Clothianidin-zaadbehandeling heeft geen aantoonbare negatieve impact op bijenkolonies en hun pathogenen

onderzoeksopzet

in 2013 werden in totaal 16 velden (8,9 ± 5,4 ha; gemiddelde ± s.d.) in Zuid-Zweden, bestemd voor voorjaarszaaizaad (Brassica napus L.) gekoppeld volgens geografische nabijheid (maar gescheiden door >4 km) en landgebruik (vijg. 1, zie hierboven). Het omringende landschap werd onderzocht op de afwezigheid van bloeiende gewassen. In 2013 bleven echter twee velden in het onderzoek, ook al was er een ander koolzaadveld in de buurt, om zoveel mogelijk boerderijparen te behouden34. In elk bedrijfspaar werd een veld willekeurig toegewezen om te worden ingezaaid met met clothianidine behandeld koolzaad, terwijl het andere veld werd gezaaid met zaden die niet met clothianidine waren behandeld (behandeld: 8; controle: 8). Dezelfde gekoppelde boerderijen werden gebruikt in 2014, maar met de behandelingen omgekeerd, dat wil zeggen, locaties met behandelde velden in 2013 hadden controlevelden in 2014 en vice versa (behandeld: 6; Controle: 4). Als gevolg van vruchtwisseling werden in 2013 en 2014 verschillende velden binnen elk bedrijf gebruikt (Fig. 1, zie hierboven). Om Fig. 1, hebben we een kaart gedownload van de World Borders Database (hier te downloaden: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

informatie over omringende landschapsvariabelen voor de verschillende bedrijven in 2014 is opgenomen in aanvullende tabel 7. In 2014 had de helft van de focal fields extra in het voorjaar ingezaaid koolzaad (1-13 ha) binnen een straal van 2 km. De met clothianidin behandelde zaden voor de focale velden werden bedekt met Elado, een handelsmerk mix van twee actieve ingrediënten: clothianidine (400 g l-1) en β-cyfluthrin (+80 g l−1), die voor deze studie zijn gekozen omdat het in Zweden en andere delen van Europa de belangrijkste insecticide-zaadbehandeling was in koolzaad.63 Clothianidin wordt door de plant opgenomen en systemisch verdeeld over alle delen ter bescherming tegen insecten64. β-Cyfluthrin wordt niet als systemisch beschouwd en er werden geen residuen gevonden in monsters die in deze studie werden verzameld34. Zowel met clothianidine behandelde als met controlezaden werden in 2013 gecoat met het fungicide thiram.

de deelnemende landbouwers kregen de instructie geen andere neonicotinoïden in de velden te gebruiken tijdens het onderzoek, hoewel andere insecticide bladsprays, voornamelijk Plenum (pymetrozine), Avaunt/Steward (indoxacarb) en Mavrik (Tau-fluvalinaat; ook gebruikt als varroazide in de bijenteelt) werden gebruikt voor ongediertebestrijding (aanvullende tabel 8). Biscaya, handelsnaam voor een spray formulering die de neonicotinoôde thiacloprid bevat, werd echter toegepast op één controleveld in 2013, gevolgd door een Mavrik spray 1 week later, en op één behandeld veld in 2014, bij beide gelegenheden op 0,3 l ha−1. Thiacloprid heeft een aanzienlijk lagere acute toxiciteit voor bijen dan clothianidin65 en alleen sporen van thiacloprid werden gedetecteerd in de pollen, nectar en bij monsters in 2013 en geen in 2014. Terwijl Rundlöf et al.34 geen verandering in de resultaten waar te nemen wanneer velden waar Biscaya werd toegepast werden uitgesloten van de analyses, ontdekten we een aantal kwalitatieve veranderingen (aanvullende tabel 9). Deze veranderingen kunnen het gevolg zijn van de hogere residuen van thiacloprid in 2014, maar kunnen net zo goed geen verband houden met Biscaya, maar eerder met het verschil tussen de Biscaya/Mavrik en de alternatieve insecticide spraycombinaties die worden gebruikt34 of met een verminderd statistisch vermogen.

Honingbij kolonies

honderd en zestien honingbij kolonies waren bereid aan het einde van Mei 2013 door een professionele imker in één full-size Langstroth kasten met twee kammen met voornamelijk verzegeld broed (bij bijen), twee volle honingraten (bij bijen), een getrokken uit lege kam, vijf kammen met wax stichting, bijen geschud uit twee kammen en een 1-jaar-oude (84 experimentele kolonies) of 2-jarig (12 experimentele kolonies plus 20 reserve kolonies) koningin van de bekende afdaling te produceren voor relatief kleine, even grote (3418 ± 123 volwassen bijen; gemiddelde ± s.e.m.; n = 96 kolonies) kolonies met veel ruimte voor groei die sterk genoeg zouden kunnen worden om de komende winter te overleven, maar niet ontgroeien hun ruimte in de zomer. Tussen 14 en 28 juni 2013 werden zes experimentele kolonies langs de veldrand geplaatst in elk van de 16 koolzaadvelden (in totaal 96 kolonies) bij het begin van de bloei van koolzaadzaad (aanvullende Fig. 1). De afstamming en leeftijd van de koningin werden vergeleken tussen boerderijparen, maar kolonies werden anders willekeurig verdeeld. Kolonies werden gehouden op een 60 ha biologisch beheerd winterkoolzaad veld in volle bloei alvorens te worden geplaatst op de 16 experimentele velden (aanvullende Fig. 1) om ervoor te zorgen dat de koloniegroei vóór het experiment zoveel mogelijk gebaseerd was op pesticidenvrij foerageren.

toen de bloei van koolzaad in het experimentele veld was gestopt, werden de kolonies verplaatst tussen 2 en 31 juli (aanvullende Fig. 1) naar een gemeenschappelijke bijenstal te overwinteren. Op 10 augustus kregen de kolonies een mierenzuurdampbehandeling tegen varroamijt, bestaande uit 20 ml 60% mierenzuur gedrenkt in een platte huishoudspons, geplaatst onder de binnenbekleding bovenop de frames. De kolonies kregen in totaal 20 kg suiker per kolonie in de vorm van een 55-60% V/v sucrose–oplossing, geleverd in een voederbox gedurende drie gelegenheden in augustus-September 2013. Op 4 December werd een extra lichte Varroa-behandeling uitgevoerd door tussen de frames 30 ml 2,6% oxaalzuur in 60% sucrose rechtstreeks op de bijenhoop te strooien. In het voorjaar van 2014 werden kolonies verplaatst naar een biologisch beheerd koolzaadveld voordat ze werden geplaatst op de 10 in het voorjaar ingezaaide koolzaadvelden (aanvullende Fig. 1). Kolonies werden overwogen voor opname in het 2014 deel van de studie als ze hadden een 2-jarige, ei-leggende koningin in April 2014 (met uitzondering van kolonies die stierven, re-queened of had 3-jarige koninginnen in April 2014) en had niet zwermen door het begin van juni 2014. Deze beperkingen, naast de eis dat kolonies gedurende beide jaren van het experiment aan clothianidin zouden worden blootgesteld/onbelicht, betekenden dat in 2014 slechts vier kolonies aan elk veld konden worden toegewezen. Kolonies geplaatst door behandelde velden in 2013 werden opnieuw geplaatst door behandelde velden in 2014, om de cumulatieve effecten van meerjarige blootstelling aan clothianidine te beoordelen, maar werden anders opnieuw gerandomiseerd voorafgaand aan plaatsing om onbedoelde vooroordelen te minimaliseren. Toch moesten in 2014 twee controlekolonies uit 2013 door een met clothianidine behandeld veld worden geplaatst, omdat er voor de zes met clothianidine behandelde velden onvoldoende gekwalificeerde blootgestelde kolonies waren. Er waren genoeg kolonies beschikbaar voor de vier controlevelden. De sterkte van kolonies werd gelijk gesteld zoals beschreven voor 2013, maar alleen binnen elke behandelingsgroep. De kolonies werden gereduceerd en een tweede keer gelijk gemaakt (8 juni 2014), nadat sommige van hen te groot werden en probeerden te zwermen (aanvullende Fig. 1). Elke verkleinde kolonie bestond uit 1 volle honingkam( met bijen), 3 kammen met voornamelijk verzegeld broedsel (met bijen), en de originele koningin uit 2013 en 6 kammen met wasfundering. Kolonies zijn tussen 16 en 25 juni 2014 verplaatst naar de voorjaarszaadvelden en tussen 14 en 22 juli 2014 teruggebracht naar de gemeenschappelijke overwinteringslocatie (aanvullende Fig. 1).

Residuanalyses

om de blootstelling aan clothianidine te bevestigen, werden 24 volwassen honingbijen per veld dat bij de ingang van de bijenkast werd gevangen, pollenpellets verzameld van 5 honingbijen die foerageren in de koolzaadvelden en nectar verwijderd uit de magen van 5 nectar-foeragerende honingbijen in de koolzaadvelden op elke locatie geanalyseerd op clothianidineresiduen. Pollen (> 25 ml) werden verzameld met behulp van pollenvallen, die gedurende 1 dag op drie kolonies per locatie werden geplaatst en werden geanalyseerd op de oorsprong van plantensoorten. De monsters werden behandeld en geanalyseerd zoals in Rundlöf et al.34 en verzameld tijdens de piek bloei beoordelingen in beide jaren (aanvullende Fig. 1), waarbij de concentraties van clothianidine en vier andere neonicotinoôden die in Zweden worden gebruikt (aanvullende tabel 2) gekwantificeerd zijn met vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) en pollen die zijn geïdentificeerd met behulp van lichtmicroscopie en een pollenreferentiebibliotheek (zie aanvullende tabel 2 voor detectielimieten en kwantificeringsgrenzen). Voor verdere analyses van de variatie in neonicotinoïde blootstelling van honingbijen op verschillende locaties, verzamelden we 12 honingbijen per locatie vanaf de ingang van de Bijenkorf. Deze bemonstering werd gedaan op drie met clothianidine behandelde locaties in 2013. Nectar werd gewonnen uit de honingmaag van de verzamelde bijen. De concentraties clothianidine werden vervolgens gekwantificeerd in zowel nectar-als bijenweefsel voor elk bij afzonderlijk. Meer details over de steekproefbehandeling voor verschillende matrices, LC-MS/MS-methode en kwaliteitscontroles worden gegeven in aanvullende methoden.

Kolonieontwikkeling, re-quening en honingproductie

honingkolonieontwikkeling werd beoordeeld door dezelfde opgeleide waarnemer en één assistent. De aanwezigheid van een leggende koningin werd vastgesteld, evenals de aanwezigheid van koningin cellen. Als een re-queening gebeurtenis gepaard ging met een groot verlies van volwassen bijen, werd het geacht te hebben zwermd. Als er geen verlies van volwassen bijen werd waargenomen, werd de kolonie geacht opnieuw koning te zijn geworden door supersedure. De productie en ontwikkeling van de honingkolonies werd bepaald door de kolonies te wegen en door de koloniesterkte te beoordelen met behulp van de Liebefeld-methode 66, als het totale aantal volwassen bijen en de oppervlakte van het afgedekte broedsel over alle frames. Het aantal volwassen bijen werd geschat door honingbijen te tellen aan beide zijden van de 10 frames. Het aantal afgetopte broedcellen (hoeveelheid broedsel) werd bepaald door het aandeel gesloten broedseldekking te vermenigvuldigen met 2700, het aantal cellen aan één zijde van de gebruikte frames. De kolonies werden gewogen tijdens de beoordeling vóór en na blootstelling (met behulp van een METTLER TOLEDO bench scale die tot 32 kg kan wegen met een nauwkeurigheid van 1 g), om de honingproductie te schatten. Volle honingframes werden vervangen door lege frames tijdens de koolzaadbloei, zodat de kolonie kon groeien en zwermen kon verminderen. Zowel de volle als de lege frames werden gewogen om bij de berekening van de honingproductie in aanmerking te worden genomen. Bij de beoordeling na blootstelling zijn zoveel mogelijk honingframes verwijderd (maximaal 10% van het met overdekt broedgebied) om de honingoogst van de imkers te simuleren. Op 6-17 juni 2013 en 9-11 juni 2014 zijn de beoordelingen vóór de blootstelling verricht op het biologisch beheerde in de winter ingezaaide koolzaadveld, en op 29 juli tot en met 9 augustus 2013 en 28-31 juli 2014 zijn de beoordelingen na de blootstelling verricht op de gemeenschappelijke overwinteringsbijenstal (aanvullende Fig. 1). Verder werd in April 2014 een voorjaarskoloniesterktebeoordeling uitgevoerd door het totale aantal volwassen bijen en het aantal afgetopte broed te schatten (aanvullende Fig. 1). De colony assessor en assistenten werden verblind tijdens het verzamelen van gegevens met betrekking tot het behandelingsschema van de velden.

verzameling en verwerking van monsters van pathogenen en parasieten

monsters van ongeveer 100 volwassen honingbijen zijn uit elke kolonie genomen tijdens de pre-en postblootstellingsbeoordelingen in de met clothianidine behandelde en controle experimentele koolzaadvelden in zowel 2013 als 2014 (aanvullend Fig. 1). Bijen werden uit de buitenste kam van elke kolonie genomen en bestonden daarom uit een mengsel van huisbijen en foeragerbijen67. Alle bijenmonsters werden bij -20 °C bewaard totdat het laboratoriumwerk werd uitgevoerd. De V. destructor besmettingsgraden voor elke kolonie werden bepaald door het wassen van de volwassen bijensteekproeven met zeepwater om de mites los te laten en te tellen68. De buikbuik van 60 volwassen honingbijen per kolonie (voor individuele kolonieanalyses) of per bijenstal (voor de samengevoegde kolonieanalyses van 2013, 10 bijen per kolonie) werd verwijderd en in een polyethyleen zak met een binnengaas (BioReba) geplaatst. De buikbuik werd in de zak vermalen met een stamper en 30 ml nucleasevrij (Milli-Q) water (0,5 ml per bij) werd grondig gemengd met het monster om een homogene suspensie te creëren. Verscheidene 1 ml aliquots van deze suspensie werden verwijderd en onmiddellijk ingevroren bij -80 °C voor DNA-en RNA-extractie en als toekomstig referentiemateriaal.

parasieten, pathogenen, symbiotische microben en immuungenen

de verzamelde bijenmonsters werden beoordeeld op een verscheidenheid aan pathogene en niet-pathogene parasieten en microben om de impact van kolonies op met clothianidine behandelde velden op hun prevalentie en abundantie te bestuderen. De organismen omvatten de alomtegenwoordige ectoparasiet Varroa destructor, 13 virussen: acute bee paralysis virus (ABPV), bladluis dodelijke verlamming virus (ALPV), de Big Sioux River virus (BSRV), black queen cell virus (BQCV), chronische bee paralysis virus (CBPV), deformed wing virus type-A (DWV-A), deformed wing virus (type B (DWV-B), het Israeli acute paralysis virus (IAPV), Kashmir bee virus (KBV), Meer Sinaï-virus 1 (LSV-1) en stam 2 (LSV-2), Sacbrood virus (SBV), langzaam bee paralysis virus (SBPV); twee gewone honingbij microsporidian darm parasieten (Nosema apis en Nosema ceranae) en twee symbiotische darmbacteriën (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola en Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Voor de 2013 monsters analyseerden we ook op bijenniveau de mRNA-niveaus van acht honingbijgenen (Amel/LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 en SPH51) waarvan de expressie eerder gekoppeld was aan pesticide, pathogeen en/of parasiet exposure19,44 en (sociale) immuniteit in honingbeeen45.

Nucleïnezuurextractie

DNA werd geëxtraheerd uit bijenhomogenaten met behulp van het protocol voor het extraheren van DNA uit Nosema-sporen69, dat voldoende robuust is om ook DNA uit bacteriën en andere micro-organismen te extraheren. In totaal werd 500 µl primair homogenaat van de bijen gedurende 5 minuten gecentrifugeerd in een microwants bij 13.000 toeren per minuut. De pellet werd herhaaldelijk bevroren-ontdooid met vloeibare stikstof en gemalen met een steriele Teflon microgestel tot verpulverd. De verpulverde pellet werd geresuspendeerd in 400 µl Qiagen plantenweefsels DNeasy AP1 lysis buffer met 4 µl RNAse-A (10 mg ml-1) en geïncubeerd en geschud gedurende 10 minuten bij 65 oC, waarna 130 µl P3 neutralisatiebuffer (3,0 M kaliumacetaat pH 5.5) werd toegevoegd, gevolgd door 5 min incubatie op ijs en centrifugeren gedurende 5 min bij 14.000 toeren per minuut om de lysis puin te verwijderen. DNA werd gezuiverd uit 500 µl van het supernatant door de QIAGEN geautomatiseerde qiacube-extractierobot, volgens het dneasy-Protocol van de plant en eluteerde het DNA in 100 µl nucleasevrij water. RNA werd door de qiacube-robot rechtstreeks uit 100 µl primair honingbijhomogenaat geëxtraheerd met behulp van het QIAGEN-Plant RNeasy-protocol (inclusief de Qia-shredder voor extra homogenisatie70) en het RNA werd geëlueerd in 50 µl nucleasevrij water. De geschatte nucleic acid concentratie werd bepaald door de NanoDrop, waarna de monsters werden verdund met nuclease-vrij water in een uniforme 10 ng pi−1 (DNA en LSV-1(RNA)) of 20 ng pi−1 (voor alle andere RNA-monsters) en opgeslagen bij -80 °C.

RT-qPCR en qPCR

De verschillende micro-organismen en de gastheer mRNA doelstellingen werden gedetecteerd en gekwantificeerd door Één Stap reverse transcriptie-kwantitatieve PCR (RT-qPCR) voor pathogenen met een RNA genoom en het immuunsysteem en het interne referentie gen mRNA slachtoffers, of door kwantitatieve PCR (qPCR) voor organismen met een DNA-genoom. Bijzonderheden van de analyses zijn opgenomen in de aanvullende tabel 10, de aanvullende Tabel 11 en de aanvullende tabel 12. De reverse primer voor Amel / LRR werd enigszins opnieuw ontworpen door Di Prisco et al.19 omdat de extreem hoge complementariteit tussen de oorspronkelijke voorwaartse en omgekeerde primers resulteerde in hoge niveaus van PCR artefacten domineren het kwantitatieve signaal. De reacties werden uitgevoerd in duplo, in reactievolumes van 20 µl (DNA) of 10 µl (RNA) met een sjabloon van 2 µl (DNA) of 1,5 µl (RNA), 0,4 µM (DNA) of 0.2 µM (RNA) van forward and reverse primer en ofwel de Bio-Rad Eva Green qPCR mix (DNA) of de Bio-Rad One-Step iTaq RT-qPCR mix met SYBR Green detection chemistry (RNA). De reacties werden geïncubeerd in 96-wells optische qPCR-platen in de Bio-Rad CFX connect thermocycler, met behulp van de volgende amplificatiecycli – profielen: 10 min bij 50 °C voor complementaire DNA-synthese (cDNA) (alleen RT-qPCR): 5 min bij 95 °C (om de reverse transcriptase te inactiveren en de Taq-polymerase te activeren) gevolgd door 40 cycli van 10 s bij 95 °C voor denaturatie en 30 s bij 58 °C voor ontharding, uitbreiding en gegevensverzameling. Voor DNA-tests werden de volgende amplificatiecyclusprofielen gebruikt: 2 min bij 98 °C voor de initiële denaturatie, gevolgd door 40 cycli van 5 s bij 98 ° C voor denaturatie en 10 s bij 60 °C Voor Primer gloeien, uitbreiding en gegevensverzameling. De amplificatiecycli werden gevolgd door een smeltkrommeanalyse om de specificiteit van de amplificatie te bepalen door de fluorescentie te lezen bij stappen van 0,5 °C van 65 °C tot 95 °C. opgenomen op elke reactieplaat waren positieve en negatieve (non-template) assay controles. Voor elk type test (aanvullende tabel 10, aanvullende Tabel 11 en aanvullende Tabel 12) werd een kalibratiekromme opgesteld door middel van een 10-voudige verdunningsreeks van een positieve controle van de bekende concentratie die 6 ordes van grootte bestrijkt, voor kwantitatieve gegevensconversie, waarbij het referentiesmelting-curveprofiel van het amplicon werd vastgesteld en de statistieken van de reactieprestaties werden geschat.

gegevensconversie en normalisatie

de smeltkrommen van individuele reacties werden visueel geëvalueerd om niet-specifieke versterkingen te scheiden, die in smelttemperatuurprofielen verschillen van echte cDNA/DNA-amplicons. Niet-specifieke versterkingen werden uit de dataset verwijderd. Alle analyses werden uitgevoerd in duplicaat, waarbij de gemiddelde waarde van deze twee duplicaten werd gebruikt in verdere berekeningen. Beide duplicaten moesten een positieve kwantitatieve waarde opleveren en de smeltkromme-analyse doorstaan voor de gegevens die in de dataset moesten worden opgenomen. De ruwe RT-qPCR gegevens van alle bevestigde versterkingen werden later omgezet in Geschatte exemplaaraantallen van elk doelrna, gebruikend de overeenkomstige kalibratiekromme voor de analyse. Deze gegevens werden vermenigvuldigd met de verschillende verdunningsfactoren gedurende de hele procedure om de geschatte kopieën van elk streefcijfer per Bee te berekenen69. Aangezien RNA gemakkelijk wordt gedegradeerd, is er een risico dat de verschillen tussen individuele steekproeven in de kwaliteit van RNA (d.w.z., degradatie) de resultaten kunnen beà nvloeden70. Om voor dit te corrigeren, werden de analyses van RT-qPCR voor mRNA van een gemeenschappelijk Honeybee intern verwijzingsgen (RP49) in werking gesteld op alle steekproeven. De gegevens voor de doelstellingen van RNA van belang werden toen genormaliseerd aan de gemiddelde waarde voor rp49 mRNA, waarbij de gegevens voor steekproef-specifieke verschillen in de kwaliteit van RNA met betrekking tot RT-qPCR performance70 worden gecorrigeerd.

statistische analyses

het aandeel van door honingbij verzamelde pollen afkomstig van koolzaad-achtige planten werd vergeleken tussen behandelingen (behandeling met clothianidine-zaad/onbehandeld) met behulp van een gegeneraliseerd lineair model, uitgaande van binominale distributie en correctie voor overdispersie. De clothianidine concentraties in nectar en pollen verzameld door honingbijen en in bijenweefsel werden vergeleken tussen behandelingen met Wilcoxon-Mann-Whitney tests. Om de concentraties van clothianidine in het bijenweefsel en nectar in individuele bijen tussen velden te vergelijken, gebruikten we variantieanalyses (ANOVA), met veldidentiteit als voorspeller. Bovendien waren de concentraties van clothianidine in het weefsel en het maaginhoud van de nectar van individuele bijen gerelateerd met behulp van een meervoudige lineaire regressie met veldidentiteit en concentratie van clothianidine in nectar als verklarende variabelen en concentratie van clothianidine in bijenweefsel als responsvariabele.

het onderzoek volgde in het algemeen een ontwerp van Before-After-Control-Impact (BACI), met een gepaarde veldstructuur, dat gedurende twee opeenvolgende jaren op kolonieniveau werd herhaald voor gegevens over kolonieontwikkeling en de prevalentie en abundantie van parasieten, pathogenen en darmbacteriën. De jaren 2013 en 2014 werden samen geanalyseerd in één volledig model, met zaadbehandeling, bloei, jaar en hun interacties als vaste factoren. Het effect van de clothianidin-behandeling werd beoordeeld aan de hand van de interactie tussen bloei en zaadbehandeling, aangezien deze term het verschil in verandering tussen behandelingen ten opzichte van de koolzaadbloei(s) weerspiegelt. Als de drieweginteractie (bloei × zaadbehandeling × jaar) significant was (d.w.z. als de variabele verschillend reageerde op de clothianidine-behandeling van het ene jaar op het andere), werd de dataset opgesplitst naar jaar en jaar werd als een vaste factor geschrapt. Bovendien werd de dataset slechts 1 jaar geanalyseerd als de gegevens bestonden uit een steekproefgrootte ≤10 in één jaar, zowel voor de prevalentie van microbiota als voor de abundantie (aanvullende tabel 1). Kolonies die zwermden (8 op controlevelden en 10 op met clothianidin behandelde velden in 2013; één op een controleveld en twee op met clothianidin behandelde velden in 2014) werden uitgesloten van de analyse, omdat zwermen een groot effect heeft op de kolonieontwikkeling. Ook uitgesloten is de enige kolonie die zijn koningin verloor tijdens transport voor veldplaatsing in 2013 (behandeld veld). Met uitzondering van kolonies die zwermden uit de analyse kwalitatief veranderde sommige resultaten (zie aanvullende tabel 13). Veranderingen in significantieniveau kunnen te wijten zijn aan verminderde statistische macht, willekeurige kans of biologische effecten.

lineaire modellen met gemengde effecten (LMM) werden gebruikt om het effect van de clothianidine-behandeling op de ontwikkeling van de kolonie te testen, gemeten als het aantal afgetopte broedcellen (hoeveelheid broedsel) en het aantal volwassen bijen. Zaadbehandeling (clothianidin of controle), bloei (voor of na koolzaad bloei), jaar (2013 of 2014) en hun interacties waren vaste factoren. Farm pair identity, farm identity en colony identity werden opgenomen als willekeurige factoren. De honingproductie werd vergeleken tussen behandelingen met behulp van een LMM met boerderijidentiteit en boerderijidentiteit als willekeurige factoren. Generalized linear mixed models (Glmm’ s) werden gebruikt om de invloed van de clothianidine behandeling op re-queening en mortaliteit van de kolonies met boerderij identiteit als een willekeurige factor te testen.

de invloed van de clothianidin-behandeling op de ontwikkeling van de voorjaarskolonie, gemeten als het aantal volwassen bijen en de hoeveelheid broedsel, werd getest met respectievelijk een LMM en een GLMM, met zaadbehandeling als vaste factor en de identiteit van het boerderijpaar en de boerderijidentiteit als willekeurige factoren. Voor het aantal afgetopte broedcellen gebruikten we een negatieve binomiale foutverdeling en logaritmische linkfunctie.

de microbioom-en Varroamijtgegevens werden geanalyseerd op zowel hun binomiale (aanwezigheid/afwezigheid) als kwantitatieve (abundantie) karakter, waarbij gebruik werd gemaakt van respectievelijk GLMMs (met binomiale foutdistributies en een logit linkfunctie) en LMMs (met normale foutdistributies), met zaadbehandeling, bloei, jaar en hun interacties als vaste factoren. Glmm ‘ s op de prevalentie van micro-organismen of varroamijt omvatten alleen kolonieidentiteit als willekeurige factor, aangezien de effectieve steekproefgrootte (d.w.z. de minder frequente uitkomst van de aan – /afwezigheidsgegevens) het niet mogelijk maakte om meer willekeurige factoren in aanmerking te nemen. Alleen organismen en jaren met een (effectieve) steekproefgrootte >10 werden geanalyseerd voor zowel de prevalentie-als de abundantiegegevens. Bovendien werden kolonies die niet ten minste één keer positief testten voor een bepaald micro-organisme uitgesloten van de analyse van de abundantie. Bijenpathogeen en bacteriële overvloed werden logaritmisch (log10) getransformeerd, omdat ze over het algemeen exponentieel verdeeld zijn. Lmm ‘ s met betrekking tot de abundantie van het doelorganisme bevatten de identiteit van boerderijparen, boerderijidentiteit en kolonieidentiteit als willekeurige factoren. Het aantal varroamijt per 100 bijen en het gewicht van de kolonie werd met vierkantswortel getransformeerd om niet-normaal verspreide reststoffen te voorkomen. Betrouwbaarheidsintervallen werden berekend op basis van de profielwaarschijnlijkheid. Voor de vierkantswortel getransformeerde gegevens werden schattingen terug getransformeerd naar de oorspronkelijke schaal voor grafische illustraties.

de immuungen transcripten waren alleen beschikbaar voor 2013 en op het niveau van de bijenstal, maar volgden ook het BACI-ontwerp. Lmm ‘ s op genexpressie bevatten zaadbehandeling en bloei als vaste factoren en boerderij identiteit als willekeurige factoren.

statistische gegevensanalyses werden uitgevoerd met behulp van R, behalve voor analyses die betrekking hadden op de verificatie van blootstelling aan clothianidine en landgebruik, waarvoor SAS 9.4 voor Windows (SAS Institute Inc.) werd gebruikt. Lmm ‘s waren geschikt met behulp van de lmer-functie van het lme4-pakket en Glmm’ s waren geschikt met behulp van de glmmTMB-functie van het glmmTMB-pakket in R. P-waarden van Glmm ‘ s werden berekend door waarschijnlijkheidsratio-tests. P-waarden van LMM ‘ s werden berekend met behulp van de Anova-functie van het car-pakket, waarbij type III F-tests werden gebruikt voor modellen met interacties en type II F-tests voor modellen zonder interacties (d.w.z. voorjaarsbeoordeling en honingproductie). Effecten van vaste factoren werden geschat met behulp van SOM-tot-nul contrasten in alle modellen behalve die op neonicotinoïde residuen. Som-tot-nul contrasten maken de bepaling van de belangrijkste effecten/interacties mogelijk (d.w.z. schatting onafhankelijk van andere onafhankelijke variabelen) en tonen de effecten van factoren als afwijkingen van het grootgemiddelde (intercept). Voor factoren met twee niveaus is de grootte van de afwijking van elk niveau van het grote gemiddelde hetzelfde, maar de richting verschilt. We vertegenwoordigen effecten van factoren (zaadbehandeling, bloei, jaar), als de afwijking van het tweede niveau (clothianidin, na, 2014) van het grote gemiddelde. Dit was ook het geval voor interacties, zodat bijvoorbeeld de zaadbehandeling × bloeiinteractie aangeeft in welke mate clothianidine-blootgestelde kolonies verschilden in verandering ten opzichte van de koolzaadbloei van de gemiddelde verandering van beide behandelingen.

Vermogensanalyse

we hebben vermogensanalyses uitgevoerd voor het aantal volwassen bijen en het aantal afgetopte broedcellen en honingproductie om de effectgrootte te onderzoeken die we zouden kunnen detecteren gezien onze ontwerp -, replicatie-en modelkeuze. Het vermogen werd bepaald voor een reeks effectgroottes met een nominale betrouwbaarheidsniveau van α = 0,05 door 1000 Monte Carlo-simulaties per effectgrootte met behulp van de powerSim-functie van het simr-pakket. Het vermogen werd berekend voor een reeks effectgroottes, uitgedrukt als de verandering in het aantal volwassen bijen, het aantal afgetopte broedcellen of de honingproductie. Door de effectgrootte te delen met het gemiddelde aantal bijen, het gemiddelde aantal broedcellen of honingproductie van alle controlekolonies, verkregen we effectgrootte uitgedrukt als de procentuele verandering van die matrices (aanvullende Fig. 3). Deze vermogensanalyse maakte het mogelijk om onze effectgrootte te vergelijken met de effectgrootte die door Rundlöf et al.34. Met behulp van het volledige model konden we een effectgrootte detecteren voor het aantal volwassen bijen van minder dan 5% met een vermogen van 80% in vergelijking met de effectgrootte van minder dan 20% gepresenteerd door Rundlöf et al.34. Dit is zelfs lager dan de vereisten voor een effectgrootte <7% die door EFSA32 zijn ingesteld. Als gevolg van een significante interactie van zaadbehandeling, bloei en jaar, werd de dataset voor het aantal afgetopte broedcellen voor elk jaar afzonderlijk geanalyseerd. Daarom presenteren we hier de energieanalyse voor elk jaar. De omvang van het effect waarbij 80% werd bereikt, steeg van minder dan 10% in 2013 tot iets minder dan 11% in 2014 (aanvullende Fig. 3), waarschijnlijk als gevolg van de verminderde replicatie in 2014. We hebben ook een vermogensanalyse uitgevoerd van de honingproductie (hoeveelheid honing per kolonie in kg) met behulp van de dataset van beide jaren, waaruit bleek dat een effectgrootte van minder dan 20% kon worden gedetecteerd met een vermogen van 80% (aanvullende Fig. 3).

Rapporteringssamenvatting

nadere informatie over de experimentele opzet is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde samenvatting van de Nature Research Reporting.