat, svovel-ikke-proteogen aminosyre taurin via sulfoacetaldehyd eller alkanesulfonater23.

Desulfovibrio sp.86 nedbryter klordekon til kjente transformasjonsprodukter, samt en uventet svovelholdig forbindelse

klordekon-nedverdigende evne til det isolerte Desulfovibrio sp.86 stamme ble undersøkt VED HJELP AV gc-MS (Gasskromatografi Massespektrometri) og LC-HRMS (Væskekromatografi Med Høy Oppløsning Massespektrometri) teknikker i vekstforhold vellykket anvendt For Desulfovibrio sp.86 isolasjon (MMD flytende medium). Na2S ble brukt som reduksjonsmiddel og en anaerob n2/H2 (98/2; V / V) atmosfære ble påført ved hjelp av et hanskeromssystem. Disse inkubasjonsforholdene førte til fullstendig forsvinning av klordekonsignalet I GC-MS og LC-HRMS, og resulterte i lignende gc-MS OG LC-HRMS tp-profiler som de som ble oppnådd med Citrobacter sp.866: monohydrochlordecone A1, pentakloroindene B1, tetraklorindener B3-B4 og polykloridenkarboksylsyrer C1-C2 Og C3-C4 (Fig. 1a, b). I hanskebokssystemet ble bakteriekulturer utført ved bruk av 100 mL glassflasker med en hydrofob porøs film for å muliggjøre gassutveksling og unngå forurensning. Denne inkubasjonstilstanden ble ansett som” fornyet atmosfære ” tilstand (RA). I dette systemet ble atmosfæren regelmessig fornyet Med N2/H2 (98/2; V / V) og boksen var ikke termostatstyrt, slik at temperaturen varierte mellom 25 Og 33 °C. For bedre å kontrollere vekst-Og nedbrytningsforhold, Desulfovibrio sp.86 kulturer ble plassert I MMD medium ved bruk av 100 mL hetteglass, forseglet med butylgummi septa, i en ovn ved 30 °C. Forseglede hetteglass ble først renset Med n2/H2 (98/2; V / V) gass for å sikre anaerobiose. Denne inkubasjonstilstanden ble ansett som” begrenset atmosfære ” forhold (CA).

gc-MS og LC-HRMS overvåking, i full-scan modus (vilkårlig enhet), av klordecone transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 VED RA-forhold (i hanskerom, anaerobiose (N2/H2, 98/2, V/V), romtemperatur, åpne hetteglass med porøs film, I MMD-medium supplert med 40 mg/L klordekon) og CA-forhold (i ovn, anaerobiose (opprinnelig renset Med N2/H2, 98/2, V/V), 30 °c, forseglede hetteglass, I MMD-medium supplert med 40 mg / L klordekon); og identifikasjon AV TP F1. (a) gc–MS overvåking Av klordecon transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 I RA forhold. (b) LC-HRMS overvåking Av klordekon transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 I RA forhold. (c) gc–MS overvåking Av klordecone transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 i FORHOLD. (d) LC-HRMS overvåking av klordekon transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 i FORHOLD. In each graph, green circles represent chlordecone, red circles F1, blue triangles 10-monohydrochlordecone A1, pink squares 2,4,5,6,7-pentachloroindene B1 and purple diamonds 2,5,6,7-tetrachloroindenecarboxylic acid and 2,4,5,6-tetrachloroindenecarboxylic acid C1–C2. In RA conditions traces of B3-B4 and C3–C4 TPs were also detected. (e) Chlordecone transformation over the time in CA conditions, OD600 corresponds to the optical density at 600 nm in biotic conditions. (f) GC mass spectrum of F1 TP and its interpretation.

etter seks ukers inkubasjon med klordekon var plantevernmiddelet ikke lenger detekterbart ved de samme analytiske teknikkene. Samtidig oppstod en enkelt ukjent klorert forbindelse kalt F1. Det var detekterbart bare GJENNOM GC-MS (25.6 min) (Fig. 1c). Som i den tidligere rapporterte klordekon degraderingskulturen5, 6, oppstod hovedklordekontransformasjonen under den stasjonære fasen(Fig . 1e). Siden ingen synlig klorert topp kunne observeres i LC-HRMS (Fig. 1d), baserte vi strukturell belysning Av F1 på tolkningen AV gc-MS data (Fig. 1f). Forutsatt at det høyere isotopiske mønsteret sentrert ved m / z 507.8 inneholdt molekylær ion, hypoteser vi to mulige nøytrale formler For F1, C10Cl10O2H2 og C10Cl10SH2. In-source fragmenter var svært lik de som ble observert i polyklorerte bisjomokubanbaserte strukturer, inkludert klordekon, hydroklordekoner, klordekol og mirex5,6, 24. Faktisk er de isotopiske mønstrene ved m / z 201.0, 235.9 og 271.9 antagelig oppsto fra den kjente in-source bishomocubane retrocyclodimerization og tilsvarte positivt ladede C5-fragmenter. Sammenligning med isotop simuleringer begrenset muligheten til følgende radikale ioner: +· +· og +·, med n = 0,1. Den sistnevnte bis-oksygenerte generiske formelen viste seg å være svært usannsynlig siden det krevde tilstedeværelse av en perle-diol-funksjon eller en perle-klorhydrindel på cyklopentenylringen som måtte motstå de harde GC-kromatografiske forholdene (> 200 °C). I stedet konkluderte vi med at en svoveldel, dvs. en tiol funksjon, var sannsynligvis til stede på bishomocubane polycycle. Vi foreslo For F1 strukturen avbildet I Fig. 2a og foreslo navnet chlordecthiol, svovelanalogen av chlordecol (chlordecone alkohol).

Syntese av kjemisk standard chlordecthiol og dens fullstendige karakterisering. (A) Kjemisk reaksjon ordningen med klordektiol syntese OG NMR skift I CD2Cl2: 1H NMR skift, kursiv og understreket OG 13C NMR skift, i fet skrift; tilsvarende fargede sirkler indikerer ekvivalente karbonatomer. (b) m/z simulering Av C10Cl10O2H -, (c) m / z simulering Av C10Cl10SH -, (d) ekstrahert høyoppløselig massespektrum av syntetisk chlordecthiol i negativ modus (LC-HRMS).

Syntese av chlordecthiol-standarden og bekreftelse på at transformasjonsprodukt F1 er identisk med chlordecthiol

for å bekrefte strukturen Til F1 ble standard chlordecthiol kjemisk syntetisert og fullt karakterisert. For å oppnå kjemisk reduktiv sulfidering av klordekon var det nødvendig med to trinn. Den første besto i omdannelsen av gem-diol-funksjonen av klordecon i likevekt med den tilsvarende ketonformen20, 25 til svovelanalogen, dvs. gem-tiol/tiokarbonyldel. For å utføre dette trinnet, brukes fosforholdige svovelreagenser generelt26, 27. Her brukte vi fosfordekasulfid (P4S10) også kalt Berzelius reagent27, 28 i henhold Til Protokollen Fra Zaidi og kollegaer som vellykket syntetiserte kamferthiol29(Fig . 2a). Det andre trinnet besto i reduksjon av perle-tiol-mellomproduktet Ved Bruk Av NaBH4. Etter rensing ble et hvitt fast stoff oppnådd i et samlet utbytte på 73% (Fig . 2a). 1d-OG 2D-NMR-analysene bekreftet klordektiol-strukturen: (i) to 1h-signaler som integrerer hver for en proton og koblet sammen (δ 3.78 ppm, d, J = 5.5 Hz Og δ 2.01 ppm, d, J = 5.5 Hz), med den ene ved δ 3.78 ppm korrelert med ET 13c-signal skiftet nedfelt (δ 55.1 ppm) I HSQC-eksperiment som perfekt tar hensyn TIL CH-delen ved siden av tiolfunksjonen og (ii) TOTALT SEKS SYNLIGE 13c-signaler som reflekterer symmetriplanet bevart i den nåværende bishomocubane-STRUKTUREN (fig. 2a, Fiken. S19–23). Selv om f1 i mikrobiell transformasjon Ikke kunne detekteres ved HJELP AV lc-HRMS-verktøy under de utviklede forholdene, ga en konsentrert prøve av den syntetiske standardklordektiol et signifikant signal. Tilstedeværelsen av et svovelatom og den forventede nøytrale formel C10Cl10SH2 ble bekreftet (Fig . 2c, d), og råformlene C10Cl10O2H2 ble utelukket (Fig. 2b). TIL slutt viste gc-MS-analysen den perfekte kampen(dvs. samme retensjonstid på 25,6 min og samme kildemassespektra Fig. S6) mellom syntetisk standard Og TP F1, og dermed definitivt tildele det som chlordecthiol. Faktisk representerer F1 det første medlemmet av en ny familie av chlordecone TPs som for første gang har et svovelatom.

evnen Til Desulfovibrio sp.86 for å nedbryte klordekontransformasjonsprodukter

Forbindelser A1, B1, C1-C2 og F1 som representerer de fire familiene Av TPs, muligens dannet i Nærvær Av Desulfovibrio sp.86 ble syntetisert i henhold til kjemiske protokoller tidligere rapportert6 og her utviklet For F1. Hver av dem ble inkubert i nærvær Av Desulfovibrio sp.86 kulturer under forhold som har vist seg å fremme reduktiv sulfidering (forseglet hetteglass, CA-forhold) eller deklorering med ringåpning (åpent hetteglass, RA-forhold). Dual GC-MS og LC-HRMS overvåking av alle prøvene ble utført.

etter en måneds inkubasjon UNDER CA-forhold ble 10-monohydrochlordecone A1 fullstendig omdannet til to ukjente klorerte forbindelser knapt separert ved BRUK AV GC–MS (retensjonstid: 24.3 Min F2 og 24.5 Min F3, Fig. 3, Fiken. S7-S11). De viste et identisk kildemassespektrum som var svært lik F1-fragmenteringsmønsteret (Fig. S8). Alle oppdagede kildefragmenter viste seg å ha ett kloratom mindre enn deres analoger I F1 massespektrum. Forbindelser F2 Og F3 ble således antatt å være diastereoisomerer av 10-monohydrochlordecthiol(Fig. 3c). Dette ble bekreftet ved kjemisk syntese av de to 10-monohydrochlordecthiol-standardene fra 10-monohydrochlordecone A1 ved bruk av prosedyren som tidligere ble brukt for syntese av klordektiol F1 (Fig. S24–27). Disse kjemiske standardene hadde de samme retensjonstidene (24,3 og 24,5 min) og de samme massespektrene sammenlignet med den biologiske F2 Og F3 (Fig. S8). TPs B1, C1-C2 og F1 forblir uendret selv etter seks måneders inkubasjon med Desulfovibrio sp.86 i HENHOLD TIL VILKÅRENE.

Fates av chlordecone transformasjon produkter Med Desulfovibrio sp.86 avhengig av inkubasjonsforhold. (a) Transformasjon av klordekon under RA-forhold og (b) UNDER CA-forhold. Transformasjon av (c) A1, (d) F1, (e) B1 og (f) C1-C2.

etter seks måneders inkubasjon under RA-forhold ble klordektiol F1 delvis omdannet til 10–monohydrochlordektioler F2 Og F3, og to andre ukjente klorerte arter oppdaget VED BRUK AV GC-MS, kalt F4 (retensjonstid: 17,9 min) Og F5 (retensjonstid: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Ingen av disse to forbindelsene ga noe detekterbart signal i LC-HRMS. GC-MS analyse aktivert for å foreslå C10Cl6SH4 som rå formel For F4(Fig. S14), Og C11Cl10SH4 for F5 (Fig. S15). Metylklordecsulfid ble kjemisk syntetisert og fullt preget AV NMR(Fig. S28–31). Den perfekte korrespondansen MELLOM gc retensjonstider OG gc massespektra av metylklordecsulfid og biologisk F5 (Fig. S13) bekrefter sin postulerte identitet. Bemerkelsesverdig, strukturen Av F5 (Fig. 3d) representerer En s-metylert form Av F1. Den nøyaktige natur F4 gjenstår å klare (se Si-Supplerende Tekst). Alle Andre TPs forblir uendret under RA-forhold.

oppsummert, a1 (dannet UNDER RA-forhold) gjennomgikk en reduktiv sulfidering akkurat som klordekon; under begge inkubasjonsbetingelsene syntes polyklorindener (B1 Og C1-C2) ikke å være nedbrytbare Av Desulfovibrio sp.86, Mens F1 (produsert UNDER CA-forhold) kunne transformeres UNDER RA-forhold (Fig. 3).

Undersøkelse av inkubasjonsbetingelsene som fører til bakteriell reduktiv sulfidering

for å stille spørsmål ved fysisk-kjemiske eller fysiologiske parametere som påvirker transformasjonsveiene til klordekon i kulturer Av Desulfovibrio sp.86, gc-MS overvåking (B1 Og F1 tilstedeværelse som bevis PÅ RA og CA forhold, henholdsvis) ble valgt.

To svovelholdige uorganiske forbindelser, reduktanten Na2S og elektronacceptoren Na2SO4, var tilstede i det opprinnelige MMD-væskemediet. En første serie eksperimenter i forseglede hetteglass med substitusjon Av Na2S med andre reduksjonsmidler, svovelert eller ikke, dvs. cystein og titan(III) citrat (TiCi) førte til et sammenlignbart nivå av klordektiol F1 (Tabell 1). Spor AV TP B1 ble også observert i alle forsøk, Inkludert Na2S, den positive kontrollen (Tabell 1).

Et annet sett med eksperimenter ble designet ved Hjelp Av Na2S som reduksjonsmiddel og alternative svovelbaserte elektronacceptorer i forseglede hetteglass (Tabell 2). Bruk av 90% 34s-beriket uorganisk sulfat resulterte i et klordektiol produkt som viser lignende 34s-berikelsesnivå (90% 34s-F1 / 10% F1, Fig. S16). GC-MS analyse av kultur headspace avslørte også tilstedeværelsen AV H234S OG H3C34SH(Fig. S16), og dermed viser At Desulfovbibrio sp.86 produsert H2S fra sulfat. Disse gassene ble detektert i kulturen headspace I CA forhold, VED HJELP AV MMD medium, mens DE var fraværende fra kulturen headspace I RA tilstand som tilsvarte hanskerommet atmosfæren (Fig. S17). Fravær av sulfat hemmet Ikke Desulfovibrio sp.86 vekst, men det resulterte i dannelse Av B1 (Tabell 2) 5. Remplacement av sulfat med sulfitt, bisulfitt eller tiosulfat førte i alle tilfeller til dannelsen av chlordecthiol F1.

en tredje serie eksperimenter med krukker undersøkte effekten av naturen av gassfasen i kontakt med kulturen. MELLOM RA-tilstanden ved bruk av åpne hetteglass i hanskerommet og CA-tilstanden ved bruk av forseglede hetteglass i ovnen, var det flere parametere som var forskjellige (atmosfærens natur og volum, temperatur). Ved hjelp av en krukke system inkludert flere ampuller, vi selektivt studere effekten av atmosfære fornyelse på klordecone transformasjon Av Desulfovibrio sp.86 i MMD medium. I hvert tilfelle ble åpne hetteglass med hydrofobe porøse filmer plassert i krukker først renset med en valgt gass. Alle glassene ble inkubert på 30 °C. Noen av dem ble spylt flere ganger, å etterligne hanskerommet system, mens andre ble holdt lukket.

Krukker 1-4 inneholdt to identiske åpne hetteglass fylt MED MMD, klordecone og Desulfovibrio sp.86 inokulum, og en negativ abiotisk kontroll. Blant dem ble to krukker skyllet to ganger i uken, krukke 1 med (N2 / H2 (98/2; V / V)), krukke 2 Med N2 (Fig . 4a), mens krukker 3 og 4, opprinnelig renset Med N2 og (N2 / H2 (98/2; V / V)) henholdsvis ble forlatt unflushed (Fig. 4b).

Skjematisk fremstilling av gassstyrte eksperimenter. (a) Flushed krukker, (b) unflushed krukker, (c) unflushed krukker med sulfat-fri Desulfovibrio sp.86 kulturer.

de to siste krukkene (krukke 5 og 6) inneholdt tre åpne hetteglass fylt MED MMD, klordecone og Desulfovibrio sp.86, pluss en kultur uten sulfat. Disse krukkene ble opprinnelig spylt med (N2 / H2 (98/2; V / V)) og forlatt unflushed i 2 måneder (Fig. 4c).

parallelt med glassene, to forseglede hetteglass fylt MED MMD uten sulfat, klordecone og Desulfovibrio sp.86 ble spylt med ekstemporært syntetisert H2S (Fig. S4).

ETTER to måneders inkubasjon ved 30 °c ble TP B1 påvist i hetteglass plassert i de skyllede krukkene 1 og 2 (Tabell 3a), MENS TP F1 kun ble funnet i hetteglass plassert i uflushede krukkene 3 og 4 (Tabell 3b). INGEN TP var tilstede i de abiotiske kontrollene. I krukkene 5 og 6 var F1 til stede i både sulfat-Og sulfatfri Desulfovibrio sp.86 åpne kulturer (Tabell 3c). På Samme måte, Desulfovibrio sp.86 sulfatfrie kulturer, spylt MED H2S viste signifikante nivåer Av F1 TP, mens ingen transformasjon ble observert i negativ kontroll (Tabell 3d).

et ytterligere kjemisk eksperiment ble utført for å vurdere PÅVIRKNING AV H2S på klordekontransformasjon. Klassisk kjemisk protokoll som muliggjør b-Og C-tps-dannelse, ble påført (klordekon, titancitrat, vitamin B12, vann). Under n2-atmosfæren ble B Og C TPs oppnådd, men under H2S-atmosfæren ble bare A1 produsert(Fig. S18).

disse resultatene viser tydelig at dannelsen av klordektiol F1 krever et lukket inkubasjonssystem med en reduserende atmosfære. Men H2 som den opprinnelige gassatmosfæren er ikke obligatorisk, mens tilstedeværelsen AV H2S er nødvendig. Kjemisk forhindrer tilstedeværelsen AV H2S fra ringåpningsdekloreringsprosess.

miljømessig relevans av klordecon reduktiv sulfidering

vi undersøkte vår tidligere samling Av Martinique Island klordecone-forurenset miljøprøver (åtte jordsmonn og to bed sedimenter) der ulike nivåer av klordecone TPs hadde blitt rapportert6. Blant de nye svovelholdige Tp-ene som er rapportert her, fant vi merkbare Nivåer Av F1 i de to sedimentprøvene (927 og 928) ved en konsentrasjon estimert til henholdsvis 50 µ/kg og 20@g / kg vått sediment (Tabell S1). Parallelt, bakteriell populasjonsdiversitetsdata utstedt fra metabarcoding analyse av disse prøvene (Fig. 5, Fig. S5) ble behandlet for å gjenopprette en hierarkisk klynging av miljøprøver i henhold til deres taksonomiske sammensetning6. Det ble lagt merke til at sulfatreduserende bakterier var mye mer tilstede i sengesedimenter enn i de andre delene, som tidligere rapportert30, 31, 32.

Dendrogram generert fra hierarkisk clustering av miljøprøver i henhold til bakteriell populasjonsdiversitet (Fra r-pakke pvclust v. 1.3-2, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btl117). 200.000 sekvenser ble tatt for hver miljøprøve og normalisert. Prosentandelen av påvist phyla ble representert her med fokus på sulfatreduserende bakterier fra Deltaproteobacteria-klassen, Firmicutes og Nitrospirae phyla. I rødt representeres den objektive (au) p-verdien og i grønt bootstrap-sannsynlighetsverdien (bp). SRB = Sulfatreduserende bakterier.