Antilichaam targeting van claudin-1 als een potentieel colorectale kanker therapie

CRC monsters

Voor gen-expressie profilering, hebben wij gekozen voor 143 tumor monsters van 143 patiënten opgenomen in drie cohorten: de aspirant-single-center studie REGP (19 patiënten) (GSE62322) , de retrospectieve multi-center studie COSIVAL (68 patiënten) en de prospectieve multi-center studie BIOCOLON (56 patiënten) (GSE62080 en GSE72970) . Voor deze drie studies waren de inclusiecriteria: histologisch bewezen colonadenocarcinoom, gevorderde en bidimensioneel meetbare tumor (stadium IV), leeftijd tussen 18 en 75 jaar, en de prestatiestatus van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) ≤2. Vóór elke behandeling ondergingen alle patiënten een operatie voor primaire tumorresectie of endoscopische biopsie.

voor de western blot-analyse werden 13 extra tumormonsters gebruikt uit het prospectieve single-center-onderzoek REGP, maar niet opgenomen in de 143 monsters.

voor immunohistochemie-analyse werden weefselmonsters van nog eens 52 patiënten met CRC alleen retrospectief geselecteerd uit de Pathologiebestanden van het Institute of Cancer Research van Montpellier wanneer voor dezelfde patiënt normale mucosa -, adenoom-en adenocarcinoommonsters beschikbaar waren.

alle studies met menselijke weefselmonsters werden goedgekeurd door de relevante ethische commissies en alle deelnemers werden geïnformeerd over de doelstellingen en methoden van het onderzoek en ondertekenden een schriftelijke geïnformeerde toestemming voor inschrijving.

Genexpressieanalyse

Colonmonsters (normale colon -, primaire tumor-en levermetastasemonmonsters voor de REG/P-studie, maar alleen primaire tumormonmonsters voor de COSIVALE en BIOCOLON-onderzoeken) werden verzameld op het moment van de operatie na een gestandaardiseerde procedure om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen . De steekproeven werden dan gekruist aan menselijk genoom U133 Plus 2.0 arrays (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

om nieuwe therapeutische doelen te identificeren voor op antilichamen gebaseerde therapie in mCRC, vergeleken we de genexpressieprofielen van normale mucosa (n = 17), primaire tumor (n = 20) en levermetastasen (n = 19) weefselmonsters.

aangezien CRC-heterogeniteit in aanmerking moet worden genomen bij het vergelijken van genexpressieprofielen, werden primaire tumormonsters (n = 143) geclassificeerd met behulp van de CRC-moleculaire classificaties op basis van genexpressieprofielen die door drie onafhankelijke groepen zijn voorgesteld en de recente consensusclassificatie . Kort, de Sousa E. Melo et al. voorgesteld om tumoren te groeperen in drie klassen: CCS1 (CRC met microsatelliet instabiliteit, MSI), CCS2 (kanker met chromosomale instabiliteit, CIN) en CCS3 (nieuw subtype). Sadanandam et al. geà dentificeerd vijf moleculaire subtypes, op basis van het celfenotype: Bekerachtige, Transit-Amplifying (TA), Enterocyte, stam-achtige, en inflammatoire . Marisa et al. beschreven zes moleculaire subtypes (C1 tot C6) met de volgende hoofdkenmerken: C1 = CIN en downregulatie van immuunwegen, C2 = MSI, C3 = gemuteerde KRAS, C4 = stamcelfenotype-achtig, C5 = Cin en upregulatie van de WNT-routes, en C6 = CIN en normaal-achtig genexpressieprofiel . Ten slotte, uitgaande van zes eerder gepubliceerde handtekeningen, presenteerde een internationaal consortium een classificatie met vier consensus subtypes: MSI (CMS1), canonical (CMS2), metabolic (CMS3), en mesenchymal (CMS4) (ter beoordeling ). De verdeling van de CRC-steekproef volgens het moleculaire subtype wordt getoond in aanvullend dossier 1: tabel S1.

immunohistochemie analyse

monsters werden samengesteld in een tissue micro-array (TMA) met behulp van drie weefselkernen (elk 0,6 mm diameter), zoals eerder beschreven . Kort, 3-µm secties van de TMA werden gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd in gesorteerde alcoholen. Warmte-geïnduceerde antigeen retrieval werd uitgevoerd door incuberen TMA secties in EDTA buffer (pH 9) bij 98 °C in een waterbad gedurende 20 minuten. Na neutralisatie van de endogene peroxidase-activiteit werden TMA-secties geïncubeerd met een polyklonaal anti-CLDN1-antilichaam (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, USA) of antilichaamverdunner (Dako, Glostrup, Denemarken) alleen gedurende 60 minuten. Primaire antilichaambinding werd gevisualiseerd met behulp van het Envision® – systeem en de Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Denemarken). Het percentage CLDN1-positieve cellen en de kleuringsintensiteit (0, geen kleuring; 1, geelachtig; 2, bruin; en 3, donkerbruin) werden geëvalueerd voor elke individuele TMA-vlek.

Western blot analyse

Tumorweefselmonsters van patiënten werden direct gemalen in lysis buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM natriumorthovanadaat, een cocktail proteaseremmer tablet voor 10 ml) met behulp van een Mixer Mill® MM 300 unit (Qiagen, Valencia, CA). De eiwitconcentratie werd bepaald met de Bradford-test (Pierce Coomassie Plus Protein-Test). Vervolgens werd 50 µg van de totale eiwitten opgelost door 12% SDS-pagina en overgebracht op nitrocellulose membranen (Whatman® Protran®, poriegrootte 0,45 µm). Niet-specifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd met 5% (wt/vol) vetvrije melk in PBS met 0,1% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en vervolgens werden membranen bij 4 °C geïncubeerd met een polyclonal anti-CLDN1 antilichaam (JAY-8) ‘ s nachts. Membranen werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met de juiste mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur. Revelation werd uitgevoerd met een chemiluminescentiesysteem (Amersham Biosciences); β-tubuline expressie werd gebruikt voor normalisatie.

subcellulaire eiwitextractie

eiwitextractie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven . Voor elk monster werden 20 µm dikke secties gesneden met een cryotoom, gemengd met vloeibare stikstof en voorzichtig gemalen met een micro-stamper. Voor subcellulaire eiwitextractie werd de subcellulaire Proteoomextract Kit gebruikt volgens de instructies van de fabrikant (Calbiochem). Subcellulaire fracties (10 µg/elk) werden geladen op 12% SDS-pagina gels. Immunoblotting werd gedaan zoals hierboven beschreven met de volgende primaire antilichamen: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen), -Histone H3 (Pierce) en-β-tubuline (Sigma T4026).

cellijnen

de volgende menselijke CRC-cellijnen werden gebruikt: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (een gift van C. Montagut, Department of Medical Oncology, Hospital del Mar, Barcelona, Spanje), HCT116 (CCL-247) en LS174T (ATCC CL-188). Om de CLDN1-positieve SW480-cellijn (SW480-CLDN1) te verkrijgen, werden SW480-cellen stabiel getransfecteerd met de menselijke cldn1 cDNA-kloon (Invitrogen MGC collection) of met lege vector (pcDNA) met behulp van het jetprime™ transfectie reagens (Polyplus-transfectie Inc., Frankrijk). CLDN1-positieve klonen werden geselecteerd door getransfecteerde cellen te kweken in aanwezigheid van 500 µg / ml geneticine. Voor het tot zwijgen brengen van CLDN1 werd SW620 omgezet met de pSIREN-vector die de shRNA tegen CLDN1 (SW620shCLDN1) of tegen luciferase (shluc, negatieve controle) bevatte. Na 24 uur werden cellen geselecteerd met 1 µg/mL puromycine en werden stabiele klonen samengevoegd. Alle transfecties van voorbijgaande aard werden gedaan met behulp van het jetprime ™ transfectie reagens.

productie van anti-CLDN1 mAb 6 F6

voor de productie van antilichamen werden 6-8 weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen (Harlan, Gannat, Frankrijk) om de twee weken uitgedaagd door intra-peritoneale (i.p.) injectie van 4 miljoen NIH-cellen van muizen die tijdelijk getransfecteerd werden met cldn1 cDNA (NIH-CLDN1-cellen) (in totaal vijf injecties). NIH-CLDN1 cellen werden gemengd met complete Freund ‘s adjuvans (Sigma) voor de eerste injectie, en met onvolledige Freund’ s adjuvans (Sigma) voor de andere vier injecties. Drie maanden na de vijfde immunisatie werd een intraveneuze boosterinjectie van NIH-CLDN1-cellen gegeven. Drie dagen later, milt cellen van geïmmuniseerde muizen werden gesmolten met de muis myeloma cellijn P3-X63-Ag.8.653 om muizenhybridomen te produceren. Supernatants van nieuw gegenereerde klonen werden gescreend door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren (FACS) met behulp van SW480-CLDN1 en SW480 cellen (negatieve controle). De screeningsresultaten werden bevestigd door het uitvoeren en aanvullende screening met behulp van SW620-en SW620-shCLDN1-cellen. De anti-cldn1 hybridoma 6 F6 kloon werd geselecteerd en gekloond door de verdunning te beperken. Antilichaamisotypering toonde aan dat 6 F6 een IgG3k was.

alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Franse regering voor experimenteel dieronderzoek (overeenkomst CEEA-LR-12052).

Radiolabeling en SPECT-CT-beeldvorming

vrouwelijke athymische naakte muizen (6-8 weken oud) werden gekocht bij Harlan. De 6 F6 mAb werd radioactief gelabeld met 125I (Perkin Elmer) bij de specifieke activiteit van 370 MBq/mg voor single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging, gebruikmakend van het IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) methode. Na staartaderinjectie van 16 MBq / 50 µg 125I-gelabeld 6 F6, werden beelden van whole-body single photon emission tomography/computed tomography (SPECT/CT) verkregen met een 4-head multiplexing multi-pinhole NanoSPECT camera (Bioscan Inc., Washington, USA) op verschillende tijdstippen (48, 72 en 96 h). Tegelijkertijd werden micro-CT-beelden van het hele lichaam verkregen voor anatomische co-registratie met SPECT-gegevens. Gereconstrueerde SPECT-en CT-gegevens werden gevisualiseerd en gelijktijdig geregistreerd met behulp van Invivoscope®.

Clonogene assay

colorectale kankercellen werden gezaaid in een 6-Wells plaat (150, 250 of 400 cellen/putje) en mochten gedurende een nacht bij 37 °C blijven plakken. Vervolgens werd 1 ml RPMI met of zonder 6 F6 mAb (uiteindelijke concentratie: 100 µg/ml) toegevoegd aan elk putje en werden de cellen gedurende zes dagen gekweekt. Na nog zes dagen in medium zonder antilichaam, werden de platen gelezen met behulp van een celigo™ imaging cytometer en de toepassing “Single colony verification”. De Celigo ™ cytometer is een benchtop in situ cellulair analysesysteem dat beelden van Putten levert met behulp van heldere veldverlichting (Nexcelom Bioscience, MA, USA).

oprichting van driedimensionale (3D) sferoïde culturen

Ultra-lage gehechtheid, ronde bodem 96-wells platen (Corning Costar) werden gebruikt voor sferoïde vorming. SW480, SW480-CLDN1 of SW620 cellen werden gezaaid met een dichtheid van 5 × 104. Cellen samengevoegd en samengevoegd in 3D sferoïden binnen 24-72 h. Beelden van putten werden genomen met een fase-contrast microscoop met behulp van een 5× objective of gevangen met de Celigo™ imaging cytometer met behulp van de “Tumorosphere” applicatie. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld met de Celltiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA). Na toevoeging van 100 µl CellTiter Glo-reagens aan elk putje gedurende 10 minuten, werd luminescentie gemeten met een 1450 MicroBeta TriLux luminescentie microplaatlezer (Perkin Elmer).

celcyclus-en proliferatieanalyse in sferoïden

sferoïden werden bereid door 1000 DiFi-cellen per putje te plateren in ultra-low attachment 96-well-platen en deze gedurende 5 dagen te laten groeien in aanwezigheid van 100 µg/ml van de 6 F6 mAb of irrelevante mAb (retuximab). Voor de analyse van de celcyclus werden cellen gepelleteerd, trypsiniseerd, gewassen met PBS, gefixeerd in 75% ethanol, en gekleurd met 40 µg/ml propidium jodide in aanwezigheid van 100 µg ml−1 RNAse (Qiagen). De distributie van de celcyclus werd bepaald met een Fc500 Beckman Coulter stroom Cytometer gebruikend het kanaal FL-3. De cellen werden omheind op een puntplot dat de DNA-puls-piek versus het DNA-pulsgebied toonde om doublets uit te sluiten. Cell cycle distributies werden geïllustreerd met behulp van de Flow Jo analyse software (Treestar, FLOWJO, Ashland, OR, USA).

op kweekdag 4 werd celproliferatie gemeten door incubatiecellen met 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) gedurende 24 uur. EdU wordt in het DNA opgenomen tijdens de actieve DNA-synthese. Dan, na celtrypsinization en fixatie / permeabilization in 75% ethanol / PBS, werd opgenomen EdU geëtiketteerd en ontdekt met de click-iT EdU Alexa Fluor 488 stroom Cytometry Assay Kit (Invitrogen). Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met 1 µg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) in PBS/0,1% Triton X100 bij 37 °C gedurende 30 minuten. De Celigo™ “Expression Analysis” (Target 1 + Mask) applicatie werd gebruikt om het fluorescerende signaal te kwantificeren en voor data-analyse. De cellen werden geà dentificeerd gebruikend de nucleaire vlek van DAPI en de synthese van DNA werd gekwantificeerd door EdU-integratie te meten.

xenotransplantaatmodellen

1,5 × 106 SW620-cellen of 3 × 106 DiFi-cellen werden gesuspendeerd in kweekmedium en subcutaan (s.c.) geïnjecteerd in de rechterflank van 6-8 weken oude vrouwelijke athymische naakte muizen uit Harlan. Toen het tumorvolume ongeveer 100 mm3 bereikte, werden muizen gerandomiseerd in verschillende groepen en behandeld door i.p. injectie van 0,9% NaCl of 6F6 mAb (15 mg/Kg per injectie) tweemaal per week gedurende drie opeenvolgende weken voor het eerste experiment en driemaal per week voor het tweede experiment. Tumoren werden tweewekelijks gemeten met een schuifmaat en volumes berekend met de formule: D1 x D2 x D3 / 2.

Intrasplenisch kolonisatiemodel voor de lever

in elk experiment werden 2 miljoen SW620-cellen met luciferase-expressie (SW620-LUC-cellen) geïnjecteerd in de milt van 6-8 weken oude vrouwelijke athymische naakte muizen. De milt werd 2 minuten na celinjectie verwijderd. Op dag 1 na injectie werden muizen willekeurig verdeeld in twee groepen van 10 muizen die ofwel behandeld werden met 15 mg/kg 6 F6 mAb of 0,9% NaCl door i.p. injectie, driemaal per week. Om de gemetastaseerde vorming en verspreiding te evalueren, werd de expressie van luciferase gecontroleerd door middel van luminescentie beeldvorming na injectie van luciferine (Camera Ivis Lumina II, PerkinElmer®) eenmaal per week. In week 5 Na de operatie werden muizen gedood, levers verwijderd, gefotografeerd en macroscopisch zichtbare metastasen op het leveroppervlak geteld.

statistische analyse

statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de STATA 13.0-software (StataCorp). Voor genexpressie of immunohistochemie experimenten werden de verschillen tussen groepen geanalyseerd met behulp van de Kruskall Wallis/Dunn ‘ s test. Correlaties tussen cldn1 genexpressie en progressievrije overleving (PFS) en totale overleving (OS) werden geëvalueerd in de gehele groep (n = 143 patiënten) en volgens het tumor moleculair subtype. Hiertoe werden de 143 patiënten verdeeld in twee groepen op basis van de mediane cldn1 genexpressie (d.w.z. 9,75 ). PFS-en OS-waarden werden vergeleken met behulp van de Kaplan-Meier-methode en verschillen tussen overlevingsdistributies werden beoordeeld met behulp van de log-rank test.

de gepaarde t-test werd gebruikt om het effect van incubatie te vergelijken met de 6 F6 mAb in in vitro experimenten.

In in vivo experimenten werd een lineair gemengd regressiemodel gebruikt om het verband tussen tumorgroei en het aantal dagen na injectie te bepalen. Het vaste deel van het model omvatte variabelen die overeenkomen met het aantal post-graft dagen en verschillende behandelingsgroepen. Interactietermen werden in het model ingebouwd; willekeurige intercepties en willekeurige hellingen werden opgenomen om rekening te houden met het tijdseffect. De coëfficiënten van het model werden geschat op basis van de maximale waarschijnlijkheid. De overlevingskansen werden geschat vanaf de datum van de injectie tot de datum waarop de tumor een volume van 1500 mm3 bereikte met behulp van de Kaplan–Meier methode. Overlevingscurven werden vergeleken met behulp van de log-rank test. Voor de leverkolonisatie-experimenten werden de verschillen tussen de groepen geëvalueerd met de Mann-Whitney u-test. Voor alle experimenten werden de verschillen significant geacht wanneer P < 0,05.