Cistron

biogenese van PTX

de vijf ptx-subeenheden worden gecodeerd door aaneengesloten cistrons binnen één polycistronisch operon , waarvan de expressie wordt gereguleerd door het bvga/S-systeem. Via dit tweecomponentensysteem kan de productie van toxine worden gemoduleerd door de aanwezigheid van MgSO4 of nicotinezuur, of tijdens de groei bij lage temperaturen (voor overzicht, zie ). BvgS is een binnenmembraan-overspannende proteã ne die veelvoudige kinaseactiviteiten uitdrukt. In actieve toestand activeert het bvga via fosforylering. Gefosforyleerd BvgA, een cytoplasmatische transcriptionele regulator, bindt dan aan de operatorplaatsen van het ptx-gebied van de genpromotor, waar het met de polymerase van RNA in wisselwerking staat en de transcriptie activeert. Hoewel modulatoren die het signaleren van BvgS verstoren zijn geà dentificeerd, is er geen ligand van BvgS bekend die nodig is om het signaleren te activeren, wat suggereert dat BvgS standaard wordt geactiveerd .

na transcriptie worden de afzonderlijke subeenheden geproduceerd als preproteïnen die splitsbare signaalpeptiden bevatten. Op translocatie door het binnenmembraan (hoogstwaarschijnlijk via een SEC-afhankelijke weg), worden de signaalpeptides verwijderd. Hoewel de signaalpeptides typische kenmerken van de substraten voor leader peptidase i tonen, is hun splitsing door Escherichia coli leader peptidase I zeer inefficiënt. Coexpressie van het B. pertussis lep gen in E. coli verhoogt de rijping van ptx subeenheden aanzienlijk . Binnen de periplasmische ruimte, worden intra-subeenheid disulfidebindingen gevormd, en het holotoxine wordt dan geassembleerd voorafgaand aan afscheiding door het buitenmembraan. PTX bevat in totaal 11 intra-subeenheid disulfidebindingen, één in S1, twee in elke S4 en S5, en drie in elke S2 en S3 . Alle in PTX aanwezige cysteinen zijn betrokken bij disulfidebindingen binnen de keten . De vorming van disulfiden is belangrijk voor de biogenese van de toxine, omdat de verandering van cysteïne in S1 voorkomt dat deze subeenheid samenkomt met de B-oligomeer . Een goede disulfidevorming berust op het DsbA/DsbC-systeem, dat essentieel bleek te zijn voor de assemblage en secretie van PTX . Mutaties in dsbC, die coderen voor een van de drie disulfide-isomerasen, hebben blijkbaar geen effect op de assemblage van het toxine, hoewel ze de secretie ervan beïnvloeden, wat erop wijst dat DsbC werkt op een component die specifiek nodig is voor de secretie van PTX.

secretie is niet vereist voor biologische activiteiten van PTX, maar volledige assemblage van het holotoxine is belangrijk voor efficiënte secretie, aangezien stammen die zijn ontworpen om alleen S1 of alleen de B-oligomeer te produceren, een defect in secretie vertonen . Nochtans,kan een volledig functionele oligomeer van B tot op zekere hoogte in afwezigheid van S1 worden afgescheiden , die erop wijzen dat de aanwezigheid van S1 geen absolute vereiste voor oligomeer van B is. In tegenstelling, kan S1 alleen niet worden afgescheiden zonder de B-oligomeer, wat suggereert dat de secretiedeterminanten zich binnen de B-oligomeer bevinden, hoewel de aanwezigheid van S1 De secretieefficiëntie zeker kan verbeteren. Bepaalde veranderingen in het gen S1 hebben een sterk schadelijk effect op de secretie, in het bijzonder in het gebied rond Arg-57 , die suggereren dat dit gebied van S1 een rol speelt in de secretie van PTX. Bij afwezigheid van oligomeer B, s1 hoogstwaarschijnlijk verdelingen aan het buitenmembraan, misschien via zijn c-eind, hydrophobic domein. Dit kan de plaats van assemblage met oligomer B voorafgaand aan afscheiding door het buitenmembraan zijn .

de moleculaire stappen in de assemblage van holotoxinen zijn nog steeds slecht begrepen. Afzonderlijke subeenheden in mutante stammen die de andere subeenheden niet produceren, worden snel afgebroken. Bepaalde combinaties van subeenheden lijken elkaar wederzijds te stabiliseren . De stabiliteit van de S2–subeenheid wordt bijvoorbeeld sterk verbeterd door de aanwezigheid van S4 en vice versa, wat consistent is met de S2-S4-dimeervorming die wordt onthuld door de kristalstructuur van het holotoxine. Het is ook mogelijk dat subassemblages van de S2-S4 dimeer met de S1 subeenheid worden gevormd in afwezigheid van S3 en S5. Het S2-S4 dimeer is niet in B uitgescheiden. kinkhoest, terwijl de toevoeging van S1 aan dit dimeer in één of ander niveau van secretie kan resulteren.

het transport van PTX door het buitenmembraan van B. pertussis berust op een type IV secretiesysteem (T4SS) dat bestaat uit negen verschillende eiwitten, genaamd PTLA via PtlI . Deze proteã nen zijn homoloog aan die van T4SSs van andere bacteriën, met inbegrip van Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, en Rickettsia prowasekii . De PTL genen liggen direct stroomafwaarts van de vijf structurele ptx genen en staan onder de controle van de ptx promotor . Nochtans, schijnen de proteã nen Ptl op lagere niveaus dan de subeenheden van PTX te worden geproduceerd, zoals door Vertalende fusies van het phoA gen met diverse genen ptx en ptl wordt aangetoond . De productie van bepaalde PTL-eiwitten lijkt een beperkende stap in de secretie van PTX te zijn. Tijdens de exponentiële groei , zijn de bacteriën geschat om drie toxinemoleculen/min/ bacteriële cel af te scheiden, en zijn de subeenheden gevonden om binnen de periplasmic ruimte op te hopen, zowel als individuele subeenheden als geassembleerd in holotoxins. De accumulatie van de subeenheid komt door exponentiële groei voor hoewel de niveaus van bepaalde proteã nen PTL tot tussen 30 en 1.000 molecules per cel toenemen. Zo kan secretie in plaats van toxine productie of assemblage tarief-limiterend zijn. Vreemd genoeg, bij afwezigheid van de PTL–eiwitten, kunnen sommige subeenheden, zoals het dimeer S2-S4 in aanwezigheid van S1 , worden afgescheiden, hoewel de secretie van het holotoxine sterk afhangt van de aanwezigheid van de PTL-eiwitten.

de PTL-eiwitten worden verondersteld een complex te vormen dat zowel de binnen-als de buitenmembranen beslaat , en ze lijken allemaal (ten minste PtlA-H) nodig te zijn voor de secretie van toxines, zoals onderzocht door mutaties in elk afzonderlijk PTL-gen . Sommige mutaties die in trans in wild-type PTL+ stammen werden geà ntroduceerd, resulteerden in een dominant negatief secretiefenotype, Wat bevestigde dat ten minste PtlC tot PtlH deel uitmaken van een multimerisch complex. Een belangrijke stap in de afscheiding van PTX is duidelijk zijn capaciteit om de peptidoglycaanlaag te kruisen, en PtlE is getoond om peptidogycanase activiteit uit te drukken . Dit 276-residu-lang eiwit bevat actieve plaats gelijkenissen met andere glycohydrolases, en alanine substituties op deze plaats is aangetoond dat de peptidoglycanase activiteit van recombinant PtlE sterk verminderen. Dezelfde substituties in natuurlijke PtlE elimineren ook de secretie van ptx door B. pertussis, wat sterk suggereert dat PtlE de peptidoglycanase is die nodig is voor het toxine om de peptidoglycaanlaag te passeren.

PTX-secretie vereist hoogstwaarschijnlijk ook energie. Twee van de PTL proteã nen, PtlC en PtlH, bevatten veronderstelde adenosinetrifosfaat (ATP)–bindende plaatsen en zouden zo de energie kunnen verstrekken die voor toxineafscheiding nodig is. Beide proteã nen zijn getoond noodzakelijk om voor afscheiding te zijn , en in beide gevallen, zijn de veronderstelde ATP-bindende plaatsen essentieel voor functie. Voor beide wordt een dominant negatief fenotype waargenomen wanneer gemuteerde allelen Coe-expressie hebben met het wild – type allel, wat suggereert dat beide functioneren als multimers of deel uitmaken van het secretiecomplex. PtlH werd getoond om met het binnenmembraan worden geassocieerd, en de veranderingen in de ATP-bindende plaats van ptlh beà nvloeden zijn cellulaire plaats en schaffen zijn interactie met andere PTL proteã nen af . De precieze rol van PtlC is nog niet bekend. PtlD is ook een binnenmembraanproteã ne en bevat vijf transmembraandomeinen. Het is nodig voor de stabiliteit van PtlE, PtlF en PtlH via de C-terminal 72 residuen. Dit C-terminale gebied is echter niet voldoende voor toxinesecretie . PtlF toont eigenschappen van buitenmembraan proteã nen (OMPs), maar het kan ook met het binnenmembraan worden geassocieerd. In niet-reducerende omstandigheden migreren PtlF en PtlI als een complex tijdens natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, wat erop wijst dat PtlI zich bindt aan PtlF door de vorming van een disulfidebinding . De juiste vorming van disulfidebinding tussen PtlI en PtlF kan afhangen van DsbC, aangezien mutaties in het DSBC-gen de secretie beïnvloeden zonder de toxineassemblage te beïnvloeden .