Detectie en identificatie door middel van PCR van Clostridium chauvoei in klinische isolaten, runderen, feces en substraten van biogasinstallatie

Voorbeelden van verdachte gevallen van blackleg

spier-monsters van verdachte gevallen van blackleg, de resultaten van de cultuur op FAA platen gevolgd door PCR van de kolonie materiaal werden in overleg met, of nog beter gepresteerd, dan de biochemische identificatie methode (Tabel 2). Deze resultaten komen overeen met Uzal et al. . Deze studie toonde aan dat de voorbereiding van DNA van cultuur vóór PCR betere resultaten gaf dan PCR die direct op biomassa wordt toegepast.

kweek gevolgd door biochemische identificatiemethoden is gecompliceerd in monsters met een hoog gehalte aan verontreinigende flora vanwege de noodzaak voor zuivere kweek en de gevoeligheid aanzienlijk lager was dan voor kweek en PCR. In acht gevallen was het niet mogelijk C. chauvoei aan de hand van kweek en biochemische identificatie op te sporen, maar het organisme werd wel aan de hand van PCR gedetecteerd (Tabel 2). Voor het stellen van een diagnose van blackleg, wordt spierweefsel genomen bij autopsie, omdat de hoeveelheid C. chauvoei waarschijnlijk hoger is in spierweefsel dan in bloed. Het bloedmonster was verkeerd genomen, maar de vraag was blackleg.

in een eerder onderzoek naar een uitbraak van zwarte poten gaven kweek en detectie door PCR eveneens betere resultaten dan biochemische analyse . In een van de gevallen werd de primaire kweek van één spier op een bloedagarplaat overgroeid door C. septicum, maar gaf duidelijk positieve resultaten voor C. chauvoei in de PCR.

in de meeste klinische gevallen van blackleg de hoeveelheid C. chauvoei in besmet weefsel is hoog en kan gemakkelijk worden gedetecteerd door de PCR-methode, onafhankelijk van verontreinigende flora. Bovendien is de PCR-methode veel sneller dan de traditionele biochemische detectiemethode, die minstens vijf dagen duurt, en het is belangrijk om een zuivere cultuur van de stam te hebben, die extra tijd voor cultuur zou kunnen vereisen. Om besmetting van de flora te voorkomen, mag het spierweefsel niet te klein zijn; ongeveer 100-200 g zou voldoende zijn. Zonder zuivere cultuur kunnen geen spanningen voor latere studies in de toekomst zijn, wat een nadeel is van het gebruik van PCR-detectie als enige methode.

bij runderen die experimenteel met C. chauvoei besmet waren, werden PCR-analyses uitgevoerd op gehakt spierweefsel en andere organen en werd C. chauvoei in alle geteste organen gedetecteerd . Fijngehakte spierstukken van vermoede gevallen van blackleg werden rechtstreeks getest door PCR en vergeleken met kweek. De PCR-detectie leverde betere resultaten op dan de kweek-en biochemische identificatie , hetgeen in strijd is met de resultaten van deze studie, waar slechts 12% (3 van de 24) van de bloed-of spierstukken boven de detectiedrempel van PCR lag, terwijl 9% van de vleessapmonsters boven de detectiedrempel lag (Tabel 2). Remmende stoffen zijn waarschijnlijk aanwezig in spierweefsels. Remmers voor de enzymatische reactie van PCR-amplificatie zijn geïdentificeerd in lever, milt en nieren en er kunnen vergelijkbare remmers aanwezig zijn in spierweefsel. De resultaten van in steriele fysiologische zoutmonsters gemacereerde spierstukken (26%) kwamen niet goed overeen met die van de biochemische test. Directe PCR op spierweefsel of andere gelijkaardige steekproeven is waarschijnlijk niet geschikt voor het vervangen van cultuurstappen die door biochemische tests of door PCR worden gevolgd.

met wattenstaafjes

verzamelde Spiermonsters om te onderzoeken of het nodig is spierweefsel te verzenden voor analyse van C. chauvoei dan wel of het voldoende is om wattenstaafjes voor monsterverzameling te gebruiken, werd een postdienst gesimuleerd. Van de 22 onderzochte spierweefsels lag 64% boven de detectiedrempel van PCR. Voor swabs van dezelfde monsters na de simulatie van de postdienst lag 36% tot 47% swabs boven de detectiedrempel (Tabel 3). Het zou praktischer zijn om monsters te nemen met wattenstaafjes in plaats van met spierweefsels als wattenstaafjes voldoende zijn voor de analyse van C. chauvoei. Spierweefsel gaf echter meer positieve monsters dan swabs wanneer beide werden geanalyseerd op kweek en PCR (Tabel 3). De incidentie van C. chauvoei op swabs uit de positieve spierweefselgevallen leek willekeurig. Het bleek echter weinig of geen verschil te maken of de swabs gedurende 1, 3 of 6 dagen werden bewaard.

monsters van biogasinstallaties

Clostridium chauvoei werden vóór pasteurisatie in 3 van de 11 monsters in biogassubstraat aangetroffen, maar na pasteurisatie of na vergisting konden deze monsters niet worden opgespoord (Tabel 4). De bacteriën in dit soort monsters kunnen afkomstig zijn van mest of dierlijke bijproducten uit het slachthuis, aangezien beide bronnen worden gebruikt voor de productie van biogas. Geen van de in dit onderzoek bemonsterde bedrijven stuurt hun mest vanwege de geografische afstand naar de biogasinstallaties, maar de dieren worden naar het plaatselijke Slachthuis gestuurd. Er zijn ook gevallen van zwarte poten gemeld in het stroomgebied van de biogasinstallatie.

na biogasverwerking worden de verteerde residuen als meststof gebruikt. Sporenvormende bacteriën kunnen pasteurisatie en vertering in biogasinstallaties overleven en verteerde residuen van biogasinstallaties kunnen daardoor zwartbenigheid naar nieuwe gebieden verspreiden. Echter, geen C. chauvoei werd aangetroffen in verwerkt product, dus misschien is het milieu in de vergister niet geschikt voor C. chauvoei, of de flora in de vergister ontgroeit C. chauvoei. Clostridiale sporen kunnen lange tijd in de bodem overleven, waarmee rekening moet worden gehouden bij nader onderzoek naar C. chauvoei in vergister.

monsters van bedrijven

ondanks het feit dat alle onderzochte bedrijven de afgelopen jaren vermoede gevallen van zwartbenigheid hadden gemeld, testten alle monsters van feces, bodem en kuilvoer negatief op C. chauvoei. Er kunnen verschillende verklaringen voor zijn. Sporen kunnen nog aanwezig zijn in het materiaal, maar onder het detectieniveau. Bovendien kunnen de PCR-inhibitors in de steekproeven aanwezig zijn en kan PCR worden belemmerd . De feces van runderen bevatten vluchtige vetzuren (VFA) en de bodemmonsters kunnen sporen van metaal bevatten, waarvan bekend is dat beide de PCR-reactie verstoren. Nochtans, vermindert de cultuurstap vóór PCR de invloed van remmende substanties.

Sinds C. chauvoei is een bodembacterie sommige seizoensgebonden variatie kan optreden, bijvoorbeeld zware regenval kan bijdragen aan de verspreiding van de sporen en de hoeveelheid sporen in de bodem kan beter toegankelijk zijn voor runderen. De meeste monsters werden in het begin van de herfst bij zonnig weer genomen, zodat de sporenconcentratie in de monsters naar verwachting laag zal zijn. Het aantal monsters kan ontoereikend zijn geweest om milieuverontreiniging op te sporen. Om praktische redenen zijn er echter zelden zeer grote aantallen milieumonsters beschikbaar in het veld.

vermoedelijke gevallen van zwartbenigheid op de bedrijven hadden zich voornamelijk voorgedaan bij kalveren en vaarzen, maar één bedrijf meldde een geval bij een volwassen koe. Zeven van de elf bedrijven A-K beschikten op het moment van de bemonstering over vaccinatieroutes (Tabel 1).

twee van de bedrijven hebben mest opgeslagen vóór het uitspreiden en de andere niet, maar geen van de bedrijven heeft mest op grasland verspreid. Lokale dierenartsen hebben naar verluidt meer gevallen van blackleg gezien na struikgewas op het eiland Öland, vooral op Alvaret (een kale kalksteenvlakte, bijna 40 km lang en 10 km breed, met speciale flora afhankelijk van de dunne grond en hoge pH). Alvaret wordt meestal gebruikt als weiland door naburige boerderijen. In het jaar van de bemonstering was niet veel struikgewas opgeruimd.

PCR

Culturele procedures zijn duur en tijdrovend, en contaminatie met andere anaerobe bacteriën die C. chauvoei ontgroeien veroorzaakt vaak problemen . Wanneer het gebruiken van PCR, wordt het DNA van zowel levensvatbare als niet-levensvatbare cellen vergroot. Als alleen levensvatbare cellen worden gedetecteerd, kan een verrijkingsstap worden toegepast . In deze studie cultuur op FAA platen voordat PCR werd gebruikt om detectie van niet-levensvatbare bacteriën en vals positieve PCR reacties te voorkomen. DNA is gemakkelijk te vergroten uit pure culturen, maar problemen ontstaan met verontreinigde monsters, zoals monsters uit bioafval. De opsporing van DNA door PCR kan door talrijke substanties met inbegrip van humic zuren, VFA, vetten en proteã nen worden gehinderd . Nochtans, werd de cultuurstap vóór PCR gebruikt als verrijkingsstap en vermindert daarom de invloed van remmende substanties. Door de krimpende flora kon geen zuivering van de FAA platen worden uitgevoerd.

detectiedrempel van de PCR-methode

het detectiedrempel was 200 cfu / g. Dit lijkt een slecht detectiedrempel te zijn, maar dit kan worden verklaard door het feit dat monsters zoals mest, bodem en biogassubstraat zwaar verontreinigd zijn door de omringende flora. Sasaki meldde een detectieniveau van 10 cfu/g, blijkbaar in schonere monsters. Echter, aangezien het detectieniveau in onze studie 200 cfu/g was en omdat dergelijke monsters naar verwachting een laag aantal C. chauvoei zouden bevatten. De in dit onderzoek gebruikte methode is dus niet praktisch toepasbaar.

milieuaspecten

de detectiedrempel van de PCR-methode na de precultuurperiode is in het huidige stadium nauwelijks geschikt om te garanderen dat dieren besmet zijn of om de status van weiden te bepalen. In plaats daarvan moeten de momenteel toegepaste aanbevelingen worden gebruikt, aangezien de methode niet kan worden gebruikt als basis voor vaccinatieroutines. In gebieden waar blackleg endemisch is, wordt een jaarlijkse vaccinatie vóór beweiding aanbevolen, ondanks de kosten en de benodigde tijd.

deze studie gaf enige aanwijzingen dat C. chauvoei het biogasproces niet passeert. Het aantal C. chauvoei in bioafval is in de vergister wellicht gedaald tot onder de detectiedrempel van de methode, zodat het risico van verspreiding van verteerde residuen verwaarloosbaar is. Er zijn meer studies nodig over clostridiale overleving door het biogasproces voordat er definitieve conclusies kunnen worden getrokken. De voordelen van verteerde residuen als meststof wegen echter wellicht op tegen het risico van verspreiding van zwarte poten.