Clastogene activiteit van 2 – chloordeoxyadenosine in somatische cellen van zoogdieren

mutagenese
onderzoeksartikel

Clastogene activiteit van 2-chloordeoxyadenosine in somatische cellen van zoogdieren

Gilmara Ausech AntonucciI; Catherine He TakahashiI; II

Iuniversity of São Paulo, Facultdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Genética, Ribeirão Preto, SP, Brazil. IIUniversidade of São Paulo, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, Department of Biology, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

correspondentie

ABSTRACT

van de basisanaloog-2-chloordeoxyadenosine (2-CdA) gebruikt voor behandeling bij chronische resistente en gevorderde lymfoproliferatieve aandoeningen is cytotoxisch voor zowel delende als niet-delende lymfocyten. Het huidige werk evalueerde het clastogene potentieel van dit geneesmiddel in vitro in menselijke lymfocyten in cultuur en in vivo in balb/c muizen beenmergcellen. In humane lymfocyten werd het clastogene effect van 2-CdA bestudeerd in G1 -, S-en G2-fasen van de celcyclus, waarbij gebruik werd gemaakt van drie verschillende concentraties (10, 20 en 40 mg/mL). De geanalyseerde eindpunten omvatten mitotische index( MI), proliferatieindex (PI), zusterchromatid-uitwisseling (SCE) en chromosomale aberratie (CA). Statistische analyse door een variantie (ANOVA) test toonde een significante toename (p < 0.05) in CA-frequenties voor cellen die tijdens de S-fase werden behandeld, maar de MI varieerde niet. De geteste concentraties veroorzaakten geen significante toename van de gemiddelde frequentie van SCE ‘ s, noch veranderden zij de cel PI in de G1-en S-fasen. De in vivo geteste concentraties waren 0,25, 0,375 en 0,5 mg / kg lichaamsgewicht. In deze test werden veranderingen in CA-frequenties en MI niet waargenomen bij de geteste dosisniveaus. Daarom wijzen de resultaten op een clastogeen effect van 2-CdA in humane lymfocytenculturen.

sleutelwoorden: humane lymfocyten, 2-CdA, chromosomale afwijkingen, SCE, celcyclus.

Inleiding

Purineanalogen zijn zeer actief bij de behandeling van lymfoproliferatieve aandoeningen (Pott-Hoeck en Hiddemann, 1995). Cladribine, 2-chlorodeoxyadenosine (2-CdA), is een nucleoside-analoog met een halogeenatoom vervangen op positie 2 in zijn purinering, die resistentie tegen deaminatie door adenosine-deaminase (ADA) verleent. 2-CdA is een drug van keus in de behandeling van harige celleukemie, maar het is ook hoogst efficiënt in andere low-grade lymphoid malignancies, met inbegrip van chronische lymphocytic leukemie (CLL). De rapporten in de literatuur hebben aangetoond dat 2-CdA vergelijkbare complete respons (CR) en totale respons (OR) geeft op fludarabine, maar de invloed van beide middelen op de overlevingskansen voor patiënten met CLL is nog steeds onzeker. Het CR-percentage geïnduceerd door 2-CdA is significant hoger dan bij patiënten behandeld met conventionele chemotherapie (Robak, 2001). 2-CdA is een andere nieuwe chemotherapeutische purine analoog, met specifieke toxiciteit voor lymfocyten (Schrimer et al., 1997). De cytotoxiciteit treedt op in prolifererende en rustgevende cellen, resulterend in gebeurtenissen zoals remming van DNA en eiwitsynthese, evenals inductie van apoptose (Robertsson et al., 1993). Ondanks de toxiciteit, goede resultaten in therapeutische respons zijn verkregen, en dit medicijn is de belangrijkste optie in tricoleukemia behandeling waarbij patiënten harige cel leukemie (HCL) (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993).

Adeninedeoxynucleosiden induceren apoptose in kalme lymfocyten en zijn nuttige geneesmiddelen voor de behandeling van indolente lymfoproliferatieve ziekten. Er zijn verschillende mechanismen voorgesteld om de toxiciteit van deoxyadenosine en zijn analogen in rustcellen te verklaren, waaronder de directe binding van dATP aan de pro-apoptotische factor Apaf-1 en de activering van de caspase-9 en -3 routes (Genini et al., 2000).

een patiënt met acute myeloïde leukemie behandeld met 2-CdA en Ara-C vertoonde vertraagde beenmergherstel, sinusitis en Candida tropicalis sepsis. Ze ontwikkelde multisystem orgaanfalen en stierf 1 maand na het starten van AML therapie. Post-mortem onderzoek, beperkt tot de borst en buik, onthulde verspreide candidiasis waarbij de longen, hart, lever, nieren en milt (Mathew et al., 2000).

Zwaan et al. (2002) waargenomen dat patiënten met t (9:11) significant gevoeliger bleken te zijn dan andere AML-patiënten voor de volgende geneesmiddelen: cytarabine (mediaan: 2,9-voudig), doxorubicine (4,5-voudig), mitoxantron (8,0-voudig), 2-chlorodeoxyadenosine (10,0-voudig).

Nucleoside-analogen (NA) zoals cytosine-arabinoside, fludarabine, cladribine en gemcitabine zijn essentiële componenten van de inductietherapie met AML (Acute myeloïde leukemie); ze zijn ook efficiënt voor de behandeling van lymfoproliferatieve aandoeningen en zijn gebruikt bij de behandeling van sommige vaste tumoren. Deze belangrijke samenstellingen delen sommige gemeenschappelijke kenmerken, namelijk in termen van het vereisen van vervoer door specifieke membraanvervoerders, en metabolisme en interactie met intracellular doelstellingen. Ze verschillen echter met betrekking tot de soorten transporters en hun preferentiële interactie met bepaalde doelen die de effectiviteit tegen snel prolifererende tumoren kunnen verklaren (Galmarini et al., 2001).Gezien deze informatie is het belangrijk om het clastogene potentieel van 2-CdA te beoordelen, op basis van rapporten dat dit geneesmiddel cytotoxiciteit induceert (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993) en DNA single-strand breaks (Liliemark and Juliusson, 1994). Het doel van deze studie was om de capaciteit van dit chemotherapeutische middel in het veroorzaken van chromosoomschade in menselijke lymfocyten en beenmergcellen van balb/c muizen te evalueren.

materialen en methoden

chemisch agens

de antitumorale 2-chloordeoxyadenosine werd door het Chemotherapiecentrum van Hospital de Clínicas van de Faculteit der Geneeskunde van Ribeirão Preto (Facultdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP) verstrekt voor de in vitro en in vivo experimenten.

humane perifere bloedlymfocyten

bloedmonsters werden verkregen van zes niet-rokende gezonde vrijwilligers (drie vrouwen en drie mannen) van 25 tot 35 jaar oud en werden behandeld tijdens de G1 -, S-en G2-fasen van de celcyclus, voor analyse van chromosoomafwijkingen (CA) en mitotische index (MI). Daarnaast werden lymfocyten van drie individuen (twee vrouwen en twee mannen) gebruikt voor de analyse van zusterchromatid exchange (SCE) en proliferation index (PI). Lymfocyten werden gekweekt in 78% rpmi-1640 medium (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) aangevuld met 20% foetaal kalfsserum (Cultilab, Brazilië) en toegevoegd met penicilline (5 mg/mL) en streptomycine (10 mg/mL). Cellen werden gestimuleerd met 2% fytohemagglutinine (Life Technologies, Grand Island, NY). Voor elk 5 mL kweekmedium werd 1 mL plasma toegevoegd en de culturen werden gedurende 52 uur bij 37 °C geïncubeerd voor CA-analyse. 2-CDA-oplossingen werden verdund in gedeïoniseerd water in de volgende concentraties: 10, 20 en 40 mg/mL kweekmedium, volgens Preston et al. (1987). In alle experimenten werd een negatieve controle opgenomen. Dia voorbereiding en kleuring werden uitgevoerd door standaard technieken (Moorhead et al., 1960). Dia ‘s voor de analyse van zusterchromatide-uitwisseling (SCE) en proliferatieindex (PI) werden verkregen uit parallelle culturen waaraan 5-Bromo-2’ – deoxyuridine (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA; 10 mg / mL) werd toegevoegd naast 2-CdA. Differentiële zusterchromatidekleuring werd verkregen door de fluorescentie plus Giemsa – techniek, waarbij gebruik werd gemaakt van Hoechst 33258 (Calbiochem-Behring Corp.; 0,05 mg/mL Hank ‘ s oplossing) en 5% Giemsa (Merck). Deze methode is een wijziging van die gepubliceerd door Korenberg en Freedlender (1974) en Perry en Wolff (1974). De dia ‘s werden’ s nachts blootgesteld aan wit licht. Metafasepreparaten met 46 ± 1 chromosomen werden in een blinde test geanalyseerd. De chromosomen werden schematisch getekend voor SCE scoring, evenals voor ca analyse.

behandelingsprotocollen

2-CdA behandeling van lymfocytculturen in verschillende fasen van de celcyclus

chromosomale afwijkingen (CAs)

na zeven uur na aanvang van de kweek (G1-fase) werden de lymfocytculturen behandeld met 2-CdA gedurende 1 uur bij 37 °C in kweekmedium zonder serum. De cellen werden bevestigd 52 h na de initiatie van cultuur. Na behandeling met 2-CdA werden de cellen tweemaal gewassen in serumvrij medium en gereïncubeerd in volledig medium. Voor behandeling in S-fase werden 24 h-culturen gedurende 6 uur behandeld met 2-CdA. De cellen werden tweemaal gewassen in serumvrij medium, gereïncubeerd in volledig medium en gefixeerd na 52 uur incubatie. Voor G2phase behandeling werden 69 h-culturen behandeld met 2-CdA gedurende 3 uur, en de cellen werden gefixeerd na 72 H van incubatie. Colchicine (Merck 0,016%) werd 1,5 uur voor fixatie toegevoegd. Om de MI te bepalen, werden 1000 cellen gescoord per cultuur, en 100 metafasen van elke cultuur werden geanalyseerd voor CA, in totaal 6000 cellen en 600 metafasen, respectievelijk, voor elke behandeling.

Zusterchromatid exchanges (SCEs)

Lymfocytculturen van 4 gezonde donoren (twee vrouwtjes en twee mannetjes) werden behandeld met 5-BrdU (10 µg/mL) in het begin van de incubatie, en toen de cellen de G1-fase bereikten (7 uur na het starten van de kweek), werd 2-CdA plus 5-BrdU toegevoegd gedurende 1 uur bij 37 °C in kweekmedium zonder serum. Na de behandeling werden de cellen tweemaal gewassen in serumvrij medium, werd 5-BrdU opnieuw toegevoegd en vervolgens werden de cellen gereïncubeerd in volledig medium. Voor de behandeling in de S-fase werden 24 h-culturen gedurende 6 uur behandeld met 2-CdA plus 5-BrdU in serumvrij medium. na de behandeling werden de cellen tweemaal gewassen in serumvrij medium en gereïncubeerd in volledig medium met 5-BrdU. Voor de analyse van SCE en PI werden de cellen (de fasen G1 en S) 72 h na de initiatie van cultuur vastgesteld. Vijftig tweede-delingsmetafasen per cultuur werden gescoord voor SCE, en honderd metafasen van elke cultuur werden gescoord voor de eerste, tweede en derde celdeling, in totaal 200 metafasen en 400 cellen per behandeling, respectievelijk. De PI werd verkregen met behulp van de volgende vergelijking:

PI =

waarbij M1 en M3 respectievelijk de getallen van de eerste en derde delingstransfasen zijn (Degrassi et al., 1989).

Dieren

de gebruikte dieren waren BALB / c-muizen (mus musculus), afkomstig van het dierenhuis van de Geneeskundeschool van Ribeirão Preto.

in vivo test op Balb/C-muizen beenmergcellen

muizen met een gewicht van ongeveer 30 g (5-6 weken) werden verdeeld in groepen van 8 Dieren (4 mannetjes en 4 vrouwtjes) en behandeld met Intraperitoneale injectie met 0.5 mL / eindvolume 2 – CDA-oplossing verdund met gedestilleerd water in de volgende concentraties: 0,25, 0,375 en 0,5 mg / kg lichaamsgewicht. Tweeëntwintig uur na de behandeling (d.w.z. twee uur voor het offeren) werden de muizen geïnjecteerd met 0,3 mL/eindvolume van een 1% colchicine-oplossing (Sigma) en 2 uur later gedood door etherinhalatie. De negatieve controlegroep kreeg gedestilleerd water 0,5 mL / eindvolume / dier en de positieve controlegroep kreeg cyclofosfamide (CP), 25 mg/kg lichaamsgewicht. Beenmergpreparaten voor metafasecellen werden met de Standaardtechniek verkregen (Ford And Hamerton, 1956). Dia ‘ s werden geanalyseerd in een blinde test en 100 metafasen per dier werden schematisch getekend. De MI werd verkregen door het aantal mitotische cellen te tellen in 1000 cellen geanalyseerd per dier, en 100 cellen werden gescoord voor CA.

statistische analyse

eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd uitgevoerd op het aantal abnormale metafasen en het totale aantal CA, MI, SCE ‘ s en PI, met berekeningen van de p-waarden voor elke fase van de celcyclus. Wanneer p < 0.05 werd gevonden, de gemiddelde waarden van elke behandeling werden vergeleken door de Student-Newman Keuls test. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van de softwarepakketten van Sigma Stat (Jandel Corporation).

resultaten

Humane lymfocyten

perifere bloedlymfocyten werden behandeld met verschillende concentraties (10, 20 en 40 mg/mL) van 2-CdA in de G1 -, S-en G2-fasen van de celcyclus. Chromosomale afwijkingen (CA) en mitotische index (MI) werden geanalyseerd in behandelde lymfocyten van zes gezonde individuen (drie vrouwen en drie mannen) (Tabel 1). Voor de cellen die tijdens de S-fase werden behandeld, werd een significante toename van de CA-frequenties (p < 0,05) waargenomen bij alle concentraties, in vergelijking met de controlefrequenties. De meest voorkomende soorten chromosomale afwijkingen die werden waargenomen, waren chromatide en isochromatide hiaten (gegevens niet weergegeven) en breuken, gevolgd door dubbele minuten, dubbele fragmenten en enkele fragmenten. Voor cellen die tijdens de G1-en G2-fase werden behandeld, vertoonden de CA-frequenties geen statistisch significant verschil tussen de behandelde culturen en de controlewaarden. Hoewel er een lichte variatie was voor het MI, werd bij geen van de behandelingen een statistisch significant verschil (p < 0,05) waargenomen in relatie tot de controle-indexen.

de gemiddelde frequenties van zusterchromatide-uitwisseling (SCE) en proliferatieindex (PI) werden bepaald in vier controlegroepen en in lymfocytculturen die tijdens de G1-en S-fasen met 2-CdA werden behandeld in culturen die na 72 uur werden geoogst (Tabel 2). De geteste concentraties (10, 20 en 40 mg / mL) veroorzaakten geen significante toename van de gemiddelde frequentie van SCE ‘ s, noch veranderden zij de PI van de cellen tijdens de G1-en S-fasen (Tabel 2).

balb / C muizen beenmerg systeem

CA en MI frequenties werden geanalyseerd in beenmergcellen van 8 Balb/c muizen (4 vrouwtjes en 4 mannetjes) na intraperitoneale behandeling met 0,25, 0,37 en 0,50 mg / kg L.G. van 2-CdA (Tabel 3). In de in vivo assay vertoonde 2-CdA voor geen van de geteste doses cytotoxische effecten wat betreft CA-frequenties en MI-waarden, wanneer alle behandelingsgroepen werden vergeleken. De meeste afwijkingen waren chromatid-type breuken. Voor de geanalyseerde parameters werd geen significant verschil (p < 0,05) tussen de dieren of tussen mannetjes en vrouwtjes gevonden.

discussie

de afgelopen jaren hebben verscheidene studies het antiproliferatieve effect aangetoond van de geneesmiddelen die worden gebruikt bij de behandeling van lymfoïde maligniteiten. 2-CdA is een basisanaloog die in chemotherapie voor een bepaald soort leukemie wordt aangewend, de harige celleukemie. Er zijn ook enkele gegevens die aantonen dat 2-CdA kan worden gebruikt in combinatie met andere geneesmiddelen, in de behandeling van refractair en recidiverend low-grade non-Hodgkin lymfoom (NHL) (Laurencet et al., 1999; Robak et al., 1999). In het huidige werk werd een cytogenetische studie in vitro uitgevoerd om het clastogene potentieel van 2-CdA in humane lymfocyten met betrekking tot de inductie van CA en SCE te evalueren. Volgens Moore and Bender (1993) kan structureel CAs leiden tot verlies van chromosomaal materiaal. Het soort gevormd CA hangt af van de aard van de laesie geïnduceerd in het DNA en de celcyclus fase waarin de cellen werden blootgesteld (Natarajan et al., 1996).

Lymfocytculturen werden behandeld met drie concentraties van 2-CdA (10, 20 en 40 mg/mL) gedurende verschillende fasen van de celcyclus. Het clastogene effect van het geneesmiddel werd aangetoond door de significante toename (p < 0,05) van de CA-frequenties voor alle geteste concentraties tijdens de S-fase van de celcyclus. Voor behandeling tijdens deze fase werd 2-CdA gedurende 6 uur in de culturen gelaten. Voor stoffen die in een specifieke fase van de celcyclus werken, kan de volgorde van toediening de werkzaamheid en toxiciteit van een combinatietherapie bepalen (Smorenburg et al., 2001).

deze resultaten komen overeen met die welke door andere auteurs zijn gerapporteerd (Carson et al., 1983), die voorstellen dat 2-CdA in DNA wordt opgenomen die enig-bundelbreuken (SSBs) produceren. SSBs kunnen zowel direct ontstaan, door het uiteenvallen van beschadigde suikers, als indirect, via enzymatische splitsing van de fosfodiëster backbone. Directe SSBs ontstaan hoofdzakelijk uit een aanval door vrije radicalen zoals reactieve zuurstofspecies, terwijl indirecte SSBs hoofdzakelijk normale tussenpersonen van de reparatie van de DNA-basisuitsnijding (BER) zijn. SSBs zijn ook de meest voorkomende laesies veroorzaakt door exogene genotoxines zoals ioniserende straling, alkylerende middelen, en de topo1 poison camptothecin en zijn antikankerderivaten (Caldecott, 2004).

sommige rapporten tonen aan dat de basisanaloog een langere periode nodig heeft voordat fosforylering optreedt (Gandhi et al., 1997). Dit mechanisme kan de verhoogde frequentie van totale chromosomale afwijkingen tijdens de S-fase van de celcyclus verklaren. Hetzelfde mechanisme komt voor in cellen behandeld met mitomycine C, Een S-afhankelijke verbinding, die DNA-replicatie vereist om DNA-schade om te zetten in chromosomale aberraties (Evans en Scott, 1964; Traganos et al., 1980). Andere antitumorale middelen vertegenwoordigen hetzelfde mechanisme en werking van 2-CdA, zoals fludarabine en 1-b-D-arabinosylcitosine (ara-C).Cytotoxische nucleosideanalogen hebben een brede klinische toepassing. Zij behoorden tot de eerste chemotherapeutische middelen die worden gebruikt bij de behandeling van kwaadaardige ziekten. De nucleosiden tegen kanker omvatten analogen van fysiologische pyrimidine en purinenucleosiden. Deze stoffen werken als antimetabolieten, concurreren met natuurlijke nucleosiden tijdens de DNA-of RNA-synthese en als remmers van sleutelcelenzymen (Szafraniec et al., 2004), zijn s-specifiek, en moeten gefosforyleerd zijn om trifosfaten te activeren (Plunkett et al., 1980). Tijdens de S-fase van de celcyclus, wanneer het genetische materiaal wordt gedupliceerd door de DNA-replicatiemachines, zijn de cellen bijzonder kwetsbaar voor genotoxische belediging. Terwijl de G1-en G2 / M-controlepunten de progressie van de celcyclus op welomschreven punten door de remming van cycline-afhankelijke kinasen arresteren, zijn de intra-S-fase-controlepunten gekend om op om het even welk ogenblik binnen de S-fase voor te komen en veelvoudige signalerende wegen impliceren (Sidorova en Breeden, 2003; Andreassen et al., 2003)

het is zeer belangrijk om het mechanisme van drugrespons tijdens verschillende fasen van de celcyclus te analyseren. Het hoge niveau van chromosomale laesie kan te wijten zijn aan de cytotoxiciteit van 2-CdA veroorzaakt door de omzetting ervan in 2-CdATP, die remming van DNA-synthese en DNA-herstel induceert, waarbij de enzymen ribonucleotide-reductase en DNA-polymerasen betrokken zijn. Deze verbinding vertoont weerstand tegen adenosine deaminase (ADA) activiteit, die wordt verleend door een chlooratoom en de vervanging van waterstof op positie 2 van de purine ring adenosine (Baltz en Montello, 1993).

SCE ‘ s worden vaak beschouwd als een parameter voor de beoordeling van Genotoxiciteit, omdat hun frequentie duidelijk wordt verhoogd door blootstelling aan vele mutagene en carcinogene chemische stoffen. In het huidige experiment gaven de frequenties van SCE ‘ s in met 2-CdA behandelde culturen een lichte toename ten opzichte van controleculturen. De tijdens beide fasen waargenomen toename varieerde niet significant.

aangezien veel geneesmiddelen worden geactiveerd nadat ze zijn gemetaboliseerd, worden in vivo mutageniciteitstests aanbevolen om de clastogene activiteit te beoordelen van die verbindingen die metabole activering vereisen. Een dergelijke aanpak biedt ook soortgelijke voorwaarden als die gevonden in de mens (Legator and Ward Jr., 1991). Hoewel er verschillen zijn tussen knaagdieren en mensen, wordt aanbevolen om elke beoordeling te baseren op zowel in vitro als in vivo studies, en niet alleen op een van beide (Huggett et al., 1996).

in deze studie werd het clastogene effect van 2-CdA ook geanalyseerd in beenmergcellen van BALB/c-muizen in concentraties van 0,25, 0,375 en 0,5 mg/kg lichaamsgewicht. De resultaten toonden aan dat 2-CdA niet efficiënt was voor het veroorzaken van chromosoomafwijkingen. Het gebrek aan effect in vivo kan te wijten zijn aan de beperkte hoeveelheid 2-CDA beschikbaar, omdat het werd gedoneerd in verdunde omstandigheden. Genotoxische effecten van het analoge gemcitabine van de basis zijn gemeld in beenmergcellen van muizen met behulp van de micronucleus-en chromosoomafwijkingstestsystemen. Aydemir en Bilaloglu (2003) toonden aan dat gemcitabine geen significante CAs induceerde en geen vermindering van MI veroorzaakte tijdens een 6-uur behandelingsperiode bij doses van 2,0, 4,0 en 8,0 mg / kg L. G. , in vergelijking met de negatieve controle; daarentegen was de frequentie van totaal CAs significant verhoogd door gemcitabine (p < 0,0001) na een behandelingsperiode van 24 uur met dezelfde doses.Concluderend kan worden gesteld dat 2-CdA een clastogeen effect vertoonde in humane lymfocytenculturen die in vitro werden behandeld tijdens de S-fase van de celcyclus, maar er werd geen significant clastogeen effect waargenomen in cellen die werden behandeld tijdens de G1-en G2-fase. In de in vivo test bij muizen vertoonde 2-CdA geen clastogeen effect bij de geteste dosisniveaus.

Dankbetuigingen

we zijn Prof. Dr. A. T. Natarajan, Dr. Elza T. Sakamoto Hojo en Dr. Lusania G. Antunes voor waardevolle opmerkingen over het manuscript en aan de Heer Luiz Augusto da Costa Jr., de Heer Silvio A. dos Santos en mevrouw Sueli A. Neves voor waardevolle technische bijstand. CAPES and FAPESP process n. 99/10643-7 ondersteunde dit onderzoek. De Onderzoeksethiekcommissie keurde het project goed (proces: CONEP n. 25000.074430 / 2001-88).Andreassen PR, Lohez OD and Margolis RL (2003) G2 and spindle assembly checkpoint adaptation, and tetraploidy arrest: Implications for intrinsic and chemically induced genomic instabiliteit. Mutat Res 532: 245-53.

Aydemir N en Bilaloglu R (2003) Genotoxiciteit van twee middelen tegen kanker, gemcitabine en topotecan, in beenmerg van muizen in vivo. Mutat Res 537: 43-51. Baltz JK and Montello MJ (1993) Cladribine for the treatment of hematologic malignancies. Klinische Farmacie 12: 805-813.

Caldecott KW (2004) DNA single-strand breaks en neurodegeneratie. DNA Repair (Amst) 3:875-82. Carson DA, Wasson DB, Taetle R and Yu A (1983) Specific toxicity of 2-chlorodeoxyadenosine towards resting and proliferating human lymphocytes. Bloed 62: 737-743. Degrassi F, de Salvia R, Tanzarella C and Palitti F (1989) Induction of chromosomal aberrations and SCE by camptothecin, an inhibitor of mammalian topoisomerase I. Mutat Res 211:125-130. Evans HJ and Scott D (1964) Influence of DNA synthesis on the production of chromatid aberrations by X-rays and maleic hydrazide in Vicia faba Genetics 49:17-38. Ford CE and Hamerton JL (1956) A colchicine hypotonic citrate squash sequence for mammalian chromosomes. Technol 3: 247-251.

Galmarini CM, Mackey JR en Dumontet C (2001) Nucleoside-analogen: Mechanismen van geneesmiddelenresistentie en omkeringsstrategieën. Leukemie 15: 875-890. Gandhi V, Huang P, Chapman AJ, Chen F and Plunkett W (1997) Incorporation of fludarabine and 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine 5 ‘ trifosfates by DNA polymerase alpha: Affinity, interaction and consequences. Clin Cancer Res 3: 1347-1355. Genini D, Adachi s, Chao Q, Rose DW, Carrera CJ, Cottam HB, Carson DA en Leoni LM (2000) deoxyadenosine-analogen induceren geprogrammeerde celdood in chronische lymfatische leukemiecellen door het DNA te beschadigen en de mitochondriën direct te beïnvloeden. Bloed 96:3537-3543.

Huggett AC, Schilter B, Roberfroid M, Antignac E and Koeman JH (1996) Comparative methods of toxicity testing. Voedsel Chem Toxicol 34: 183-92. Korenberg JR en Freedlender EF (1974) Giemsa technique for the detection of sister chromatid exchanges. Chromosoom 48: 355-360.

Laurencet FM, Zulian GB, Guetty-Alberto M, Iten PA, Betticher DC en Alberto P (1999) Cladribine with cyclofosfamide and prednison in management of low-grade lymphoproliferative malignancies. Br J Haematol 79: 1215-1219. Legator MS and Ward Jr JB (1991) Use of in vivo genetic toxicity data for risk assessment. Mutat Res 250: 457-465. Liliemark J and Juliusson G (1994) 2-chloor-2′-deoxyadenosine-klinische, biochemische en farmacokinetische overwegingen. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 42: 7-10.

Mathew s, Lorsbach RB, Shearer P, Sandlund JT en Raimondi SC (2000) Double minute chromosomen en c-MYC amplificatie in a child with secondary myelodysplastic syndrome after treatment for acute lymfoblastic leukemie. Leukemie 14: 1314-5.

Moore RC and Bender MA (1993) Tijdsequentie van gebeurtenissen die leiden tot chromosomale aberratievorming. Environ Mol Mutagen 22: 208-213. Moorhead PS, Nowell PC, Mellman WJ, Battipps DM and Hungerford DA (1960) Chromosoompreparaat van leukocyten gekweekt uit perifeer bloed. Exp Cel Res 20: 613-616.

Natarajan AT, Balajee AS, Boei JJ, Darroudi F, Dominguez I, Hande MP, Meijers M, Slijepcevic P, Vermeulen S and Xiao Y (1996) Mechanisms of induction of chromosomal aberrations and their detection by in situ hybridization. Mutat Res 372: 247-58. Perry PE and Wolff s (1974) nieuwe Giemsa-methode voor differentiële kleuring van zusterchromatiden. Natuur 251: 156-158. Plunkett W, Chubb S, Alexander L and Montgomery JA (1980) Comparison of the toxicity and metabolism of 9-b-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine and 9-B-D-arabinofuranosyladenine in human lymfoblastoid cells. Kanker Res 40: 2349-55. Pott-Hoeck C and Hiddemann W (1995) Purine analogen in the treatment of low-grade lymphomen and chronic lymphocytic leukemias. Ann Oncol 6: 421-433.

Preston RJ, Dean BJ, Galloway S, Holden h, McFee AF en Shelby M (1987) Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analyse van chromosoomafwijkingen in beenmergcellen. Mutat Res 189: 157-65. Robak T (2001) Cladribine in the treatment of chronic lymphocytic leukemie. Leuk Lymfoom 40: 551-564. Robak T, Góra-Tybor J, Urbanska H en Krikowski E (1999) Combination regimen of 2-chlorodeoxyadenosine (cladribine), mitoxantron and dexamethason (CMD) in treatment of refractair and recurrent low-grade non-Hodgkin lymphoma. Wat Een Prachtige Foto ‘ S. Robertsson LE, Chubb S, Meyn RE, Story M, Ford R, Hitelman WN and Plunkett W (1993) Induction of apoptosis cell death in chronic lymphocytic leukemia by 2-chloro-2’-deoxyadenosine and 9-b-D-arabinosyl-2-fluoradenine. Bloed 81: 143-150.

Schrimer M, Mur E, Pfeiffer KP, Thaler J en Konwalinka G (1997) The safety profile of low-dose cladribine in refractaire reumatoïde artritis. Een proef. Scand J Rhematol 26: 376-379.

Sidorova JM and Breeden LL (2003) Precocious G1/S transitions and genomic instabiliteit: The origin connection. Mutat Res 532: 5-19.

Smorenburg CH, Sparreboom A, Bontenbal M and Verweij J (2001) Combination chemotherapy of the taxanes and antimetabolites: Its use and limitations. EUR J Cancer 37: 2310-23. Szafraniec SI, Stachnik KJ and Skierski JS (2004) New nucleoside analogs in the treatment of hematological disorders. Acta Pol Pharm 61: 223-32. Tallman MS, Hakimian D, Hogan D and Petersen L (1993) 2-Chlorodeoxyadenosine in the treatment of hairy cell leukemie (HCL): Detection of minimal residual disease (MRD) by immunostaining (IS). Gepresenteerd op het 8e Symposium over de moleculaire biologie van hematopoiese in Bazel, 9-13 juli.

Tallman MS, Hakimian D, Variakojis D, Koslow D, Sisney GA, Rademaker AW, Rose E en Kaul K (1992) een enkele cyclus van 2-chlorodeoxyadenosine resulteert in volledige remissie bij de meerderheid van de patiënten met de haarcelleukemie. Bloed 80: 2203-2209. Traganos F, Staiano-Coico L, Darzynkiewicz Z en Melamed MR (1980) Effects of ellipticine on cell survival and cell cycle progression in cultured mammalian cells. Kanker Res 40: 2390-2399.

Zwaan MC, Kaspers GJL. Pieters R, Hählen K, Huismans DR, Zimmermann M, Harbott J, Slater RM, Creutzig U and Veerman AJP (2002) Cellular drug resistance in childhood acute myeloid leukemie is related to chromosomal abnormalities. Bloed 100: 3352-3360.