Type III kollagen er avgjørende for kollagen i fibrillogenese og for normal kardiovaskulær utvikling

RESULTATER OG DISKUSJON

ES (J-1) celler (22)ble transfisert med en målrettingsvektor som inneholdt Et Col3a1 gengenomisk DNA-fragment der promotorregionen av genet og den første ekson som koder for signalpeptidet ble slettet (Fig . 1A). Målrettede ES-cellekloner ble identifisert Ved Southern blot-analyse og brukt til blastocystinjeksjon (Fig. 1b Øvre). Mutantmus ble avledet fra to uavhengig målrettede ES-cellekloner og identifisert Ved Southern blot-analyse(Fig. 1b Lavere). Proteinanalyse av hale-og hudkollagen viste at heterozygote mutantmus har omtrent 50% reduksjon i type III kollagen, mens ingen type III kollagen ble påvist hos homozygote mutantdyr (Fig. 1C).

Mutante dyr var fruktbare, men bare heterozygote mus var fenotypisk normale. Homozygote mutante mus viste en gjennomsnittlig overlevelsesrate på 5% ved avvenningsalder, med de fleste dødsfall i løpet av de første 48 timene etter fødselen (Tabell 1). Den nøyaktige årsaken til neonatal dødelighet er ikke klart fordi de døde valpene ble kannibalisert før de kunne undersøkes, og lys mikroskopisk histologisk analyse av levende nyfødte homozygote mutanter ikke oppdage noen grov abnormitet. Voksne homozygote mutantmus virket normale, bortsett fra at de var omtrent 15% mindre enn deres villtype kullmates av samme kjønn (data ikke vist). Gjennomsnittlig levetid for de homozygote mutantmusene var imidlertid ca 6 måneder eller en femtedel av den normale levetiden. Obduksjon viste at blodkarbrudd var hovedårsaken til det forkortede livet til disse musene (Tabell 2). Bruddstedene var sporadiske og for det meste forbundet med store blodkar. Histokjemisk analyse ble utført for å finne defekten som forårsaket skjørheten i blodkarveggen. Fig. 2 A og B viser et tverrsnitt av normal abdominal aorta. Veggen av aorta består av intima og media (Fig. 2a, pil) og adventitia (Fig. 2 A og B, pilspisser). Mediet består av elastiske fibre(Fig. 2b, store piler) og glatte muskelceller (Fig. 2b, små piler) og gir elastisiteten til aorta mens adventitia omfatter det meste type i kollagenfibriller og begrenser dilatasjonen av aorta. Fig. 2C viser et tverrsnitt av en dissekerende aneurisme i abdominal aorta fra en homozygot mutant mus. Bruddet krysset media( pil), noe som førte til en blodfylt kanal (stjerne) mellom media og adventitia (pilehoder) og delvis kollapset lumen av aorta. Adventitia brøt til slutt andre steder, og blod lekket ut i bukhulen som det er tilfelle hos mennesker med dødelig aortaaneurisme (20). Det generelle arrangementet av elastiske fibre og glatte muskelceller (Fig. 2D) var lik den for kontrollene (Fig. 2B). Intensiteten og fordelingen av ekstracellulært matriksmateriale og mørkere flekker i adventitia og mellom elastiske fibre og glatte muskelceller i intima av mutante mus (Fig. 2D) var sammenlignbare med villtype kontroller (Fig. 2B). Ingen åpenbare mangler i hjerte og mellomstore og små arterier hos mutante dyr ble observert under lysmikroskopet (data ikke vist).

i tillegg til aneurisme viste mutantmus hyppig tarmforstørrelse og sporadisk tarmbrudd som resulterte i død (Tabell 2). Omtrent 60% av homozygote mutantmus viste hudlesjoner, hvorav de alvorligste ble presentert som et åpent sår av ≈1 cm lengde i skulderområdet, som helt penetrerte huden og eksponert subdermalt vev (Fig. 3). Sårene var ikke på grunn av kamp mellom dyr, siden de ble observert hos dyr i bur separat. Lysmikroskopisk analyse av hud, tarm og andre indre organer, inkludert lever og lunge, oppdaget ingen åpenbar abnormitet hos mutante dyr (data ikke vist).

for å definere strukturelle defekter i mutant dyr, elektronmikroskopiske analyser av aorta og hjerte ble utført. Fig. 4 viser at kollagenfibriller ligger mellom glatte muskelceller eller mellom glatte muskelceller og elastiske fibre (Fig. 4a, piler) var fraværende eller sterkt redusert i media av mutant aorta(Fig. 4b, piler). Mest slående, i adventitia hvor flertallet av kollagen er type i, var diameteren av kollagenfibriller av mutant aorta svært variabel (sammenlign Fig. 4 d Til C). Når fibrillene ble talt og diameteren av disse fibrillene målt i et gitt område av adventitia, fant vi at antall fibriller i mutanter ble redusert til omtrent en tredjedel av den av villtype, mens den gjennomsnittlige diameteren av fibrillene i mutanter var omtrent det dobbelte av villtype mus (Fig . 5). I likhet med aorta ble kollagenfibrillene mellom epikardium og myokard redusert eller manglet, og mikrovilli av epikardiet var underutviklet i hjertet av mutantmus (data ikke vist).

i tillegg til kardiovaskulærsystemet ble hud, tarm, lever og lunge av mutantmus undersøkt ved elektronmikroskopi. Som med adventitia av aorta, kollagen i fibriller i mutant hud (Fig. 4F, piler og pilspisser) var uorganisert og var svært variabel i diameter sammenlignet med de av villtype mus (Fig. 4e, piler). Denne endringen ble også sett i lever og lunge hos muterte mus (data ikke vist). Videre manglet kollagenfibriller eller sterkt redusert i submukosa og serosa av mutanttarmen (data ikke vist) som tyder på at kollagenfibriller i disse områdene hovedsakelig er type III kollagenfibriller.

Tidligere studier som introduserer målrettede mutasjoner I Col1a1 -, Col2a1 -, Col5a2-og Col9a1-gener har gitt viktig innsikt i funksjonen til disse kollagenene (24-27). Her viser vi at type III kollagen har en kritisk rolle i fibrillogenese, som er en viktig del av utviklingen av slike organer som kardiovaskulær system, tarm og hud. Mangel PÅ type III kollagen forstyrret fibrillogenese og resulterte i defekt utvikling og funksjonssvikt i disse organene. Under fysiologiske forhold er TYPE III kollagen ikke bare en viktig komponent av fibriller i vev som media av aorta, men også et viktig regulatorisk element i type i kollagenfibrillogenese. Våre resultater tyder på at type III kollagen regulerer diameteren av type i kollagenfibriller, som fungerer som en mekanisme for å møte de fysiologiske kravene til forskjellige vev eller av et vev på forskjellige utviklingsstadier. Fenotypen av type III kollagen mangelfulle mus ligner de kliniske manifestasjonene Av Ehlers-Danlos syndrom TYPE IV pasienter hvor døden skyldes blodkar eller tarmbrudd (20). Disse mutantmusene bør derfor vise seg å være gode dyremodeller for å forstå denne sykdommen og muligens teste terapeutiske tilnærminger.