chlooramfenicol acetyltransferase as a selection marker for chlamydial transformation
pGFP:: SW2, the shuttle vector constructed by Wang et al, contained a β-lactamase gen as a selection marker. Het draagt ook een KATTENGEN dat aan het GFP-gen wordt gesmolten . We ontdekten dat E. coli getransformeerd werd met het pGFP:: SW2 plasmide kon groeien in medium dat chlooramfenicol bevatte (eindconcentratie): 170 µg / ml), wat erop wijst dat het gen van de kat ook kan worden gebruikt als selectiemerker voor experimenten met chlamydiale transformatie. Zoals gewaarschuwd door Wang et al., een nadelig effect van chlooramfenicol op gastheermitochondriën, zoals aangetoond door Li et al. kan het nut van dit antibioticum voor chlamydiale transformatie beïnvloeden . In Li et al.in het rapport was de minimale toxische concentratie van chlooramfenicol 10 µg / ml, wat een lichte 20% reductie van ATP productie veroorzaakte. We hebben vastgesteld dat de schijnbare laagste chlooramfenicolconcentratie die volledig inhibeerde inclusievorming in de plasmide-vrije C. trachomatis L2 stam aangeduid L2R was slechts 0,05 µg / ml (gegevens niet getoond), die ver onder de concentraties toxisch voor gastheercellen was. Daarom redeneerden we dat dit antibioticum gebruikt kon worden om Kat-expresserende transformanten te selecteren zonder de gastheercellen significant te belasten.
we transformeerden L2R met pGFP::SW2, en selecteerden de ene helft van de getransformeerde cellen met ampicilline en de andere helft met chlooramfenicol. De antibiotica (2 µg/ml ampicilline of 0,1 µg / ml chlooramfenicol) werden toegevoegd aan de culturen om 10 uur na transformatie. Vanaf passage 2 werden de concentraties verhoogd tot respectievelijk 5 en 0,2 µg / ml en werden ze toegevoegd op het moment van inoculatie. De splitsingsverhouding tussen passages bleef 1:1 van passage 1 maar passage 4. Hoewel de MIC van chlooramfenicol, die werd bepaald bij lage multipliciteit van infectie (~0,1 inclusievormende eenheden per cel), 0,05 µg/ml was, werd verwacht dat sommige van de niet-getransformeerde chlamydiae insluitsels zouden vormen in aanwezigheid van 0,1 – 0.2 µg / ml het antibioticum, omdat we een hoge EB-celverhouding gebruikten voor Transformatie, en de werkzaamheid van chlamydiale groeiremming door antibiotica wordt beïnvloed door de veelheid van infectie . Met het hierboven beschreven selectieprotocol, in culturen geselecteerd met ampicilline, onder een fase-contrastmicroscoop, werden bijna 100% cellen gevonden om een opname met afwijkende RBs bij de eerste passage te bevatten. De afwijkende RB-bevattende insluitsels waren nog aanwezig in een klein deel van de cellen bij passage 2, maar werden meestal vervangen door schijnbaar normale insluitsels bij passage 3. Normale inclusies werden gevonden in ongeveer 20% cellen, en abnormale inclusies werden zelden waargenomen bij passage 4. Bij passage 5, die het gevolg was van inenting met 10% oogst van passage 4, werden insluitsels gevonden in 80% cellen; blijkbaar bevatte geen van deze insluitsels afwijkende RBs.
aangezien chlooramfenicol chlamydiae niet tot afwijkende RBs leidt, beoordeelden we resistentie tegen het antibioticum op basis van de inclusiegrootte. Insluitsels van kleiner-dan-normale grootte werden ontdekt in bijna alle cellen bij passage 1. Sommige, maar zeer kleine, insluitsels werden gevonden in passage 2, en de meeste van die insluitsels werden vervangen door normale insluitsels door passage 3. Insluitsels van normale grootte werden gevonden in meer dan 20% cellen bij passage 4. Bij passage 5, afgeleid na inoculatie met 10% passage 4 oogst, en een toename van chlooramfenicol concentratie (van 0,2 µg/ml tot 0,5 µg/ml), normale inclusies werden gevonden in bijna 100% cellen 0000000.
naast de schijnbare resistentie tegen de selectiemiddelen, gebruikten we GFP expressie en herstel van glycogeensynthese als extra markers voor succesvolle transformatie . EBs geoogst uit passage 5 werden gebruikt om McCoy-cellen te infecteren bij een 1: 100 verdunningssnelheid (cell number equivalence) voor experimenten die GFP expressie en glycogeensynthese bepalen (Figuur 2). Zoals verwacht werd GFP niet uitgedrukt in “wild-type” plasmide-vol C. trachomatis L2 (434/bu) (figuur 2A), noch in niet-getransformeerde “plasmide-vrije L2R” (figuur 2B). Consistent met gevestigde bevindingen dat glycogeensynthese in C. trachomatis vereist zijn plasmide, jodiumkleur toonde aan dat glycogeen werd geaccumuleerd in de insluitsels van wild-type L2 (figuur 2A) maar niet die van L2R (figuur 2B). In aanwezigheid van 5 µg/ml ampicilline, die RB-deling remt, vormde niet-getransformeerde L2R (figuur 2C) insluitsels die reuzenrbs bevatten zonder glycogeen te produceren; terwijl chlooramfenicol (uiteindelijke concentratie: 0,5 µg/ml) de vorming van zichtbare insluitsels in L2R-geïnfecteerde cellen volledig remde (figuur 2D). Consistent met gegevens gepubliceerd door Wang et al. , pGFP::SW2-getransformeerde L2R geselecteerd met ampicillin gevormde GFP-positieve insluitsels met glycogeen (figuur 2E). pGFP:: SW2-getransformeerde L2R geselecteerd met chlooramphenicol vormde ook GFP-positieve insluitsels die glycogeen bevatten (figuur 2F). Zoals verwacht, ampicillin-selected transformants in staat waren om normaal-sized, GFP-positieve, glycogeen-bevattende insluitsels in aanwezigheid van chlooramphenicol (figuur 2G) te vormen; eveneens, chlooramphenicol-selected transformants waren volledig bestand tegen ampicillin, uitgedrukt GFP en geproduceerd glycogeen (figuur 2H). Deze resultaten suggereren dat het gen van de kat in het pGFP::SW2 plasmide is functioneel in chlamydiae, en chloramphenicol-weerstand kan als selectiemarker voor chlamydial transformatie worden gebruikt.
opname, GFP expressie en glycogeensynthese van pGFP:: SW2 transformanten van C . trachomatis L2. Niet-getransformeerde plasmide-volle stam 434 / bu (a), niet-getransformeerde plasmide-vrije stam L2R (B-D) en getransformeerde L2R geselecteerd met ampicilline (E, G) of chlooramfenicol (F, H) werden gekweekt met een medium dat een aangewezen antibioticum bevat of met een antibioticum-vrij medium. De beelden van insluitsels in Onbevlekte en jodium-bevlekte culturen werden verworven met de microscopie van het fasecontrast of de fluorescentiemicroscopie 48 h post-inoculation. In alle panelen, zijn fasecontrast en GFP beelden superimposable.
vervolgens verwijderden we het β-lactamase gen uit het pGFP::SW2 plasmide zoals beschreven in de “methoden” sectie, en gebruikte het resulterende PGFP-CAT:: SW2 plasmide om L2R te transformeren. getransformeerde chlamydiae werden onderworpen aan selectie met chlooramfenicol gebruikend hetzelfde regime zoals hierboven beschreven. Chlooramfenicol-resistente insluitsels ontstonden in ongeveer 20% van de besmette cellen in de cultuur van passage 4. De fluorescentiemicroscopie en de jodiumvlek onthulden GFP – en glycogeen-positieve insluitsels in cellen die met EBs uit passage 5 werden geoogst, en in aanwezigheid van chlooramphenicol werden gekweekt (Figuur 3, hoger Paneel). Echter, als gevolg van een gebrek aan β-lactamase in het pgfp-CAT::SW2 plasmide, waren de transformanten niet in staat om normale insluitsels te vormen in aanwezigheid van ampicilline; in plaats daarvan werden hun insluitsels gevuld met afwijkende RBs. Terwijl de onregelmatige insluitsels nog positief voor GFP waren, waren zij grotendeels vrij van glycogeen (Figuur 3, lager Paneel). Na passage 5 werden de pgfp-CAT::SW2 transformanten gekweekt met 0,5 µg / ml chlooramfenicol voor extra vier passages met een splitsingsverhouding van 1:100 voor elke passage. Alle insluitsels bij passage 9 hadden de zelfde verschijning zoals de insluitsels van plasmide-vult chlamydiae en niet dat van plasmide-vrije L2R, en allen werden gevonden om GFP uit te drukken (getoonde gegevens niet). Deze resultaten bewijzen dat het CAT gen in het PGFP-CAT::SW2 plasmide, vergelijkbaar met het PGFP::SW2 plasmide, fungeert als een selectie marker Voor C. trachomatis transformatie.
opname, GFP expressie en glycogeensynthese in L2R omgezet met pGFP-CAT:: SW2. Cellen geïnfecteerd met chlooramfenicol-geselecteerde transformanten werden blootgesteld aan ofwel chlooramfenicol of ampicilline. De beelden van insluitsels in Onbevlekte en jodium-bevlekte culturen werden verworven met de microscopie van het fasecontrast of de fluorescentiemicroscopie 48 h post-inoculation. Fasecontrast en GFP-beelden zijn superimposable.
opgemerkt moet worden dat Tam et al. heeft eerder geprobeerd om een transformatiesysteem te ontwikkelen met het gen van de kat als selectieve marker . In dat onderzoek werd een pendelvector met een KATTENGEN geëlektroporeerd in EBs van C. trachomatis E (stam UW-5 / CX) en L2 (stam 434/Bu). Hoewel zowel kat mRNA als enzymactiviteit in de initiële culturen van getransformeerde chlamydiae konden worden gedetecteerd, slaagden de auteurs er niet in stabiele transformanten te verkrijgen na selectie met chlooramfenicol voor 4 passages. Het is belangrijk op te merken dat beide elektroporated stammen een native plasmide bevatten die dezelfde replicatieoorsprong deelt met het recombinante plasmide dat Voor transformatie wordt gebruikt . Sinds Wang et al. waren in staat om stabiele penicilline-resistente transformanten te verkrijgen alleen uit L2R, een plasmide-vrije C. trachomatis L2 variant, maar niet de wild-type, plasmide-vol 434 / Bu, onder anders identieke experimentele instellingen, is het retrospectief niet verwonderlijk dat Tam et al. er werd geen stabiele chlooramfenicol-resistente chlamydiae afgeleid.
