Alpha CETSA Kennisbank

• CETSA ®
• Target/Sample Types
• CETSA ® Assay Conditions
• Alpha CETSA® Immunoassays
• CETSA ® Data Analysis and Interpretation

Disclaimer: uitsluitend voor onderzoek. CETSA® is een geregistreerd handelsmerk van Pelago Bioscience AB. Houd er rekening mee dat een geldig CETSA® – abonnement vereist is voor het gebruik van de kit.

de CETSA ® – methode zelf

Q: Wat is CETSA®?

A : De cellulaire thermische verschuiving analyse is een methode die de kwantificering van het doel Engagement van een samenstelling (te) binnen levende cellen of in verstoorde cellen toestaat. Het CETSA ® – testprincipe is gebaseerd op de verandering in het thermische denaturatieprofiel van het doeleiwit dat optreedt na de binding van een verbinding. De CETSA ® – test wordt uitgevoerd door de cellen te incuberen met de testverbinding, gevolgd door verhitting van de met de verbinding behandelde cellen en vervolgens door het resterende oplosbare doeleiwit te meten.

Q: Wat is thermische verschuiving

A: Bij het verwarmen zal een eiwit een temperatuur tegenkomen waarbij het denatureert (soms aangeduid als het smeltpunt). Deze smelttemperatuur is een fysische eigenschap en een constante voor een bepaalde reeks voorwaarden (pH, druk, zouten). De samenstellingen die met een proteã ne in wisselwerking staan zullen de smelttemperatuur (thermische verschuiving) veranderen. Voor een bepaalde bindingsplaats binnen een proteã ne kan de grootte van de thermische verschuiving bij verschillende samenstellingsconcentraties (dosis-respons) worden gemeten, en de EC50-waarden die van dergelijke krommen worden afgeleid kunnen worden gebruikt om een rangorde van sterkte van een reeks samenstellingen vast te stellen, die direct met de rangorde van affiniteit van de samenstellingen correleert . Er zijn verschillende variaties op de in vitro Thermal Shift assay, maar de belangrijkste techniek werd voor het eerst beschreven door Semisotnov et al. (1991). In deze methode, onthult het smelten en het ontvouwen proteã ne hydrophobic oppervlakken die SYPRO sinaasappel toelaten om te binden. De fluorescentie van deze kleurstoffen wordt gedoofd in water, zodat keert de band aan deze hydrophobic oppervlakken dit om en veroorzaakt fluorescentie aan piek wanneer de proteã ne volledig wordt ontvouwd. Dit type van thermische verschuiving analyse kan slechts op hoogst gezuiverde proteã nen worden toegepast en voor lage overvloed species dit kan betekenen dat een over uitdrukkingssysteem wordt vereist om voldoende hoeveelheden te produceren.

thermofluor-temperatuurgevoelig kleurstofsysteem (met Sypro Orange)

Differential scanning fluorimetry (DSF) – alternatieve op kleurstof gebaseerde methoden

Quantitive PCR-systemen (bijv. Roche Light cycler) : deze worden gebruikt om het verwarmingsgebeurtenis te leveren en kunnen fluorescentieveranderingen

meten Nanotemper-is een bedrijf dat speciaal instrument produceert dat het monster verwarmt en de fluorescentie meet. Het biedt betere prestaties dan de aangepaste PCR-systemen.

V: Waarom is het meten van streefdoelen belangrijk?

A: als er geen bevestiging is dat een verbinding inderdaad samenwerkt met het gewenste doel, kunnen drugontwikkelaars kostbare tijd en middelen verliezen om de verkeerde richting op te gaan. Om die reden, is de bevestiging van het Doelbetrokkenheid van een samenstelling lange tijd beschouwd als essentieel in drugontdekking. Dergelijke analyses laten directe vergelijkingen van de affiniteit van een samenstelling voor zijn te maken doel toe, als zodanig is het een essentiële maatregel om te selecteren welke samenstellingen bij alle stadia van loodgeneratie en optimalisatie te bevorderen. Omdat de Doelbetrokkenheid aan affiniteit kan worden gecorreleerd stelt het onderzoekers in staat om samenstellingen te selecteren die de hoogste affiniteitswaarden hebben. Als zodanig is het een uiterst nuttige maatregel om de correcte samenstellingsprioritering in elk stadium van het proces van de drugontdekking te verzekeren.

Q: Hoe verschilt CETSA® van andere technologieën voor thermische Shift-assay?

A: naast CETSA ® zijn er tal van methoden om de betrokkenheid van de doelwitten te beoordelen (bv. Plasmonresonantie aan het oppervlak, Fluorescentiepolarisatie en thermische verschuiving). Nochtans baseren al deze methodes zich op gezuiverde proteã ne die beschikbaar zijn en kunnen slechts in vitro worden toegepast, betekenend kunnen de afgeleide affiniteitswaarden van daadwerkelijke affiniteit of bindend potentieel in levende cellen niet voorspellend zijn. Het kunnen uitvoeren van thermische Shift analyses in een relevante cellulaire context, waar de proteã ne in zijn inheemse omgeving, in aanwezigheid van zijn natuurlijke partnerproteã nen, met fysiologische concentraties van zijn cofactoren en substraten is, levert veel relevantere gegevens op, die beter in dierlijke modellen en klinische proeven zullen vertalen.

hoewel de cellulaire thermische Shift-test een methode is die gebaseerd is op hetzelfde biofysische principe als standaard thermische shift-assays (d.w.z. dat specifieke eiwitten denatureren bij een bepaalde temperatuur), meet deze methode niet direct de specifieke temperatuur van het ontvouwen, maar berust in plaats daarvan op het feit dat de aanwezigheid van een verbinding op het eiwit de hoeveelheid oplosbare eiwitten die aanwezig is na verhitting tot een bepaalde temperatuur beïnvloedt. Als zodanig is CETSA® in essentie een totale eiwittest uitgevoerd na een specifieke verhittingsgebeurtenis. De samenstellingen met verschillende potenties van de doelbetrokkenheid zullen de relatieve hoeveelheden proteã ne die de het verwarmen gebeurtenis overleven veranderen. Omdat de test dit resterende eiwit meet, in plaats van het werkelijke smeltgebeurtenis, kan het worden toegepast op complexere in vivo systemen zoals cellen en lysaten (en in sommige CETSA® formaten zelfs vast weefsel). Bovendien kan CETSA® verbindingen identificeren die een eiwit destabiliseren (d.w.z. de smelttemperatuur Verlagen), Dit is minder eenvoudig met de andere thermische verschuivingsmethoden.

Q: Hoe verschilt Alpha CETSA® van andere cellulaire Thermal Shift assay-technologieën of andere cellulaire target Engagement Assays?

A: zoals hierboven vermeld, is CETSA ® in principe een totale eiwittest uitgevoerd na hitteschok. Alpha CETSA® maakt gebruik van een dual antilichaam proximity gebaseerd detectiesysteem. Andere methodes vermijden het gebruik van een antilichaam gebaseerd systeem door de doelproteã ne te wijzigen:

• Promega nanoluciferase thermal shift assay (NaLTSA): Nanoluc Luciferase gesmolten aan het doelproteïne (recombinantly uitgedrukt eiwit); Wanneer het eiwitdoel met de nanoluc-enzymmarkering aggregaten, zal het luciferasesignaal afnemen.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : Luciferase Fusion Tag gecombineerd met geëtiketteerde tracerverbindingen die, in de nabijheid van luciferase, zullen leiden tot bioluminescentie resonantie energie Transfer (BRET). Het binden van de verbinding in dezelfde zak zal de tracer verplaatsen en het BRET-signaal zal afnemen. Dit is geen hitteschok methode.
• DiscoverX InCELL Pulse: gebaseerd op EFC-technologie (Enzyme Fragment Complementation) : het doelproteã ne wordt gesmolten met een klein fragment van de enzymdonor van β-galactosidase (β-gal). Een toegevoegde verslaggeversproteã ne zal aan dit fragment binden om een actief enzym opnieuw samen te stellen, dat een substraat zal hydrolyseren en een chemiluminescent signaal zal produceren dat eiwitabundantie kwantificering toestaat. Na hitte denaturatie, zal de proteã ne de toegang van de grotere luciferasecomponent aan zijn partner op het eiwitdoel samenvoegen en beperken.

het belangrijkste verschil tussen deze “recombinant CETSA®” – of “recombinant target engagement” – systemen en Alpha CETSA® is dat ze niet kunnen worden toegepast op inheemse en ongewijzigde cellen. Dit heeft een aantal negatieve gevolgen:

1. hoewel de kosten van het ontwikkelen van een nieuw antilichaampaar en de daaropvolgende kosten per boorput hoger kunnen zijn dan alleen het transfecteren van een enkele cellijn, is het waarschijnlijk dat elk discovery-programma met een verscheidenheid aan modelcellijnen zal willen worden getest, elke transfectie heeft zijn eigen kosten en het klonen van de volgende cellijnen zal extra weken in beslag nemen.
2. het genereren van een gelabeld eiwit zal altijd fysiologische gevolgen hebben voor de cel en het gelabeld eiwit kan (I) overexpressie vertonen (verkeerde stoichiometrie vs. partners), (ii) niet in het juiste cellulaire compartiment of (iii) niet geassocieerd met belangrijke partnereiwitten en (iv) kan een ander smeltgedrag hebben dan het inheemse eiwit. Betekenend dat het schijnbare effect van een samenstelling zijn echte gedrag in het weefsel van de patiënt niet kan weerspiegelen. Deze problemen kunnen worden vergroot in een tijdelijke transfectiesysteem.
3. Luciferaseremmers kunnen resulteren in vals-positieve treffers.
4. in latere stadia van loodoptimalisatie wanneer complexere en fysiologisch relevantere cellulaire modellen (primaire, inheemse cellijnen en weefsel) nodig zijn, zijn geëtiketteerde eiwitbenaderingen eenvoudigweg niet van toepassing.

Q: Welke informatie levert een CETSA® – test op?

a: CETSA® geeft een unieke maat voor A-verbindingen ‘op de aanwezigheid van het doel’ en kan worden beschouwd als de bezetting van het doel. Deze bezetting zal door zowel de samenstellingscapaciteit worden beà nvloed om het doel en de capaciteit van de samenstelling in dienst te nemen om bij de juiste plaats (d.w.z. heeft het de juiste oplosbaarheid, permeabiliteit, metabole stabiliteit en beschikbaarheid in het juiste cellulaire compartiment). De niet cellulaire analyses van de Doelbetrokkenheid bieden maatregelen van affiniteit aan die slechts met het gedrag van de proteã ne in hoogst kunstmatige milieu ‘ s correleren vaak gebruikend gezuiverde recombinantly uitgedrukte doelproteã nen.

Q: Kan CETSA® worden gebruikt voor SAR-analysestudies?

A: Er zijn nog geen gepubliceerde voorbeelden waarin CETSA® is gebruikt voor samengestelde optimalisatie. Het potentieel en de toepasbaarheid van CETSA® voor SAR-analyse en hit-bevestiging werden echter duidelijk aangetoond door Shaw et al. door vergelijking van gegevens uit de CETSA ® – assay met veelgebruikte biochemische en celgebaseerde assaygegevens (Shaw et al. 2018 SLAS Discovery 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). De publicatie toont de toegevoegde waarde aan van CETSA® voor screening, hit-bevestiging en SAR-generatie voor twee eiwitdoelen: B-Raf en PARP1.

Target / Sample Types

Q: hoeveel targets zijn tot nu toe gevalideerd in CETSA®?

A: In CETSA ® HT (de meeste Alpha CETSA® , sommige met behulp van HTRF) zijn meer dan 30 doelen met succes gevalideerd, waaronder doelen met nucleaire, mitochondriale, cytoplasmatische en plasma membraanlokalisatie.

meer dan 100 doelen zijn tot nu toe gevalideerd in CETSA® Classic (Western Blot gebaseerde detectie).

CETSA ® M / S genereert informatie voor 6000 tot 7000 doelen tegelijk.

Q: Kunnen alle doeleiwitten in CETSA®worden getest?

R: sommige doelen zijn “blind” in CETSA®, d.w.z. de verbinding zal hun thermische stabiliteit niet veranderen. Dit kan gebeuren wanneer de proteã ne veelvoudige domeinen heeft, en de samenstelling aan één domein slechts bindt, en als de stabilisatie van dit enige domein niet globaal de thermische stabiliteit van de gehele proteã ne beà nvloedt. Er zijn een paar eiwitten die niet smelten in het typische temperatuurbereik toegepast in CETSA ® experimenten.

Pelago heeft toegang tot een grote database met gegevens over de thermische stabiliteit van projecten met massaspectrometrische uitlezing (CETSA® MS), en met deze informatie wordt rekening gehouden wanneer Pelago de “CETSA® bility” van een eiwitdoel beoordeelt alvorens een Alpha CETSA® assay te ontwikkelen. Neem contact op met Pelago om dergelijke informatie aan te vragen.

V : zijn GPCR ‘ s geschikt voor CETSA® ?

A: enkele voorbeelden van GPCR ‘ s zijn getest in CETSA® . In een recente publicatie van Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019) werden CETSA® Classics-assays vastgesteld voor een reeks membraangebonden eiwitten, waaronder een GPCR-eiwitdoel. Een mogelijke uitdaging met CETSA® op GPCR ‘ s kan de beperkte beschikbaarheid van antilichamen voor detectie zijn. Bovendien kan de integrale membraanlokalisatie van de GPRCs leiden tot onvoorspelbaar smeltgedrag.

Q: Welk type monsters kan in CETSA®worden getest?

A : Er zijn voorbeelden van CETSA ® assays met behulp van vele verschillende soorten matrices waaronder vereeuwigde cellijnen, primaire cellen, iPS cellen, patiënt-afgeleide PBMC ‘ s, sferoïden, nucleaire fracties van gekweekte cellen, ex-vivo behandeld weefsel, weefsels van in vivo dierstudies, bacteriën, gist, zebravis en insecten.

Q : Kunnen de monsters na het verhitten worden ingevroren?

A: Dit is mogelijk, maar dit vereist een validatie van geval tot geval omdat het vriesproces sommige eiwitten kan denatureren.

Q: Mijn cellen hebben een kweekplaatcoating nodig met enkele eiwitten (bijv. collageen of Matrigel); is speciale zorg nodig om monstervoorbereiding te voorkomen?

A: we hebben geen problemen ondervonden met cellen gekweekt op gecoate platen.

CETSA ® Assay Conditions

Q: Wat zijn de typische optimalisatiepunten van de Alpha CETSA ® assay?

A: als de immunoassay vanaf nul begint, moet deze eerst worden ontwikkeld en geoptimaliseerd. Het is belangrijk en de moeite waard om te investeren in de ontwikkeling van een zeer gevoelige Alfa-assay, omdat het zal toelaten om het aantal cellen per put nodig in de CETSA® assay te verminderen. Omdat de CETSA ® – assay een deel van het eiwit vernietigt dat moet worden gedetecteerd, zijn doorgaans meer cellen/put nodig in een CETSA®-assay in vergelijking met andere op cellen gebaseerde assays. Raadpleeg de PerkinElmer guides for alpha assay development voor hoe verder te gaan en voor nuttige tips, en de CETSA® Toolbox Handleidingen bij gebruik van de Toolbox (anti mouse IG X anti rabbit IG beads) aanpak.

dan omvatten de optimalisatiepunten van de CETSA® – assay:

• Cel dichtheid titratie
• Selectie van cell lysis buffer
• Incubatie tijd van de cellen met de teststof
• Temperatuur voor de incubatie van cellen met de teststof
• Oprichting van smelt-en shift-curves
• Selectie van de temperatuur voor isotherme dosis-respons experimenten
• Workflow en automatisering instellingen

Q: Waarom zijn er verschillende CETSA® cell lysis buffers aanwezig en wat is de impact van het gebruik van verschillende cell lysis buffers?

A: De lysisbuffer is belangrijk betreffende verscheidene aspecten van de analyse. Zijn rol is veelvoudig: lysing de cellen en potentieel vrij de doelproteã ne van partnerproteã nen die in antilichaamherkenning kunnen interfereren, om het doel voor opsporing door de antilichamen beschikbaar te maken; het stabiliseren van de doelproteã ne om de analyse stabiel te maken; het vermijden of het minimaliseren van potentieel epiturbanceeffect; de juiste fysisch-chemische condities (pH, Ionische sterkte en aard van zouten, detergent type en concentratie, … ) voor de immunoassay, … omdat verschillende immunoassays verschillende optimale condities kunnen hebben, en omdat verschillende eiwit targets, en verschillende celtypes verschillende eisen kunnen hebben voor optimale assay prestaties, maken we 5 verschillende cell lysis buffers beschikbaar. Deze verstrekken een verscheidenheid van de voorwaarden van de cellysis. Dit betekent echter niet dat in specifieke gevallen aanvullende componenten, zoals extra soorten detergenten, mogen worden toegevoegd om de verdere testprestaties te verbeteren.

V: zitten er proteaseremmers in de CETSA ® – cell lysis-buffers?

a: CETSA ® Cell Lysis buffers 1, 4 en 5 bevatten enkele divalente kationenchelatoren, die naar verwachting proteasen remmen die dergelijke divalente kationen voor hun activiteit vereisen (bijvoorbeeld Matrixmetalloproteïnasen). Daarnaast zijn er geen andere proteaseremmers opgenomen in de CETSA® cell lysis buffers, aangezien deze over het algemeen niet nodig zijn voor het uitvoeren van Alpha CETSA® assays. Nochtans voor specifieke celtypes of weefselsteekproeven, kunt u typische proteinaseinhibitors, zoals leupeptin willen toevoegen.

Q: Wat zijn de typische smelttemperaturen?

A: de smelttemperatuur (TM) wordt gedefinieerd als de temperatuur waarbij de helft van de doeleiwitpopulatie is gedenatureerd (d.w.z. in Alfa CETSA® waarbij de helft van het Alfasignaal verloren is gegaan). Afhankelijk van het doel, is het smelten temperaturen het vaakst tussen 40°C en 60°C, met een gemiddelde het smelten temperatuur van 52°C. Sommige proteã nen, zoals membraan geassocieerde proteã nen, zijn gewoonlijk stabieler en kunnen een hogere het smelten temperatuur hebben. CETSA ® – testgegevens voor eiwitten met een smelttemperatuur hoger dan 65°C kunnen worden beïnvloed door het feit dat de membraanpermeabiliteit en de celintegriteit worden verstoord wanneer cellen worden verhit, waardoor de fysiologische betekenis van de test wordt beïnvloed.

in onze ervaring is de smelttemperatuur doelspecifiek en afhankelijk van de assaymatrix en de gebruikte lysis-buffer.

Q: wordt verwacht dat de Tm hetzelfde is bij het werken met intacte en verstoorde cellen?

A: niet noodzakelijk, zoals bij het verstoren van cellen, kunnen eiwit-eiwitinteracties die eiwitten stabiliseren verloren gaan, wat kan leiden tot een veranderde smelttemperatuur in vergelijking met intacte cellen. Zie voor een voorbeeld de Alpha CETSA ® MEK1 testgegevens.

Q: Welke verwarmingstemperatuur moet Ik kiezen voor samengestelde tests?

A: Voor het stabiliseren van verbindingen wordt aanbevolen om de laagste temperatuur met het grootste testvenster te selecteren, omdat wordt verwacht dat de meest gevoelige test (lagere EC50-waarden) wordt gegeven. Voor destabiliserende verbindingen wordt aanbevolen om de hoogste temperatuur te selecteren met het grootste testvenster. Temperaturen boven 65°C kunnen een invloed hebben op de cellulaire permeabiliteit en de Betekenis van de gegevens verminderen.

V: moet ik dezelfde smelttemperatuur verwachten in CETSA® Classic (Western Blot) en Alpha CETSA®?

A: niet noodzakelijk: de schijnbare smelttemperatuur kan tussen beide methoden variëren, omdat de detectiemethoden verschillend zijn.

Q: Is het belangrijk dat de verwarmingstijden van het monster strikt worden gecontroleerd?

A: Ja Dit is uiterst belangrijk om te controleren, aangezien langere verwarmingstijden kunnen leiden tot een juiste verschuiving van de dosis-responscurve (zie hieronder de opmerkingen over de verblijftijd). De standaard verwarmingstijd is 3 minuten.

verbindingen met een korte verblijftijd (d.w.z. hoge dissociatiesnelheidsconstante koff; verblijftijd T gelijk aan 1 / koff) zal sneller van het doel scheiden wanneer het wordt verwarmd, vergeleken met verbindingen die een lange verblijftijd hebben. Om die reden zal de EC50, of ITDRF50 waarde naar verwachting toenemen met toenemende verwarmingstijden. Voor meer uitleg over de CETSA® theorie zie Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Quantitative Interpretation of Intracellular Drug Binding and Kinetics Using the Cellular Thermal Shift Assay. Biochemistry 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. In theorie zou detectie van verschillende samenstellingen verblijfstijden op het doel, door variërende verwarmingstijd mogelijk zijn, maar er zijn nog geen gepubliceerde rapporten beschikbaar over dit gedaan.

V: in de handleiding wordt aanbevolen om op ijs te koelen of gedurende 3 minuten bij 25°C na de hitteschok. Is deze koelstap belangrijk en is het belangrijk om een strikte controle te hebben over de koeltijd?

A: door het snel koelen van het monster wordt ervoor gezorgd dat de hitteschok-fase goed onder controle is. Het gewoon toestaan van de temperaturen om te koelen zonder hulp zou zeker produceren verschillende koelsnelheden in verschillende putten en invloed op de hoeveelheid warmte schok geleverd aan het systeem. De koelfase is niet zo kritisch als de verwarmingsfase, maar moet snel en consistent worden uitgevoerd.

Q: Mag Ik PerkinElmer “Biomarker” en “SureFire” (non-CETSA® ) kits gebruiken om een CETSA® – test uit te voeren?

A: in theorie kan elke totale eiwittest geschikt zijn voor gebruik in een CETSA® – protocol, hoewel elk systeem moet worden geoptimaliseerd en gevalideerd. De CETSA ® – methode is echter gepatenteerd en er is toestemming nodig van Pelago Bioscience. Bovendien wordt alleen het gebruik van de aangewezen doelkits door PerkinElmer ondersteund. Het gebruik van de gereedschapskist wordt ondersteund door Pelago Bioscience en is alleen beschikbaar voor licentiehouders.

Q: Is het mogelijk om het Alfasignaal rechtstreeks af te lezen van de PCR-plaat die wordt gebruikt om de monsters te verwarmen?

R: Dit zou voordelen opleveren in termen van aantal pipetteerstappen, monsterverbruik en gemak van automatisering, maar de mogelijkheid om PCR – platen te gebruiken voor het volledige proces – van monsterbehandeling tot detectie-is nog niet aangetoond. PCR-platen zijn vaak zeer flexibel, wat leidt tot een niet-uniform signaal over de plaat, of hebben niet de juiste afmetingen om ze te kunnen hanteren door plaatlezers. Well-to-well cross-talk kan ook een probleem zijn in dergelijke PCR-platen.

Q: Kan chemische denaturatie (bv. met ureum of guanidine) worden gebruikt in plaats van warmte?

A: Het voordeel van het gebruik van temperatuur om de hitteschok te leveren is dat het wordt gedaan op een zeer gecontroleerde manier die waarschijnlijk constant tussen de monsters, en beperkt over een goed gecontroleerde tijdsbestek. Een chemisch denaturatieproces zou in een gezuiverd eiwituittreksel kunnen werken; maar in het complexe cellulaire milieu, zullen de variatie in celvolume, het bufferen vermogen, lipideninhoud enz.allen waarschijnlijk betekenen dat de verschillende cellenlijnen verschillende denaturatiekenmerken voor om het even welke bepaalde proteã ne tonen.

aangezien denaturatie (verhittingstijd) van cruciaal belang is, kan dit bij chemische denaturatie vrij moeilijk te controleren zijn. Bovendien kan warmte worden toegepast zonder cellen te verstoren, waardoor het mogelijk is om te testen in echte cellulaire context. Dit zou niet het geval van chemische denaturatie zijn, aangezien de cellen zouden moeten worden verstoord om doeltoegang tot de denaturerende agent toe te staan, daarom verliezend intracellular concentraties, eiwitassociaties enz.. Daarom raden we niet aan om de hitteschok te vervangen door chemische denaturatie.

Alfa CETSA ® – Immunoassay

Q: Heb ik bij het ontwikkelen van een CETSA® – test monoklonale antilichamen nodig of kunnen polyklonale antilichamen ook worden gebruikt?

A: zowel monoklonale als polyklonale antilichamen kunnen worden gebruikt, uiteraard afhankelijk van de kwaliteit van de antilichamen. Monoclonal antilichamen presenteren een voordeel in termen van stabiele reagenslevering, zoals voor om het even welke andere opsporingsmethode gebruikend antilichamen.

V: zal de volgende partij bij het gebruik van polyclonale antilichamen in een CETSA® – test op dezelfde manier werken?

A: In onze ervaring hebben we nooit te maken gehad met een situatie waarin de volgende partij van een polyklonaal antilichaam zich in de CETSA® – test anders gedroeg dan de vorige partijen. De CETSA ® – test moet echter opnieuw worden gevalideerd met de volgende partij polyclonal antilichaam.

Q: Zijn er andere aanbevelingen voor antilichaamselectie?

A: indien beschikbaar, moeten antilichamen worden geselecteerd zodat ze verschillende epitopen van het doeleiwit bestrijken, om de kans te maximaliseren om een geschikt antilichaampaar te vinden dat werkt in de Alpha CETSA® – test.

Antilichaamparen die steilere bochten (hogere helling) en minder achtergrond opleveren, hebben de voorkeur omdat zij gewoonlijk een specifieker signaal geven. De lage helling van de heuvel kan het teken van de capaciteit van een antilichamenpaar zijn om de opnieuw gevouwen proteã ne te erkennen.

Q: Zijn de Alfa CETSA® antilichamen tegen het endogene doeleiwit alleen of het endogene doeleiwit plus gebonden kleine molecuul?

A: op basis van de tot nu toe ontwikkelde kits zijn de antilichamen alleen tegen het eiwitdoel.

Q: Kan Ik verwachten dat de affiniteiten van detectieantilichamen verschillen tussen gebonden en ongebonden kleine molecule aan doelproteã ne?

A: kleine moleculen die het vouwen van eiwitten op epitoopplaatsen beïnvloeden, lopen inderdaad het risico de antilichaambinding te veranderen. Dit fenomeen wordt “epiturbance” genoemd en kan een beperking van op antilichamen gebaseerde CETSA® zijn . Epiturbance wordt in het algemeen niet waargenomen in het CETSA® Classic assay-formaat (Western Blotting), omdat het eiwit in dit geval volledig gedenatureerd is voordat de antilichaamdetectiestap wordt uitgevoerd.

Q: Kan alleen IgG worden gebruikt met de CETSA ® toolbox kits?

A: Inderdaad, de antilichamen op de anti-konijn en anti-muis parels zijn specifiek voor IgG, en zouden andere antilichaamklassen niet herkennen (d.w.z. IgA, IgM, enz.zouden niet moeten worden geselecteerd).

Q: Is er een voordeel bij het gebruik van Alpha CETSA® in vergelijking met CETSA® Classic (Western Blotting)?

A: naast een grotere gevoeligheid van de Alpha CETSA® – assay en doorvoer-en automatiseringsoverwegingen, kan Alpha CETSA®, vanwege de mogelijke moeilijkheden bij het analyseren van membraaneiwitten in de CETSA® Classic-methode, beter presteren voor dergelijke targets, aangezien er geen separatiestappen nodig zijn.

CETSA ® Data analyse en interpretatie

Q: Welke vals-positieve treffers kunnen worden verkregen in CETSA®?

A: de thermische stabiliteit van sommige eiwitten kan na een samengestelde behandeling worden beïnvloed, ook al zijn ze niet direct gebonden aan de teststof. Dit indirecte effect kan het resultaat zijn van bijvoorbeeld eiwitfosforylatie, eiwitwerving door een partnerproteã ne, of van algemene verandering van de redoxstaat van de cel. Het parallel uitvoeren van de CETSA® – test op intacte cellen en op verstoorde cellen kan onderscheid maken tussen directe en indirecte effecten, aangezien dergelijke indirecte effecten niet worden verwacht wanneer de cellen worden verstoord en de metabole processen worden gestopt.

bij Alpha CETSA® kan een interferentie voor de bepaling van de samenstelling worden waargenomen, aangezien de verbindingen in de detectiestap bij een relatief hoge concentratie aanwezig zijn. Dit kan misleidende resultaten geven en het is belangrijk om een tegenscherm uit te voeren om deze samenstellingen te identificeren.

V: Hoe kan doeldestabilisatie worden geïnterpreteerd?

A: Destabilisatie kan het gevolg zijn van de verstoring door de samengestelde binding van een eiwitcomplex dat de doelproteã ne stabiliseerde. In onze ervaring, membraaneiwitten hebben meestal een hogere smelttemperatuur en zijn eerder gedestabiliseerd dan gestabiliseerd door samengestelde binding. Voor kinasen kan het ook het gevolg zijn van de verplaatsing van ATP. In dat geval kan het nuttig zijn het resultaat van CETSA® – tests te vergelijken wanneer deze worden uitgevoerd op intacte cellen (fysiologische ATP-concentraties) en verstoorde cellen (verlies van ATP). Voor sommige doelen (zie de ErbB2 Alpha CETSA® kit manual) hebben we gezien dat irreversibele remmers het doel destabiliseerden terwijl een reversibele remmer het doel stabiliseerde.

Q: Is er een manier om epiturbance-effect te vermijden?

A: Het toevoegen van een kleine hoeveelheid detergent, zoals 0,01% SDS, kan het fenomeen epiturbance voorkomen. Een verklaring zou kunnen zijn dat SDS toegang tot het antilichaam zelfs in aanwezigheid van de samenstelling verstrekt. Sommige CETSA ® cellysis-buffers bevatten een kleine hoeveelheid SDS en kunnen daarom epiturbance ten opzichte van andere lysis-buffers vermijden. We kunnen niet uitsluiten dat in sommige gevallen meer SDS moeten worden toegevoegd.

opgemerkt moet worden dat een dergelijk epiturbance-effect niet beperkt is tot CETSA® – tests, maar ook kan worden aangetroffen in elke immunoassay.

Q: Counter-screen / Hoe controleer ik of mijn CETSA® – treffer vals-positief is?

A: in CETSA® bestaat een eenvoudige methode om te bepalen of de verbinding inwerkt op de stabilisatie van het doeleiwit (de)zelf, of interfereert met de detectiemethode: een vergelijking kan worden gemaakt tussen (1) toevoeging van de verbindingen aan de cellen, dan incuberen en het doen van de warmtebehandeling en (2) het verwarmen van de cellen eerst en het toevoegen van de verbinding pas na. Als de samengestelde activiteit alleen in test 1 wordt gevonden, dan is het echt actief op het doel. Als de samengestelde activiteit in 1 en 2 wordt gevonden, dan toont het aan dat het op de een of andere manier met de opsporingstechnologie interfereert (zie de PerkinElmer eiwit-Eiwitinteractiegids voor een lijst van potentiële alpha interferenties).

Q: Welke vals-negatieve treffers kunnen worden verkregen in CETSA®?

A: Als een verbinding het doel in een cellulaire context niet bereikt, kan het als positief in biochemische assays verschijnen, en nog steeds negatief in CETSA® . Dit is geen vals negatief, maar enkel die het feit weerspiegelen dat de samenstelling niet in staat is om tot het doel onder echte cellulaire voorwaarden toegang te hebben, die deel van de kracht van de methode uitmaken.

Q: Hoe verhouden CETSA® – waarden zich tot functionele assays / is er een Betekenis van de amplitude van de thermoshift?

A: Bij het analyseren van CETSA ® – gegevens moet men in gedachten houden dat het principe van de assay heel anders is dan typische functionele assays, zoals kijken naar eiwitfosforylatie, ionconcentraties, cAMP en andere signaaltransductiemarkers, of fenotypische analyse in high content screening, en daarom moeten de gegevens dienovereenkomstig worden geïnterpreteerd.

de amplitude van de thermoshift is geen maat voor de samengestelde affiniteit.

de EC50-of ITDRF50-waarden zijn specifiek voor bepaalde testomstandigheden (temperatuur, verwarmingstijd, …). Dit verschilt niet van functionele analyses, waarbij EC50-waarden bijvoorbeeld specifiek zijn voor stimulatietijden.

Q: Is het mogelijk om antagonisten Versus agonisten te onderscheiden in CETSA ® – tests?

A: normaal gesproken is dit geen informatie die wordt geëxtraheerd uit CETSA® – assays, maar de publicatie van Shaw et al. (2018) Scientific REPORTS / (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. rapporten dat alleen agonisten in staat waren om de androgeenreceptor in de CETSA® assay te stabiliseren, terwijl antagonist geen direct effect had in de CETSA® assay, maar kon worden gedetecteerd als concurrenten van het effect van agonisten in de CETSA® assay. Daarom kon de CETSA® – test in dit specifieke geval onderscheid maken tussen androgeenreceptoragonisten en antagonisten. Dit betekent niet dat dit voor enig doel mogelijk is, aangezien er talrijke voorbeelden zijn waarbij de CETSA® – test zowel agonisten als antagonisten direct detecteert.

Q: Kan CETSA® worden gebruikt om toxiciteit van een verbinding op te sporen?

a: verbindingen die enig toxisch effect op een cel hebben, zullen naar verwachting leiden tot verandering in het gehalte van sommige eiwitten (via afbraak en/of transcriptionele Effecten) en tot veranderingen in de thermostabiliteit van sommige eiwitten (via post-translationele modificaties of algemene verandering van de redoxtoestand van de cellen). Pelago onderzoekt de mogelijkheid om op basis van CETSA® MS-gegevens “CETSA® vingerafdrukken” te genereren die kunnen worden gekoppeld aan verschillende soorten toxiciteit. Dit kan ook kennis genereren van de doelstellingen die drugs niet zouden moeten raken om dergelijke toxiciteit te voorkomen. Als een specifiek doel verband lijkt te houden met toxiciteit, Kan het gebruik van Alpha CETSA® een keuze worden voor de farmaceutische industrie.

Q: Kan een huishoudeiwit worden gebruikt voor de normalisatie van CETSA® – assays?

A: normalisatie is doorgaans niet nodig in CETSA ® – tests, aangezien de belangrijke output van de test de EC50-waarde is. In sommige gevallen, bijvoorbeeld bij het werken met weefselmonsters, kan de hoeveelheid materiaal die per datapoint wordt gebruikt echter aanzienlijk variëren en kan normalisatie dan gewenst zijn. In CETSA® Classic (Western blotting) wordt SOD1 vaak gebruikt omdat het smeltpunt van 80°C het een goede onveranderlijke referentie maakt voor elk doelwit, en omdat het molecuulgewicht van 18 kDa het gemakkelijk maakt om op Western blots te detecteren. GAPDH zou niet worden aanbevolen vanwege de lagere smelttemperatuur (55 °C), waardoor het geen mogelijke controle is voor doelen met een hogere smelttemperatuur.

indien men de Alpha CETSA® – test wil normaliseren, kan cofiline worden geprobeerd (er is een AlphaLISA SureFire ultra-kit voor totaal cofiline, met voorlopige CETSA® – gegevens maar nog geen volledig gevalideerde kit)