Constitutieve expressie van geselecteerde genen van de pentose fosfaat en aromatische trajecten verhoogt de shikimic zuur rendement in hoge glucose batch culturen van een Escherichia coli-stam ontbreekt PNT en pykF

Bouw van stammen afkomstig van PB12 aroK-aroL- met een plasmide ontworpen voor de constitutieve expressie van een synthetische operon gebruikt bij de productie van shikiminezuur

wijst ongepubliceerd bewijs uit ons laboratorium erop dat de productie van aromatische verbindingen in de in het laboratorium geëvolueerde stam PB12 hogere niveaus kan bereiken wanneer de transcriptionele inductie van de genen die betrokken zijn bij het canaliseren van koolstofflux in de AAA-route plaatsvindt aan het begin van fermentaties. Rekening houdend met deze observatie werd een nieuwe strategie ontwikkeld voor het optimaliseren van de productie van SA in PB12 die inactieve aroK-en aroL-genen draagt (figuur 1). Deze strategie omvatte het ontwerp en de bouw van een plasmide voor de sterke en stabiele expressie van zes sleutelgenen gerangschikt in de vorm van een synthetisch operon, uitsluitend gecontroleerd door een enkele TRC promotor. Om metabolische Last te verminderen, werd één enkele plasmide afgeleid van pbr327 die de par locus voor verhoogde plasmidestabiliteit dragen gebruikt als vector , na het opnemen van een fragment dat de promotor, polylinker, en transcriptional terminators van pTrc99A bevat (Figuur 2).

het eerste deel van het operon werd geconstrueerd door sequentiële versterking en ligatie van de eerste 4 codeersequenties (aroB, tktA, aroGfbr en aroE) in de polylinker van plasmide pBRINT-TS Cm, gebruikt als klonersteiger (zie methoden). Later, werd de 4-genconstructie overgebracht naar hybride plasmide pTrc327par samen met 2 meer genen (aroD en zwf), leidend tot een 8KB operon in een 12kb plasmide (Figuur 2). Het resulterende plasmide, genaamd pTrcAro6, werd omgezet in de pb12 aroK-aroL – stam zonder het laciq-gen, waardoor constitutieve expressie van de genen van belang (Tabel 1). Voor de eenvoud werd de gegenereerde pb12 aroK-aroL-lacI-stam AR2 genoemd. Nadat het pykF-gen in AR2 werd geïnactiveerd, werd de resulterende stam AR3 genoemd. Stammen afgeleid van AR2 en AR3 dragende plasmide pTrcAro6 werden respectievelijk AR26 en AR36 genoemd (Tabel 1).

de ruimtelijke rangschikking van de codeersequenties die het synthetische operon in pTrcAro6 vormen, geflankeerd door de TRC promotor en transcriptionele terminators, is weergegeven in Figuur 2. aroB is het eerste gen in het operon omdat verschillende bewijzen erop wijzen dat zijn lage expressie een van de beperkende stappen is in de productie van aromatische verbindingen . Plasmide pTrcAro6 draagt ook de genen tkta en aroGfbr, waarvan de producten betrokken zijn bij de synthese van E4P en de condensatie ervan met PEP tot DAHP, de eerste aromatische verbinding (figuur 1). aroD en aroE genen werden ook opgenomen om een efficiënte omzetting van DHQ naar SA te bevorderen. Bovendien draagt dit plasmide het ZWF-gen, coderend voor het eerste enzym van PPP (figuur 1). De beslissing om dit gen op te nemen was gebaseerd op de volgende observaties: 1) de overexpressie van zwf herstelde aanzienlijk het groeiverlies als gevolg van plasmide metabole belasting in stam JM101 die groeit op glucose als enige koolstofbron ; 2) Er is gemeld dat Stam PB12 een bijzonder lage koolstoffluxpartitie vertoont bij de glucose 6-fosfaat (G6P) knoop naar het PPP (5% van de verbruikte G6P vergeleken met 22% in de ouderstam JM101). Daarom zou een overexpressie van dit gen de beschikbaarheid van NADPH moeten verhogen, die in katalytische hoeveelheden door het enzym shikimate dehydrogenase (AroE) wordt vereist, en kan potentiële groeieffecten verminderen door meer G6P naar nucleotide en aminozuurbiosynthese in stammen afgeleid van PB12 te leiden . De in dit rapport gepresenteerde experimenten waren echter niet gericht op het ontleden van het specifieke effect van een gebruikt gen, maar in plaats daarvan op het karakteriseren van de gevolgen van het uitdrukken van alle van hen als een operon.

om een efficiënte vertaling van elk gen te bevorderen, werd elke codeersequentie versterkt met behulp van aangewezen primers die een consensus Shine-Dalgarno-sequentie introduceerden die 8 bp stroomopwaarts van de vertaalstartplaats lag. De nucleotideopeenvolging van het geconstrueerde operon wordt gepresenteerd in aanvullend dossier 1.

beoordeling van de effecten veroorzaakt door pykF-inactivatie in stammen die het Aro6-operon tot expressie brengen

om de effecten veroorzaakt door pykF-inactivatie op de productie van SA te evalueren, werd de prestatie van de productiestammen AR26 (pykF+) en AR36 (pykF -) vergeleken met behulp van schudflessen met 15 g/L Glc en 5 g/L YE. Als controle werden ook dezelfde stammen met een leeg ptrc327par plasmide (zonder het Aro6 operon), AR2e en AR3e, opgenomen.

hoewel SA zich in alle gevallen opstapelde, zoals verwacht voor mutanten in aroK en aroL, bereikten de stammen met pTrcAro6 hogere SA-concentraties dan die met een leeg plasmide (figuur 3b). Bovendien was de sa-titer bijna twee keer hoger in AR36 dan in AR26 (6,1 g/L vS.3,3 g/L). Na ongeveer 18 uur kweek werd een afname in Glc-consumptie waargenomen in stam AR26, wat correleert met een hoge acetaatconcentratie en een stilstand in de productie van SA. In tegenstelling, vertoonde stam AR36 constant Glc consumptie en verwaarloosbare hoeveelheden acetaat werden geproduceerd (figuur 3c, 3d). Deze resultaten tonen aan dat de genen aanwezig in het kunstmatige operon functioneel zijn en de productie van SA sinds het begin van de cultuur bevorderen. Hun constitutieve expressie verminderde de specifieke groeisnelheid (μ) met 25% in de pykF+ – achtergrond en verhoogde deze marginaal in de pykF-variant, maar veroorzaakte geen significante veranderingen in de maximale geproduceerde biomassa (Xmax) in vergelijking met stammen met een leeg plasmide (figuur 3a). Opmerkelijk is dat in de operonexpressiestammen onder deze groeiomstandigheden de inactivatie van het pykF-gen de productie van SA verhoogde, de accumulatie van acetaat elimineerde en een constante Glc-consumptie toestond.

gedrag van de stammen AR26, AR36 en hun lege plasmidederivaten AR2e ( pykF+) en AR3e (pykF-), met behulp van schudkolven die 15 g/L Glc en 5 g/L YE (a,b,c,d) bevatten, en 1 l fermentoren die 100 g/L Glc en 15 g/L YE (e) bevatten. a) groei; B) SA-productie; c) Glc-verbruik; d) acetaatproductie; e) Glc-verbruik en SA-productie van AR26 en AR36 in fermentoren. Foutbalken staan voor standaarddeviatie.

om te bepalen of de hogere acetaatproductie en de lagere SA-productie in AR26 ten opzichte van AR36 het gevolg zijn van de inherent lage zuurstofbeschikbaarheid en verzuring van het medium in schudkolf culturen, werden beide stammen gekweekt in 1 l batch fermentoren onder gecontroleerde omstandigheden van pH en opgeloste zuurstof spanning (DOT). Als benadering om de sa-titer te verhogen, werd de initiële concentratie van Glc in deze experimenten verhoogd tot 100 g/L, en de YE-concentratie werd gelijktijdig verhoogd tot 15 g/L om een hogere biomassaproductie mogelijk te maken.

onder deze omstandigheden produceerde stam AR36 42 g/L SA in 60 uur, verbruikte alle Glc en accumuleerde 12 G / L acetaat. Daarentegen produceerde stam AR26 na 47 uur maximaal 13 g/L SA, putte de Glc niet uit en verzamelde 29 g / L acetaat (figuur 3e en Tabel 2). Ongeacht de gecontroleerde omstandigheden in de fermentoren, waar de pH op 7 werd gehouden en de DOT te allen tijde hoger was dan 20%, leken de productieprofielen van beide stammen op het gedrag dat werd waargenomen in schudkolven, waarbij AR26 meer acetaat en minder SA produceerde. Zelfs wanneer de Globale volumetrische Glc consumptie rate( Qsglobal), μ en Xmax bereikt door beide stammen waren vergelijkbaar, de productiviteit, opbrengst, en titer waren meer dan twee keer hoger in AR36 dan in AR26 (figuur 3e en Tabel 2).

Het is opmerkelijk dat zulke grote verschillen in acetaat-en SA-productie werden waargenomen door het verstoren van slechts één gen, wat de voordelen aantoont van de gecombineerde inactivatie van PTS en pykF bij gebruik van een constitutief expressiesysteem in een geëvolueerde E. coli-stam. Om rekening te houden met de waargenomen verbeteringen in SA productie, stellen wij voor dat de vroege en constante expressie van enzymen gecodeerd in het operon een gestage consumptie van glycolytische tussenproducten door de culturen zou kunnen handhaven, waardoor hoge schommelingen in hun intracellulaire concentraties worden voorkomen. We veronderstellen dat de combinatie van deze gestage metabolische toestand met een verminderde flux van PEP naar pyruvaat veroorzaakt door de inactivatie van het pykf-gen de beschikbaarheid van PEP en andere glycolytische precursoren voor SA-productie kan verhogen zonder de GLC-consumptie te verlagen. Wij erkennen echter dat bij afwezigheid van gemeten intracellulaire metabolietconcentraties deze opmerkingen speculatief zijn.

Fermentatieprofielen van AR36 in batchculturen

rekening houdend met de vorige resultaten werd AR36 geselecteerd voor verdere karakterisering van zijn kinetische en stoichiometrische prestaties in 1 L fermentoren. Om dit doel te bereiken, werd de productie van SA Getest met drie verschillende kweekomstandigheden met een hoog substraat. Voor elk geval werden groei, Glc en Bijproducten gemeten, wat op zijn beurt een vergelijking van de produktiviteiten en opbrengsten mogelijk maakte.

eerst werden 50 g / L Glc en 15 g/L van u gebruikt (figuur 4a). Groei trad op gedurende de eerste 10 uur en genereerde 6,3 g / L droge cel gewicht met een μ van 0,53 h-1. Onder deze voorwaarde werd 24 g/L SA geproduceerd in 32 uur. Glc-verbruik en SA-productie vond plaats sinds het begin van de gisting en duurde tot GLC-uitputting, hoewel het specifieke GLC-verbruik (qs) en de specifieke sa-productiviteit (qp) hoger waren in de exponentiële fase (Tabel 3). De resulterende opbrengst van SA op Glc (YSA/Glc) was 0,47 mol/mol en de global volumetric sa productiviteit (Qpglobal) was 0.74 gSA/L * h (Tabel 3). Met betrekking tot de accumulatie van bijproducten in de sa-route waren concentraties van 2,4 g/L DAHP, 2,1 g/L DHS, 1,4 g/L QA, 0,4 g/l GA en 0,3 g/L DHQ aanwezig in het supernatans aan het einde van de gisting (figuur 5a). Onder deze omstandigheden werd tijdens de gisting vrijwel geen acetaat geproduceerd, waarbij na 32 uur een maximumconcentratie van 1,5 g/L werd bereikt (figuur 4a).

Fermentatieprofiel van Stam AR36 gekweekt in 1 L bioreactoren met drie verschillende substraatconcentraties. a) 50 g / L Glc en 15 g / L YE; b) 100 g/L Glc en 15 g/L YE; C) 100 g/L Glc en 30 g/L YE. Glc: Cirkels; SA: vierkanten; acetaat: open driehoeken; biomassaconcentratie: omgekeerde driehoeken. Foutbalken staan voor standaarddeviatie.

Aromatische bijproducten van de SA-route ontdekt in 1 L fermentor culturen van de stam AR36 met behulp van drie verschillende substraat concentraties. a) 50 g / L Glc en 15 g / L YE; b) 100 g/L Glc en 15 g/L YE; C) 100 g/L Glc en 30 g/L YE. Diamant: DAHP (3-deoxy-D-arabinoheptulosonaat 7-fosfaat); vierkanten: DHQ (3-dehydroquininezuur); Cirkels: DHS (3-dehydroshikiminezuur); driehoeken: QA (kininezuur); omgekeerde driehoeken: GA (gallinezuur). Foutbalken staan voor standaarddeviatie.

aangezien 50 g / L Glc volledig werd verbruikt, werd een tweede batch-experiment gestart met 100 g/L Glc en 15 g/L YE. Zoals vermeld in de vergelijking met AR26 in de vorige paragraaf, produceerde AR36 onder deze omstandigheden ongeveer 42 g/L SA in 60 uur (figuur 4b). In dit geval produceerde de stam, na ongeveer 100 g/L glucose te hebben verbruikt en de maximale concentratie SA te hebben bereikt, 12 G/L acetaat. De verkregen waarden voor YSA/ Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax en μ waren vergelijkbaar met die verkregen met 50 g/L Glc en 15 g/L van YE (Tabel 3). Deze experimenten tonen aan dat bij gebruik van dezelfde ye concentratie, tweemaal de hoeveelheid Glc wordt geconsumeerd in bijna twee keer de tijd, wat aangeeft dat het gemiddelde glucoseverbruik wordt gehandhaafd tussen beide kweekomstandigheden. Concentraties van 4,8 g / L DAHP, 2,8 g / L DHS, 3,4 g / L QA, 0.7 g/L GA en 0,9 g / L DHQ waren aanwezig in het supernatant na 60 uur (figuur 5b). Interessant is dat bij de verdubbeling van de Glc-concentratie de tussenproducten van de AAA-route vrij evenredig met de SA zijn toegenomen, wat erop wijst dat het verbruik van 100 g/L Glc blijkbaar geen nieuwe knelpunten in de koolstofflux heeft veroorzaakt. Als gevolg hiervan bedroeg de hoeveelheid SA in verhouding tot de totale geproduceerde aromatische verbindingen in beide experimenten bijna 80% (Figuur 6).

molair percentage van elke aromatische verbinding geproduceerd in stam AR36 ten opzichte van het totaal in batchculturen beginnend met: a) 50 g/L Glc en 15 g/L YE; b) 100 g/L Glc en 15 g/L YE; c) 100 g/L Glc en 30 g/L YE. De berekende opbrengsten en Molaire verhoudingen van de geproduceerde aromatische verbindingen worden onder elke bar weergegeven. De vergelijkingen werden gemaakt met de concentraties gemeten in het supernatans aan het einde van de fermentaties. YSA / Glc = opbrengst van SA uit Glc; YTAC / Glc = opbrengst van totale aromatische verbindingen uit Glc; Ymax = maximale theoretische opbrengst van aromatische verbindingen.

het effect van het verhogen van de ye op de SA-productiviteit werd onderzocht met een derde reeks experimenten, waarbij 100 g/L Glc en 30 g/L van YE werden gebruikt. Hoewel de biomassa werd verdubbeld bij gebruik van tweemaal de concentratie van YE, waren de sa-titer, μ en YSA/Glc zeer vergelijkbaar met die verkregen in de cultuur met 100 g/L Glc en 15 g/L van YE (figuur 4b en figuur 4c). In combinatie met de gegevens die uit de andere twee voorwaarden zijn verkregen, suggereren deze bevindingen dat de hoeveelheid YE in de eerste plaats de maximale biomassa bepaalt die kan worden bereikt. Bovendien heeft een toename van de initiële YE-concentratie de sa-titer niet veranderd en ondersteunt het de constatering dat SA voornamelijk uit glucose wordt geproduceerd. De directe relatie tussen de initiële YE-concentratie en de maximale geproduceerde biomassa, ongeacht de initiële Glc-concentratie die in deze groeiomstandigheden wordt getest, suggereert dat een of meer beperkende nutriënten door de YE worden geleverd. Het lijkt er ook op dat dergelijke voedingsstoffen niet kunnen worden gesynthetiseerd uit Glc, vandaar dat hun uitputting van YE de groei beperkt lang voordat Glc is uitgeput. De verwachting is dat de aromatische aminozuren en vitaminen aanwezig in de YE die nodig zijn om AR36 auxotrofie tegen te gaan, beperkend zullen worden; andere verbindingen in dit complexe medium kunnen echter ook een rol spelen in de groeibeperking na verloop van tijd.

bij een beginconcentratie van 30 g/L werd in totaal 106 g/L Glc en 43 g/L SA verbruikt en geproduceerd in ongeveer de helft van de tijd die nodig was voor de gisting met 15 g / L Y. Met 30 g/L van YE, de Qsglobal en Qpglobal toegenomen tweevoudig, in vergelijking met de fermentaties met 15 g/L van YE, hoewel de sa titer onveranderd bleef (Tabel 3). Aangezien de biomassa ook verdubbelde, waren de berekende qp en qs vergelijkbaar tussen de drie experimenten, zowel in exponentiële als stationaire fasen, wat de metabolische robuustheid van de gemanipuleerde stam onder de geteste omstandigheden aantoonde.

bovendien bleek uit de resultaten dat een toename van de YE-concentratie de concentratie van Sa-tussenproducten niet aanzienlijk deed toenemen (figuur 5c). In dit verband werd erkend dat de aanwezigheid van grote hoeveelheden tussenproducten een negatief effect kan hebben op het herstel van SA uit de gistingsbouillon . Deze zorg heeft sommige inspanningen in het onderwerp geleid, leidend tot het testen van cultuurvoorwaarden, genetische achtergronden, en het gebruik van niet-metabolisable glucose analogen, als pogingen om bijproduct generatie te minimaliseren .

bij deze experimenten werd een groot deel van SA ten opzichte van bijproducten gedetecteerd zonder enige verdere wijziging van de stam of het proces. De concentratie van elk tussenproduct werd vergeleken met de som van alle aromatische tussenproducten, en hun percentages werden gebruikt om de molaire verhouding van SA tot elk bijproduct aan het einde van de fermentaties te berekenen (Figuur 6). De SA-verhouding bleek hoger te zijn dan 10 voor DHS, QA of DAHP, en hoger dan 40 voor GA of DHQ voor alle geteste substraatconcentraties. Opmerkelijk is dat in alle omstandigheden de verkregen SA-opbrengsten dicht bij 50% van het theoretische maximum lagen en de opbrengsten van de totale aromatische verbindingen (TAC) boven 60% van het theoretische maximum, geschat op 0.86 molTAC / molGlc (zie methoden en Figuur 6). Dit weerspiegelt de efficiënte omleiding van glucose naar de weg van AAA in spanning AR36, zelfs wanneer het gebruiken van hoog-glucose batchculturen. De verhouding van SA tot bijproducten, evenals de verkregen SA-en TAC-opbrengsten zijn vrij constant voor alle geëvalueerde omstandigheden, en vertegenwoordigen voor zover bekend de hoogste gerapporteerde waarden voor een Sa-productiefermentatieproces. Deze verbeteringen kunnen worden gerechtvaardigd door er rekening mee te houden dat het platform aanwezig in de gemanipuleerde stam een meer homogene expressie van de noodzakelijke enzymen op een efficiënte genetische achtergrond mogelijk maakt. Dit, in tegenstelling tot andere expressiesystemen waar de vereiste genen uit afzonderlijke plasmiden, onder verschillende promotors, of in spanningen worden uitgedrukt die niet voor efficiënt gebruik van hoge niveaus van Glc worden geoptimaliseerd. Naast de voordelen met betrekking tot de dynamiek van genexpressie, vormt het feit dat IPTG niet nodig is om het Aro6-operon te induceren een belangrijk economisch voordeel voor het productieproces, aangezien de hoge prijs van IPTG het gebruik ervan in grootschalige fermentaties beperkt.

inzichten over de glycolytische en acetaatmetabolismen van Stam AR36 door RT-qPCR

om een dieper inzicht te krijgen in de metabole veranderingen die worden veroorzaakt door de constitutieve expressie van het Aro6 synthetische operon in stam AR36, werden transcript niveaus van verschillende genen gemeten in drie verschillende groeistadia in culturen met 50 g/L Glc en 15 g/L YE. Zoals beschreven in methoden, werden gegevens verkregen uit de vroege exponentiële fase (EE), de late exponentiële fase (LE) en de stationaire fase (ST) genormaliseerd ten opzichte van de waarden gemeten uit stam AR3e bij EE, geteeld onder dezelfde kweekomstandigheden.

de resultaten wijzen erop dat de aanwezigheid en expressie van het operon in stam AR36 het transcriptieniveau verhoogt van verschillende genen die coderen voor glycolytische enzymen tijdens de EE-en LE-fasen (figuur 1 en figuur 7a). De toename van de expressie van genen galP en glk is bijzonder interessant omdat er is gemeld dat hun producten de invoer en fosforylering van glucose in PB12, de ouderstam van AR36, controleren . Bovendien is er een aanzienlijke toename van de transcriptionele niveaus van BGA en eno, maar pykA niet. Deze veranderingen kunnen zich vertalen in een hogere beschikbaarheid van PEP en fructose 6-P (die direct kan worden omgezet in E4P door plasmide-gecodeerde transketolase), waardoor de opbrengst van aromatische verbindingen toeneemt. We theoretiseren dat de waargenomen upregulatie van glycolytische genen in stam AR36 een van de gevolgen zou kunnen zijn voor lage niveaus van sommige glycolytische tussenproducten (glucose 6-fosfaat, fructose 6-fosfaat en PEP), veroorzaakt door de sterke en constitutieve expressie van de operongecodeerde enzymen die deze metabolieten consumeren.

transcriptionele veranderingen als gevolg van de expressie van Aro6 synthetisch operon in stam AR36. Ter vergelijking: het transcriptieniveau van elk gen werd bepaald op drie verschillende punten in de groeicurve van Stam AR36, gegroeid met 50 g/L Glc en 15 g/L YE (zie figuur 4a). Alle gegevens werden genormaliseerd ten opzichte van de waarden verkregen uit stam AR3e in de vroege exponentiële groeifase. a) genen die coderen voor glycolytische enzymen; B) genen die betrokken zijn bij acetaatassimilatie en biosynthese; c) genen die deel uitmaken van het synthetische Aro6-operon (zie Figuur 1 en Figuur 2). Zwarte balken: vroege exponentiële fase; grijze balken: late exponentiële fase; witte balken: stationaire fase. Foutbalken staan voor standaarddeviatie.

aan de andere kant werden de transcriptionele niveaus van genen die coderen voor enzymen die betrokken zijn bij de biosynthese van acetaat (poxB, ackA en pta) niet gewijzigd door de aanwezigheid van het synthetische operon, terwijl actP en acs, coderend voor enzymen die betrokken zijn bij de assimilatie van acetaat, sterk werden verhoogd in de EE-en LE-fasen (figuur 7b). Upregulatie van actP-en acs-genen is ook gedetecteerd in de exponentiële groeifase in de ouderstam PB12 die in staat is om Glc en acetaat in minimaal medium te gebruiken . Deze bevindingen correleren met de lage niveaus van acetaat in de onderzochte groeiconditie (figuur 4a). Belangrijk is dat de transcriptionele waarden van deze genen die betrokken zijn bij acetaatassimilatie laag waren in de ST-fase (figuur 7b). Als deze respons representatief is voor de andere gebruikte groeiomstandigheden, kan dit gedeeltelijk de acetaataccumulatie verklaren die wordt waargenomen in fermentaties met 100 g/L Glc, die tijdens de stationaire fase hogere hoeveelheden Glc verbruiken (figuur 4b en figuur 4c). Deze resultaten benadrukken actP en acs als potentiële gendoelwitten om hun expressie in late kweekstadia kunstmatig te verhogen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de verwachte mogelijkheden van Stam AR36 om gelijktijdig Glc en acetaat te gebruiken, aanwezig in zijn ouderstam PB12 .

de genen in het synthetische operon vertoonden zeer sterke expressieniveaus (zelfs in stationaire fase), hetgeen de constitutieve aard van de promotor en het hoge aantal kopieën van het plasmide weerspiegelt (figuur 7c). Deze resultaten correleren met de ononderbroken Glc consumptie en SA productie waargenomen tijdens de gehele fermentatie (figuur 4a), wat suggereert dat de enzymen gecodeerd door de genen in het operon aanwezig zijn gedurende de teelttijd. Het kan in Figuur 7c worden gezien dat de transcript niveaus van aroD en zwf relatief hoger en lager zijn, respectievelijk, dan de andere vier genen in het operon. Deze observatie moet met voorzichtigheid worden genomen omdat de zes genen in het operon worden vergeleken met die welke aanwezig zijn in het chromosoom van de referentiestam AR3e. Aangezien de voor de zes genen verkregen waarden niet tussen hen genormaliseerd zijn, kunnen variaties tussen hun chromosomale expressie in stam AR3e de relatieve vergelijkingen met stam AR36 veranderen. Niettemin komen de transcriptomische gegevens overeen met de hoge verhouding van SA tot aromatische tussenproducten verkregen in de geteste omstandigheden, wat te verwachten is als alle genen in het operon voldoende tot expressie werden gebracht. Samen met kinetische en stoichiometrische gegevens benadrukken deze resultaten de voordelen van het gebruik van een constitutief uitgedrukt synthetisch operon als een alternatieve strategie om de opbrengst van Sa uit Glc te verhogen in een geëvolueerde stam zonder PTS en pykF.