COLO 205
succesvolle celcultuur:
*lees de belangrijke technische informatie die volgt voordat u de door ECACC geleverde cellijnen * verwerkt. Deze informatie is ook beschikbaar als PDF in ons hoofdmenu, onder ‘Klantenservice’ (Klik hier).
opslag van bevroren cellen
na ontvangst moeten bevroren ampullen onmiddellijk direct worden overgebracht naar vloeibare stikstof in de gasfase, tenzij ze onmiddellijk worden gebruikt. Gebruik geen vriezer van -80°C als alternatief; Dit zal leiden tot verlies van levensvatbaarheid.
hoe bevroren cellen bij ontvangst te behandelen
bij ontvangst van een zending van ingevroren door ECACC geleverde cellijnen is het belangrijk dat de eindgebruiker de zending onverwijld in de gaten houdt. Het technische advies bij de cellijnen moet worden geraadpleegd voordat de ampullen uit het droogijs worden gehaald. De correcte behandeling onmiddellijk na ontvangst is essentieel om de cellijn in het laboratorium van de eindgebruiker met succes tot stand te brengen.
op het moment dat een cellijn wordt besteld, moeten eindgebruikers ook rekening houden met de kweekvoorwaarden voor de nieuwe cellijn en ervoor zorgen dat het juiste medium beschikbaar zal zijn wanneer de cellen aankomen.
belang van celtelling
voer een levensvatbare celtelling uit wanneer u celculturen reanimeert en oogst. Een van de meest voorkomende redenen voor het falen om cellen in cultuur te vestigen is toe te schrijven aan het gebruik van een onjuiste levensvatbare cel zaaidensiteit op het moment van reanimatie dat wil zeggen zaaiende cellen te laag of te hoog. Dit kan worden vermeden door een levensvatbare celtelling uit te voeren en de aanbevolen zaaidensiteit te volgen.
voor de specifieke cellijn waarmee u werkt, lees de informatie die wordt verstrekt onder het tabblad ‘Beschrijving’ op onze website pagina. Die informatie is ook te vinden in de cellijn data Sheet, die u zal worden verstrekt als een papieren kopie met uw cellijn zending. De zaaddichtheid wordt weergegeven in de subcultuurroutine-informatie. Gebruik bij het zaaien van cellen onmiddellijk na reanimatie het midden-tot het bovenste uiteinde van het opgegeven zaaidensiteitsbereik.
reanimatie van bevroren cellen
het is belangrijk om bevroren ampullen met zorg te behandelen; draag een laboratoriumjas, een volledig beschermend gezichtsmasker en handschoenen. In zeldzame gevallen ampullen kunnen exploderen bij opwarming als gevolg van uitzetting van gevangen resterende vloeibare stikstof.
1. Houd in een microbiologische veiligheidskast een in 70% alcohol gedrenkt weefsel rond de dop van de bevroren ampul. Draai de dop een kwartslag om eventuele resterende vloeibare stikstof vrij te geven. Zet de dop weer vast. Breng de ampul snel over in een 37oC waterbad totdat er nog slechts één of twee kleine ijskristallen overblijven (1-2 minuten). Het is belangrijk om snel te ontdooien om schade aan de celmembranen te minimaliseren.Nb: de ampul niet volledig onderdompelen, omdat dit het risico op contaminatie kan verhogen.
2. Veeg de ampul voor het openen af met een in 70% alcohol gedrenkt Weefsel.
3. Pipetteer de volledige inhoud van de ampul in een steriele tube (bijv. 15 ml inhoud). Voeg vervolgens langzaam 5ml voorverwarmd medium toe dat al is aangevuld met de juiste bestanddelen. Bepaal de levensvatbare celdichtheid met behulp van trypan blue stain, een hemocytometer en een omgekeerde microscoop om de cellen of gelijkwaardige celtelmethode te tellen. Breng de juiste hoeveelheid celsuspensie over om de celzaaidichtheid te bereiken die wordt aanbevolen bij de gegevensinvoer van de cellijn.
voor aanhangende cellijnen: pas het volume van het medium en, indien nodig, de maat van de kolf aan om de celzaaidichtheid te bereiken die op het datablad van de cellijn wordt aanbevolen. Een pre-centrifugatiestap om cryoprotectant te verwijderen is normaal gesproken niet nodig, aangezien de eerste mediumverandering resterende cryoprotectant zal verwijderen. Als dat zo is, dan zal dit op het datablad worden opgegeven. Als de cellen onmiddellijk moeten worden gebruikt (bijvoorbeeld voor een test op basis van cellen), in plaats van gesubcultureerd, kan het raadzaam zijn om een pre-centrifugatiestap uit te voeren om cryoprotectant te verwijderen.
voor suspensiecellijnen*: een pre-centrifugatiestap om cryoprotectant te verwijderen wordt aanbevolen, d.w.z. pellet de cellen door centrifugeren bij 150 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in vers medium met het juiste volume om de juiste zaaidensiteit te bereiken.
1. Incubeer kolven bij de temperatuur en het CO2-niveau zoals aanbevolen op het datablad. Als een co2-incubator wordt gebruikt, moet de kolf een ontluchtingsdop hebben om gasuitwisseling mogelijk te maken.
Hybridoma culturen van bevroren
bij het herstellen van Hybridoma culturen uit bevroren is het niet ongebruikelijk dat de groei aanvankelijk langzamer is dan verwacht en er kan een afname van de levensvatbaarheid worden waargenomen. Het opzetten van een actief prolifererende cultuur kan tot 2 weken duren.
bij reanimatie is een centrifugatiestap om het cryoprotectant te verwijderen essentieel. Ontdooi de bevroren ampul snel 1-2 minuten in een waterbad bij 37°C. Breng de inhoud over in een centrifugebuis en voeg langzaam 5-10 ml voorverwarmde groeimedia+toe. Verwijder een monster om te tellen. Centrifugeer bij 100 x g gedurende 2-3 minuten naar pelletcellen en zaad met een relatief hoge dichtheid van 5-7 x 105 cellen / ml. Plaats de kweekfles plat en observeer regelmatig totdat levensvatbare prolifererende cellen worden gezien.
+vaak kunnen hybridomaculturen baat hebben bij resuspendatie met media aangevuld met 20% FBS in de vroege kritieke fase van de culture establishment onmiddellijk na reanimatie.
Procedure voor het invriezen van cellen
ECACC adviseert om uit voorzorg een voorraad van uw cellijn(en) kort na ontvangst te bevriezen (tussen 2 – 4 x 106 cellen/ml).
de volgende gids wordt aangeboden voor de bereiding en cryopreservatie van cellijnen.
1. Oogst de cellen in de log fase van de groei op dezelfde manier gebruikt voor routine subcultuur. Voor aanhangende cellijnen, oogst zo dicht mogelijk bij 80-90% samenvloeiing.
2. De standaardprocedure is het gebruik van 90% serum + 10% cryoprotectant voor alle cellijnen, tenzij anders vermeld op het datablad. Laat 1 ml voor elke ampul. De meeste cellijnen kunnen worden ingevroren in het geschikte kweekmedium aangevuld met 20% serum en 10% cryoprotectant. Dit is meestal DMSO, maar in bepaalde gevallen wordt glycerol aanbevolen. Als DMSO niet geschikt is, zal een alternatief worden opgegeven op het gegevensblad van de cellijn.
3. Pelletcellen door centrifugeren, bv. 150 x g gedurende 5 minuten. Resuspendeer de celkorrels in het juiste vriesmedium tot een uiteindelijke celconcentratie tussen 2 – 4 x 106 cellen/ml en Pipetteer 1 ml in elke ampul.
4. Bevriezen van de cellen met een koelsnelheid tussen 1-3oC / min met behulp van een programmeerbare snelheid gecontroleerde vriezer of geschikte alternatief 1. Wanneer de temperatuur ten minste-130oC bereikt, breng de ampul naar een gasfase vloeibare stikstof opslagvat.
