(A)de seksuele levenscyclus van Chlamydomonas reinhardtii bestaat… / Download Wetenschappelijk Diagram

… de aard van de genetische stoffen die Mendel ‘ s wet trotseerden. Uitgebreide studies in de afgelopen eeuw, met behulp van tal van technieken, waaronder elektronenmicroscopie, genetica, moleculaire biologie en biochemie, hebben aangetoond dat de genetische stoffen in feite genomen binnen chloroplasten en mitochondriën zijn (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Chloroplasten (cp) en mitochondriën (mt) worden verondersteld te zijn ontstaan uit voorouderlijke endosymbiotische relaties tussen kerncellen en vrij levende bacteriën-cyanobacteriën en alfa – paarse bacteriën, respectievelijk. Ze bevatten hun eigen genomen, die vermoedelijk overblijfselen zijn van hun voorouders (Gray 1992). Vandaag, weten we dat CP en mt genen worden overgedragen aan het nageslacht uitsluitend van de moeder ouder in de diverse taxa van hogere planten, varens, mossen, algen (Kuroiwa 1991), schimmels (Mitchell en Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), en dieren (Hutchison et al. 1974), inclusief mensen. De uniparental overerving van CP/mt genomen werd lang gedacht om een passieve uitkomst te zijn gebaseerd op het feit dat eieren meerdere aantallen organellen bevatten, terwijl mannelijke gameten, op zijn best, slechts een paar bijdragen (Gyllensten et al. 1991). Nochtans, zal het proces van uniparental overerving waarschijnlijk dynamischer zijn. Een klassiek en opvallend voorbeeld zou het voorkomen van niet-Mendeliaanse overerving in de eencellige groene alg, Chlamydomonas reinhardtii , die gameten van identieke grootte produceert (Isogaam) (Sager 1954). De levenscyclus van C.reinhardtii is prachtig eenvoudig. Er zijn twee paringstypen van C. reinhardtii, paringstype plus (mt+) en paringstype minus (mt ), gecontroleerd door een enkele complexe paringstype loci op linkage groep VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii ondergaat een seksuele levenscyclus, die gedefinieerde stadia van differentiatie omvat (figuur 1). Vegetatieve cellen differentiëren zich in gameten onder omstandigheden van stikstofgebrek en lichtstraling (Pan et al. 1996). Binnen enkele minuten na het mengen hechten gameten van tegengestelde paringstypes zich aan elkaar door hun flagella en versmelten ze tot zygoten. Na een verplichte periode van rust, ondergaat de zygote meiose en ontkieming om vier haploïde nakomelingen te produceren. Meer dan 90% van de gevormde Nakomelingen erven chloroplast (cp) eigenschappen, bij voorkeur van de mt + ouder, een fenomeen dat meer dan 50 jaar geleden voor het eerst werd beschreven (Sager 1954). Sager beschreef de overerving patronen van twee UV-geïnduceerde mutaties, sr1 en sr2 . De sr1-mutatie geeft resistentie tegen lage niveaus van het antibioticum streptomycine, en de sr2-mutatie geeft resistentie tegen hoge niveaus van streptomycine. Wanneer sr1 werd gekruist naar een streptomycine gevoelige stam, werden lage niveaus van streptomycine resistentie geërfd, volgens Mendel ‘ s wet. Wanneer daarentegen een mt+ – ouder met de sr2-mutatie werd gekruist naar een gevoelige mt-ouder, waren alle meiotische Nakomelingen resistent tegen hoge niveaus van streptomycine. In het reciproque Kruis waren de meiotische Nakomelingen allemaal streptomycine gevoelig (Sager 1954). In 1962 kwam het bewijs voor het bestaan van cpDNA uit licht – en elektronenmicroscopisch werk van Ris en Plaut (ris en Plaut 1962). Slechts een jaar later beschreven Sager en Ishida de isolatie van cpDNA door cesiumchloride (CsCl) dichtheid gradiënt centrifugatie (Sager en Ishida 1963). In 1989, werd de verandering sr2 getoond om binnen het rps12 gen van het genoom van cp te lokaliseren (Liu et al. 1989). In 1972 toonde een biochemische studie aan dat de hoeveelheid mt – cpDNA daalde ten opzichte van mt + cpDNA, 6-24 uur na het paren (Sager en Lane 1972). DNA van mt + en mt-gametes werd geëtiketteerd met of 14 N – of 15 NH 4 Cl, en CSCL – de centrifugatie van de dichtheidsgradiënt werd gebruikt om het lot van nucleair DNA en cpDNA in 6 en 24 h zygotes te controleren. Zes uur na de ontwikkeling van zygote was het signaal dat mt – cpDNA vertegenwoordigde duidelijk lager dan mt+ cpDNA, wat wijst op een preferentiële vermindering van mt – cpDNA ten opzichte van mt+ cpDNA. In 1980 werd het eerste moleculaire bewijs voor de preferentiële vermindering van mt – cpDNA geleverd door Grant et al. (Grant et al. 1980). De auteurs controleerden het gedrag van mt+ en mt-cpDNA, gebruik makend van restriction fragment length polymorphisms (RFLPs), in een C. reinhardtii mutant stam ac-u-g-23 die twee kleine deleties in zijn chloroplast DNA draagt. De auteurs vonden dat zowel de schrappingen in cpDNA als het niet-fotosynthetische fenotype uniparentally geërfd waren. Het 203-kb chloroplast genoom van C. reinhardtii (Maul et al. 2002) is aanwezig bij ~ 80-100 kopieën per cel, en is georganiseerd in 5-10 DNA-eiwitcomplexen, die worden genoemd chloroplast nucleoïden (Kuroiwa et al. 1981). In 1982, Kuroiwa et al. gevonden dat DAPI (dsDNA specifieke fluorochroom, 4’,6-diamidino-2-phenylindol)-gekleurd mt-cp nucleoïden bij voorkeur verdwenen in jonge zygoten binnen 50 min van paring (Kuroiwa et al. 1982). In 1999, werd de preferentiële verdwijning van mt – CP nucleoïden waargenomen in een levende zygote, gebruikend SYBR Green I (dsDNA specifiek fluorochroom dat in levende cellen kan doordringen) (figuur 1) (Nishimura et al. 1999). De interpretatie van dit dramatische fenomeen, echter, was controversieel omdat de preferentiële verdwijning van fluorescerende mt – cp nucleoïden voorkwam ruim voordat DNA-reductie werd gedetecteerd door biochemische of moleculair biologische methoden (6-24 uur na paring) (Sager en Lane 1972). Er werden twee primaire mogelijkheden voorgesteld om dit te verklaren. Een mogelijkheid was dat de desintegratie van CP-nucleoïden zou kunnen leiden tot de verspreiding van cpDNA-moleculen, en de tweede mogelijkheid was dat de snelle vertering van cpDNA-moleculen zou kunnen leiden tot het verdwijnen van cpDNA-nucleoïden. Een probleem bij het aanpakken van deze vraag is dat de paringsreactie wordt uitgevoerd met behulp van miljoenen mt+ en mt – gameten (Figuur 2). De celpopulatie is onvermijdelijk een heterogeen mengsel van cellen, zoals ongemateerde mt+ en mt – gameten, zygoten met of zonder Mt-CP nucleoïden, en uitzonderlijke meitotic zygoten (1~5%) die geen meitotic zygoten vormen (ebersold 1967). Over het algemeen, vereisen de moleculaire en biochemische methodes grote hoeveelheden homogene steekproeven voor nauwkeurige analyses, en om het even welke heterogeniteit in de steekproeven zou de resultaten verwarren. Met andere woorden, de “persoonlijkheden” van individuele cellen of organellen binnen een bevolking zouden worden verdund en hoogstwaarschijnlijk verloren in het proces van analyses. Aan de andere kant, kan de microscopie de “persoonlijkheden” op morfologisch niveau onthullen, maar niet op moleculair niveau. Voor het bestuderen van de voorwaarde van cpdna molecules tijdens de verdwijning van Mt – CP nucleoids, was het noodzakelijk om zygotes te verzamelen die op de aanwezigheid of afwezigheid van Mt – CP nucleoids worden gebaseerd, en om de individuele zygotes te analyseren gebruikend moleculaire biologische technieken. Hiervoor werd een optisch pincet gebruikt (Figuur 3). Het gebruik van optische pincetten is een nieuwe techniek voor het manipuleren van levende cellen of organellen onder directe microscopische observatie (Ashkin et al. 1987). In deze studie, werd één enkele zygote met of zonder CP nucleoids verzameld gebruikend optisch pincet, en de aanwezigheid of afwezigheid van Mt – cpDNA molecules werd bepaald door geneste PCR analyse. Het individuele lot van mt + en mt – zygotische cpDNA werd afzonderlijk gevolgd gebruikend een chloroplasttransformant LO3c, die het bacteriële gen aadA (aminoglycoside adenyltransferase) herbergt. De enkele zygoten die werden verkregen met het optische pincet werden onderworpen aan zeer gevoelige geneste-PCR-analyse voor aadA (Figuur 4) (Nishimura et al. 1999). Toen l03c mt + – gameten werden gekruist met wild-type mt – gameten, werden aadA-gensequenties ontdekt in alle zygoten die werden onderzocht. Integendeel, toen de l03c mt-gameten gekruist werden met wild-type gameten, werden de Aada-sequenties alleen versterkt in jongere zygoten (10 en 30 minuten na zygote-vorming). Nadat de fluorescente mt-cp nucleoïden verdwenen, werden de Aada sequenties niet meer gedetecteerd in de zygoten (90 en 120 min na zygote vorming). Deze resultaten geven aan dat de Mt – cpDNA moleculen volledig verteerd worden in 10 min, waarbij de mt – CP nucleoïden verdwijnen, en ook dat ten minste één zeer effectieve nuclease geactiveerd wordt in de mt – chloroplast net na de vorming van zygote. Deze actieve spijsvertering van mt-cpDNA is waarschijnlijk de basis voor maternale overerving van cpDNA. Het eenvoudigste model voor de uniparental overerving van cpDNA is dat het proces bestaat uit twee verschillende gebeurtenissen die waarschijnlijk optreden in verschillende stadia van de levenscyclus: een “bescherming” van mt+ cpDNA, misschien tijdens gametogenese, en een “vernietiger” van onbeschermde mt – cpDNA tijdens vroege zygote ontwikkeling. A) Restriction –Methylation hypothese in 1972 stelden Sager en collega ‘ s voor dat mt – cpDNA werd verteerd door de werking van restrictie – enzymen, terwijl mt+ cpDNA werd beschermd door methylation-een model analoog aan het bacteriële restriction-methylation systeem (Sager and Lane 1972). Sager en collega ‘ s snel verzameld overtuigend bewijs dat een toename van de methylering niveau van mt+ cpDNA, die werd gedetecteerd 7 uur na paring (Burton et al. 1979; Royer en Sager 1979; Sano et al. 1980). Verder is de zuivering van mt+ gamete-specifieke DNA methyltransferases, met molecuulgewichten van 60 kDa en 20 kDa, gemeld (Sano et al. 1981). Deze mt + gamete specifieke methylatie gebeurtenis was blijkbaar omkeerbaar, zoals verwacht zou worden voor bescherming (Sano et al. 1984). Het gen voor de chloroplast-resident DNA methyltransferase werd uiteindelijk geïdentificeerd in 2002, en zijn mt + gamete-specifieke expressie en chloroplast lokalisatie werden bevestigd (Nishiyama et al. 2002). Anderzijds heeft een reeks documenten van onafhankelijke groepen vervolgens aangevoerd dat methylering van mt+ cpDNA de bescherming niet adequaat kan verklaren. Bolen et al. isoleerde een nucleaire mutant me1 die constitutief cpDNA methyleert op een hoger niveau in zowel mt+ als mt – cellen (Bolen et al. 1982). Wanneer me1 gameten werden gebruikt voor kruisen, normale uniparental overerving patronen werden waargenomen, inconsistent met de …