collageensynthese
regulatie van Botcollageensynthese
collageensynthese in orgaanculturen van calvariae en celculturen van knaagdieren is beoordeeld met behulp van verschillende assays . In de meest gebruikte assay, calvariae en cellen worden geïncubeerd met radioactief gelabelde proline gedurende enkele uren voorafgaand aan het einde van de cultuur. De incorporatie van radioactief gelabelde proline in collagenase-verteerbare proteã ne (CDP-etikettering) en noncollageen proteã ne (NCP-etikettering) wordt gemeten in extracten van de culturen gebruikend hoogst gezuiverde bacteriële collagenase . De procent collageensynthese wordt berekend uit de CDP-en NCP-waarden na correctie voor de grotere overvloed van proline in collageen ten opzichte van noncollageproteã nen . De collageenproductie kan ook worden bepaald door het hydroxyproline-gehalte van cel-of orgaanculturen te meten, aangezien hydroxyproline vrijwel uniek is voor collagenen. Deze methoden maken geen onderscheid tussen verschillende soorten fibrillair collageen. Nochtans, is het collageen dat door beenorgaanculturen en de meeste osteoblastic celculturen wordt gesynthetiseerd grotendeels type I (>95%) zodat de CDP-etiketteringswaarde gewoonlijk type I collageensynthese weerspiegelt. Indien gewenst kan de productie van verschillende collageentypes worden onderscheiden door ionenuitwisselingschromatografie en polyacrylamidegelelektroforese van radioactief gelabelde extracten van cel-of orgaanculturen . Type I collageenexpressie in menselijke celculturen is ook beoordeeld door de secretie van het procollageen I C-terminale propeptide te meten . Tot slot zijn de specifieke cDNA-sondes in het noordelijke bevlekken en allel-specifieke primers in omgekeerde transcriptase-polymerasekettingreactieanalyses gebruikt om de uitdrukking van collageen mRNA in beenmodellen te beoordelen. De meting van het effect van 1,25(OH)2D3 op collageensynthese en mRNA-niveaus heeft vergelijkbare resultaten met behulp van deze verschillende analyses opgeleverd.
1,25 (OH)2D3 remt de collageensynthese in orgaanculturen van 21-daagse foetale calvariae bij ratten en neonatale muizen met weinig of geen effect op de niet-collageeneiwitsynthese. Maximale remming van de collageensynthese met 1,25(OH)2D3 bij rat calvariae (ongeveer 50%) treedt op bij 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 remt ook de collageensynthese maar is minder krachtig dan 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 en 24R,25 (OH)2D3 veranderen de collageensynthese niet onder 100 nM . Vitamine D-metabolieten remmen de collageensynthese en stimuleren de resorptie van de lange botten van foetale ratten met vergelijkbare relatieve potenties die correleren met de affiniteit van de metabolieten voor de skeletale VDRs . Om de celselectiviteit van de 1,25(OH)2D3-remming van de collageensynthese te bepalen, werden orgaanculturen van foetale calvariae gedurende 22 uur behandeld met 1,25(OH)2D3 en vervolgens geïncubeerd met tritiated proline gedurende de laatste 2 uur van de kweek. Het centrale bot (Rijpe osteoblasten) werd ontleed vrij van het periosteum (minder rijpe osteoprogenitors en fibroblasten) en beide compartimenten werden afzonderlijk geanalyseerd voor de incorporatie van tritiated proline. 1,25(OH)2D3 vermindert de collageensynthese in het centrale bot maar niet in het periosteum, wat wijst op selectiviteit van het 1,25 (OH)2D3 effect voor volwassen osteoblasten . Gebruikmakend van een in vivo protocol waarbij neonatale ratten meerdere injecties met tritiated proline kregen toegediend aan radiolabel nieuw gesynthetiseerde botmatrix, werd 25 ng van 1,25(OH)2D3 gegeven op dag 1, 3 en 5 de botmatrixsynthese geremd zoals bepaald door histomorfometrie van autoradiografen van tibia en calvariae .
1,25 (OH)2D3 remt ook de collageenproductie in osteoblastische osteosarcoom van ratten ROS 17/2 , 8 cellen , primaire osteoblastische cellen van ratten en muizen, en een vereeuwigde muriene osteoblastcellijn (MMB-1). 1,25 (OH)2D3 heeft een groter remmend effect op type I collageensynthese tijdens de logfasegroei van primaire muriene osteoblastische cellen dan bij samenvloeiing, misschien omdat prolifererende cellen meer VDRs bevatten . Ook 1,25 (OH)2D3 remming van collageensynthese is groter in schaarse culturen van MMB-1 cellen die hogere VDR niveaus dan samenvloeiende MMB-1 cellen hebben . 1,25 (OH)2D3 remming van collageensynthese is equivalent in dunne en samenvloeiende primaire osteoblastische cellen bij ratten , maar het VDR-aantal veranderde niet tijdens de groei van de cellen . Samen tonen deze gegevens aan dat de mate van remming van de collageensynthese door 1,25(OH)2D3 grotendeels wordt bepaald door de cellulaire hoeveelheid VDRs. 1,25 (OH)2D3 remt collageen mRNA niveaus tijdens de proliferatieve fase van lange termijn culturen van ratten primaire osteoblastische cellen en voorkomt de vorming van gemineraliseerde bot knobbeltjes door deze culturen . Deze studies tonen aan dat 1,25(OH)2D3 de differentiatie van osteprogenitors remt die gemineraliseerde knobbeltjes in primaire ratten osteoblastische celculturen vormen . De remming van nodulevorming door 1,25(OH)2D3 kan echter secundair zijn aan de onderdrukking van type I collageensynthese in de culturen.
in tegenstelling tot de hierboven beschreven remmende effecten stimuleert 1,25(OH)2D3 tijdelijk de collageen-en noncollageen-eiwitsynthese (ongeveer tweevoudig), die tussen 12 en 24 uur pieken, in de vereeuwigde muizen osteoblastische cellijn MC3T3-E1 . In deze studie werd het percentage collageen dat door de culturen wordt gesynthetiseerd (collageen ten opzichte van de totale eiwitsynthese) niet gerapporteerd; hierdoor was het niet mogelijk om de selectiviteit van het 1,25(OH)2D3 effect voor collageensynthese te bepalen. 1,25 (OH)2D3 verhoogt ook collageenuitdrukking in de menselijke osteoblastische osteosarcoomcellijn MG-63 en primaire culturen van menselijke osteoblastische cellen . Interessant is dat de toename van de collageensynthese met 1,25(OH)2D3 in MG63-cellen wordt geblokkeerd door insuline-achtige groeifactor bindend eiwit 5, dat rechtstreeks in wisselwerking staat met de VDR en heterodimerisatie met de retinoid x-receptor RXR voorkomt . Nochtans, in andere studies, is 1,25(OH)2D3 getoond om de percentagecollageensynthese in MC3T3-E1 cellen te verminderen . MC3T3-E1 en MG-63 vertegenwoordigen preosteoblastische cellen die in vitro osteogene differentiatie met ascorbinezuur ondergaan; 1,25 (OH)2D3 remt de celgroei en verhoogt de osteocalcine expressie en alkalische fosfatase activiteit in beide cellijnen. De cellen van MC3T3E1, zoals de meeste vereeuwigde osteoblastic cellijnen, tonen significante fenotypic variatie . Daarom kunnen sommige van deze afwijkende resultaten te wijten zijn aan variaties in de cellen die voor de experimenten worden gebruikt. Collectief, suggereren deze gegevens dat 1,25(OH)2D3 als differentiërend hormoon in vroege cellen van de osteoblast lijn dienst kan doen, die in verhoogde type I collageenuitdrukking resulteert. In tegenstelling, remt 1,25(OH)2D3 type I collageenuitdrukking in Rijpe osteoblasten.
