Chymotrypsinogeen a

C. A. S.: 9035-75-0

enzymatische reactie (afbeelding opent in een nieuw venster)

chymotrypsine is een serine endopeptidase geproduceerd door de acinaire cellen van de alvleesklier. Chymotrypsine wordt geactiveerd na proteolyse van chymotrypsinogeen door trypsine. Terwijl trypsine hydrolyseert bij lysine en arginine, splijt chymotrypsine selectief peptidebindingen gevormd door aromatische residuen (tyrosine, fenylalanine en tryptofaan) (Hedstrom et al. 1992). Twee overheersende vormen van chymotrypsine, A en B, worden gevonden in gelijke hoeveelheden in rundvee pancreas. Zij zijn zeer gelijkaardige proteã nen (80% identiek), maar hebben beduidend verschillende proteolytische kenmerken (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, en Gráf et al. 2004). De onderstaande informatie heeft voornamelijk betrekking op de A vorm van chymotrypsinogeen en chymotrypsine.

geschiedenis:

in de vroege jaren 1900 stelde Vernon voor dat pancreaspreparaten een intrinsieke activator van zijn eigen enzymen konden veroorzaken (Vernon 1901). Vernons melkstollingsexperimenten bepaalden dat er minstens twee enzymen aanwezig waren en dat de ene stabieler was dan de andere (Vernon 1902). Dit idee werd echter pas algemeen aanvaard in 1934 toen Kunitz en Northrop de aanwezigheid van een enzym naast trypsine bevestigden en het chymotrypsine noemden. Ze waren in staat om chymotrypsine te kristalliseren, evenals de inactieve voorloper, chymotrypsinogeen (Kunitz en Northrop 1934). In 1938 isoleerde Kunitz verschillende actieve vormen van chymotrypsine, door ze aan te duiden als alfa, bèta en gamma (Kunitz 1938). In het begin van de jaren 1940 bestudeerden Fruton en Bergmann de specificiteit van chymotrypsine en rapporteerden ze over verschillende nieuwe substraten (Fruton en Bergmann 1942). Jacobsen identificeerde Al snel aanvullende vormen van chymotrypsine, waarbij ze werden aangeduid als delta en pi (Jacobsen 1947). In 1948 karakteriseerde Schwert verder de molecuulgewichten van chymotrypsine en chymotrypsinogeen.In 1954 werd het eerste bewijs voor het drie-stappen mechanisme van chymotrypsine hydrolyserende amide-en estersubstraten gerapporteerd door Hartley en Kilby, die de aanwezigheid van een acyl-enzymmedium veronderstelden, wat later werd bewezen waar te zijn (Henderson 1970). In 1955 verkreeg Laskowski een tweede kristallijn chymotrypsinogeen met de naam chymotrypsinogeen B. In 1964 bepaalde Hartley de aminozuurvolgorde van chymotrypsine A, die later werd verfijnd door Meloun et al. in 1966. In 1968, Smillie et al. bepaalde de aminozuurvolgorde van chymotrypsine B, die 80% opeenvolgingsidentiteit met chymotrypsine A. door de jaren ’70 en’ 80 onderzoek werd gedaan om het werkingsmechanisme beter te begrijpen, en de verschillen in aminozuurvolgorde tussen trypsine en chymotrypsine te identificeren (Steitz et al. 1969, Cohen et al.1981, Asbóth en Polgár 1983, en Gráf et al. 1988).In de jaren negentig werd chymotrypsine gezuiverd uit andere bronnen, waaronder kabeljauw (Ásgeirsson en Bjarnason 1991) en kameel (al-Ajlan en Bailey 1997). Ook werd begonnen met het onderzoek naar remmers (Baek et al. 1990), en Frigerio et al. verhelderde de kristalstructuur van bovine chymotrypsine tot een 2,0 Å resolutie (Frigerio et al. 1992).

Recent onderzoek heeft het vouwen en denatureren van chymotrypsine over een reeks concentraties onderzocht (Ghaouar et al. 2010), chymotrypsine interactie met nanodeeltjes substraten (You et al. 2006, and Jordan et al. 2009), en het verhogen van chymotrypsine stabiliteit door conjugatie aan PEG moleculen (Castellanos et al. 2005, and Rodríguez-Martínez et al. 2009).

specificiteit:

chymotrypsine wordt geactiveerd door splitsing van de binding tussen arginine en isoleucine (R15 en I16) door trypsine, wat structurele wijzigingen en vorming van de substraatbindingsplaats veroorzaakt (Sears 2010). Chymotrypsine verschilt van trypsine in dat trypsine peptiden splijt bij arginine en lysine residuen, terwijl chymotrypsine de voorkeur geeft aan grote hydrofobe residuen (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsine katalyseert bij voorkeur de hydrolyse van peptidebindingen waarbij l-isomeren van tyrosine, fenylalanine en tryptofaan betrokken zijn. Het werkt ook gemakkelijk op amiden en esters van gevoelige aminozuren. Chymotrypsine specificiteit voor grote hydrofobe residuen kan worden verklaard door een hydrofobe S1 binding pocked gevormd door residuen 189 door 195, 214 door 220, en 225 door 228 (Cohen et al. 1981).

hoewel de structuur van trypsine en de S1-locatie van chymotrypsine slechts één verschil vertoont (op positie 189), is de site-directed mutagenese van trypsine en chymotrypsine er niet in geslaagd specifieke kenmerken uit te wisselen, wat erop wijst dat het mechanisme waarmee trypsine en chymotrypsine substraatspecifieke katalyse bereiken niet volledig is begrepen (Steitz et al. 1969, en Gráf et al. 1988).

samenstelling:

de drie aminozuurresiduen van de katalytische triade (H57, D102 en S195) zijn essentieel voor de splitsing van peptidebindingen en worden gestabiliseerd door waterstofbindingen (Sears 2010, en Gráf et al. 2004). G193 en S195 vormen het oxyaniongat en interageren met de carbonylgroep van de scissilepeptidebinding, waarbij deze zich oriënteert tot het tetrahedrale tussenproduct (Rühlmann et al. 1973, Huber en Bode 1978, en Gráf et al. 2004).

moleculaire eigenschappen:

chymotrypsine A en B delen 80% sequentieidentiteit (Hartley 1964, Meloun et al . 1966, Smillie et al. 1968, en Gráf et al. 2004). De aminozuren van de katalytische triade (H57, D102, en S195) worden hoogst behouden in de opeenvolgingen van de peptidases van familie S1 (Gráf et al. 2004). De serine op positie 214 is ook zeer behouden in de familie en is voorgesteld als het vierde lid van de katalytische triade (Ohara et al. 1989, en McGrath et al. 1992).

Eiwit toegangsnummer: P00766

CATH Classificatie (v. 3.3.0):

• Klasse: Voornamelijk Beta
• Architectuur: Beta Vat
• Topologie: Trypsine-like Serine Protease

Moleculair Gewicht:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

Optimale pH: 7.8-8.0 (Rick 1974)

Izoelektricheskoi Punt:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

aanvragen:

• Sequentieanalyse
• peptide synthese
• Peptide mapping
• Peptide fingerprinting