diagnose van ontsteking en infectie in de urinewegen via proteomics

monsterbronnen voor de evaluatie van proteomische gegevens in de urine voor diagnostische doeleinden

de verzameling van 120 urinemonsters die in dit onderzoek werden geprofileerd, was niet beperkt tot de diagnose, beoordeling van progressie of behandeling van een specifieke ziekte. Urineonderzoek (UA) van de monsters werd besteld door behandelende artsen om verschillende redenen, waaronder acute schade, vaginale bloeden, duizeligheid/misselijkheid, hyperlipidemie, type II diabetes en bijbehorende complicaties, buikpijn/misselijkheid, niet-gespecificeerde hypertensie, blaas hypertensie, idiopathische polyurie, en vermoede UTI. Aangezien UTI een zeer voorkomende infectieziekte is die verband houdt met enkele van de eerder genoemde klinische symptomen (b.v. buikpijn/misselijkheid) en risicofactoren (b. v. diabetes), verwachtten we frequente diagnose van bacteriurie of UTI van deze specimens. Proteomic analyses waren beperkt tot specimens waar urineanalyserapporten voorlopige ondersteuning boden voor bacterieel veroorzaakte UTI ‘ s (zie methoden). We hebben geen urinemonsters geanalyseerd in gevallen waarin de specifieke diagnose van asymptomatische bacteriurie beschikbaar werd gesteld. Voor alle 120 monsters werden uitgebreide UA-gegevens verkregen. Dit omvatte peilsticktesten, microscopisch onderzoek van urinaire sedimenten voor verschillende celtypen en slijm, en – in 46% van de gevallen – urinekweken (UC) gegevens. Gegevens over het uiterlijk van de urine, zoals troebelheid, kleur en kleur en volume van de urinepellet werden ook beoordeeld. De resultaten van de urineanalyse maakten een uitgebreide vergelijking mogelijk van de conventionele methoden om ziekten van de urinewegen te diagnosticeren met gegevens uit metaproteomic onderzoeken (aanvullend dossier 3: Tabel A3).Neutrofielen, de dominante effectoren van aangeboren immuunresponsen in de urinewegen, zijn verantwoordelijk voor hoge ontstekingsniveaus in vele monsters

Proteomische gegevens leverden sterk bewijs voor de belangrijke rol van neutrofielen als effectoren en boodschappers van ontsteking in de urinewegen. Neutrophils geven antimicrobiële en ontstekingsmoleculen van secretoire korrels vrij die zij binnenvallende ziekteverwekkers in fagolysosomes na hun fagocytose produceren en doden. Een hiërarchische clustering analyse geoptimaliseerd voor monster leaf order (hclso) geïdentificeerd vier Monster clusters met menselijke eiwit abundantie profielen gedomineerd door neutrofielen (23 van 111 gevallen; NAD1 clusters in Figuur 1) en twee clusters met neutrofiel-specifieke eiwit hoeveelheden vergelijkbaar met die geassocieerd met het cytoskelet (25 gevallen; nad2 clusters in Figuur 1). Cytoskeletal proteã nen worden hoogst uitgedrukt in epitheliaale cellen die het urogenitale kanaal voeren en maken omhoog de meerderheid van het urinaire sediment proteome in afwezigheid van pathofysiologische voorwaarden in de urinewegen uit. Vijfendertig van de 48 nad-clusterprofielen waren positief voor IDS van uropathogeen met inbegrip van G. vaginalis, indicatief van het feit dat een dominante reden voor ontsteking in de respectieve patiënten bacteriuria en een immune reactie naar de binnenvallende microben was. De reden voor de afstanden onder de clusters NAD in de verbindingsboom was de aanzienlijke variatie in het aantal geà dentificeerde menselijke proteã nen die zich van 200 tot 1.500 IDs per steekproef uitstrekken.

hiërarchische clustering analyse van urine pellet proteomic profielen voor 110 monsters. Hiërarchische clustering werd uitgevoerd op kwantitatieve menselijke eiwit datasets met behulp van de TPA-methode in de MaxQuant-software. De datasets werden onderworpen aan de Pearson correlatie analyse met monster blad orde-optimalisatie en volledige koppeling clustering met behulp van de software tool MeV . We elimineerden de eiwit abundantie heat map van de getoonde hiërarchische boom van de UP monsters. De onderkant van het paneel aan de linkerkant verbindt met de bovenkant van het paneel aan de rechterkant als het gaat om Boom koppelingen. De namen van de steekproefcluster, die aan de rechterkant van de afbeelding met hun acroniemen worden getoond, worden in detail in de tekst besproken. Gekleurde balken geven het type, de grootte en de positie van elke steekproefcluster in de boom.

neutrofieleiwitabundanties afgeleid van proteoomgegevens correleren goed met le-activiteiten en leukocytenaantallen

een belangrijke motivatie voor deze studie was om te bepalen hoe proteoomgegevens afgeleid van urinesedimenten vergeleken met conventionele assays om ontstekingsniveaus in urinemonsters te kwantificeren. We bepaalden de hoeveelheden van 35 eiwitten waarvan bekend is dat ze sterk tot expressie komen in geactiveerde neutrofielen (aanvullend dossier 2: Tabel A2) ten opzichte van de totale eiwit abundantie voor elk UP monster, zoals weergegeven in blauwe balksegmenten van de plot weergegeven in Figuur 2. Niet onverwacht, 85% procent van de gevallen behorend tot de bovengenoemde nad1 clusters waren in de sectie van de grafiek met meer dan 30% neutrofiel eiwitgehalte (aan de linkerkant). De 35 eiwitten omvatten vijf functionele groepen: de calciumbindende S100-familieproteïnen S100-A8, S100-A9 en S100 – A12, die 40-50% van het totale cytosolische eiwitgehalte in neutrofielen uitmaken.; eiwitten die worden uitgebracht tijdens een ontsteking van neutrofiele korrels, met inbegrip van myeloperoxidase (MPO), respectievelijk cathepsine G (CTSG), defensin-1 (DEFA1), elastase (ELANE), lysosome (LYZ), lactotransferrin (LTF), en cathelicidin (KAMP) ; eiwitten die betrokken zijn bij de vorming van, de handel, en een fusie van de korrels met phagolysosomes, met inbegrip van grancalcin (GCA), plastin-2 (LCP1), annexin A3 (ANXA3), en tetraspanin (CD63 antigeen); eiwitten beïnvloeden van de migratie van neutrofielen in het milieu van een reorganisatie van de extracellulaire matrix, zoals integrine aM/β2, gelatinase (MMP9), en neutrofiele collagenase (MMP8); en NADPH oxidase, een enzym met meerdere subeenheden waaronder cytochroom b-245 (CYBA, Figuur 3) gelegen in het membraan van fagolysosomen van fagocytic cellen en verantwoordelijk voor de oxidatieve uitbarsting die direct pathogenen doodt. Veel van deze proteã nen, vooral defensin-1, waren hoogst overvloedig in steekproeven met bewijsmateriaal van UTIs (b.v., SA_112 en Pm_20, Figuur 3). De bacteriële pathogenen in de twee gevallen waren S. aureus (SA) en P. mirabilis (PM) en, niet onverwacht, waren gelegen aan de linkerkant in de plot van Figuur 2 en naast elkaar in een nad1 cluster (figuur 1). We erkennen dat deze gegevens geschatte hoeveelheden neutrofielen weergeven, gezien het feit dat eiwitten zoals defensin-1, LTF, S100-A8 en S100-A9 ook door urotheliale cellen in de urinewegen worden afgegeven. Echter, hiërarchische clustering analyse geoptimaliseerd voor eiwit leaf order (HCLPO) toonde aan dat deze eiwitten geclusterd met elkaar, ondersteuning van de notie van een dominante rol van neutrofielen in hun productie (aanvullend dossier 4: Figuur A1). Eosinophil peroxidase (EPX) en eosinophil kationic proteïne (ECP) die beide ook effectoren van de reactie op pathogenen waren een orde van grootte minder overvloedig dan neutrofiel-afgeleide proteã nen, dus geen ondersteuning van een belangrijke rol van eosinophils in de ontstekingsreactie. De macrophage-specific migration inhibitory factor (MIF) was aanwezig in nog lagere hoeveelheden, suggereert de bijna-afwezigheid van macrophages als deelnemers aan acute immuunreacties na pathogeen invasie in de urinewegen.

Eiwitprofielen die kwantitatieve bijdragen van neutrofielen, het complementsysteem en erytrocyten aan het totale proteoom van urinaire pellet monsters tonen. De grafiek toont de summed eiwitabundanties, met betrekking tot totale proteome, voor drie biologische eiwitcategorieën. De x-as geeft de identifiers van de up monsters geassocieerd met 110 menselijke proefpersonen. De drie categorieën vertegenwoordigen eiwitten geproduceerd door geactiveerde neutrofielen (blauw), eiwitten sterk tot expressie gebracht in erytrocyten en vrijgegeven bij vasculaire schade (groen), en eiwitten geassocieerd met complementsysteem activiteit en coagulatie (rood). De methode die wordt gebruikt voor de kwantificering van alle eiwitten is de iBAQ methode in de MaxQuant software tool. De volgorde van monsters is gebaseerd op neutrofiel eiwit overvloed, het verminderen van links naar rechts. Om directe vergelijkingen voor de beoordeling van ontstekingen mogelijk te maken, werd de score voor de le-test opgenomen in de grafiek boven elke bar die een monster voorstelt. Onder de x-as, een extra bar toont welke steekproeven werden geassocieerd met de ID van een ziekteverwekker veroorzakend UTI (oranje kleurensegmenten), commensale bacteriën (groene kleurensegmenten) of gebrek aan bacteriële ID ‘ s (geen kleur).

overvloed van geselecteerde neutrofielproteã nen in omhoog steekproeven. Dertien proteã nen die in de legende aan uiterst rechts worden vermeld zijn neutrofielkorreleiwitten. Drie andere eiwitten zijn fibrinogeen-β (FGB; betrokken bij coagulatie), hemoglobine α-subeenheid (HBA1; indicatief voor vasculaire schade), en uromoduline (UMOD; overvloedig in urine van gezonde donoren). De monsters SA_112 en PM_20 vertegenwoordigden UTIs veroorzaakt door respectievelijk S. aureus (SA) en P. mirabilis (PM). Het profiel van LG_23 (Lactobacillus) wees op het gebrek aan ontsteking, en vertegenwoordigde urethrale kolonisatie, mogelijk ook kleine vaginale besmetting van het urinemonster. KP_10 (K. pneumoniae) bleek vaginale infectie te vertegenwoordigen, aangezien vaginale bloeding klinisch werd gediagnosticeerd voor de patiënt. De eiwitprofielen van EC_13 (UPEC) en KP_55 suggereerden de bijna-afwezigheid van ontsteking, en daarom hoogstwaarschijnlijk urethrale kolonisatie. Eiwitten werden gekwantificeerd met behulp van de iBAQ-methode, in elk geval gedeeld door de samengevatte iBAQ-waarden voor het gehele UP-proteoom.

NAD-score

de representatie van neutrofieleiwithoeveelheden in de plot van Figuur 2 is afgeleid van de nad-scores (neutrofielactivering en degranulatie) die ook worden weergegeven in (aanvullend dossier 3: Tabel A3). Figuur 2 bevat LE-scores variërend van negatief (N) tot trace( T), 1, 2 en 3 voor elk monster. In het algemeen wordt een sterke correlatie tussen neutrofieleiwitabundanties en Le-scores waargenomen. De le-score meet de activiteit van leukocytenesterase, die waarschijnlijk voornamelijk elastase (Elaan) en myeloblastine (PRTN3) vertegenwoordigt, twee neutrofielproteasen gekwantificeerd voor acht monsters in Figuur 3. Alle profielen aan de linkerkant van de grafiek (Figuur 2) en 53 van de 60 monsters met meer dan 30% (iBAQ) neutrofieleiwitgehalte hadden LE-scores van 2 of 3. Negenentwintig van de 40 monsters met minder dan 23% (iBAQ) neutrofieleiwitgehalte hadden LE-scores variërend van negatief tot 1. In slechts vier van de elf gevallen waarin de le-score ≥ 2 was, maar het neutrofieleiwitgehalte relatief laag was, was het microscopisch kleine aantal leukocyten hoger dan 11 cellen per hoogvermogensveld (HPF), een drempel die wordt gebruikt om pyurie te definiëren. Over het geheel genomen was er iets minder overeenstemming in de vergelijking van leukocytenaantallen waarbij de drempelwaarde werd vastgesteld op 11 cellen/HPF met meer dan 30% (iBAQ) neutrofieleiwitgehalte: 14 van de 60 gevallen hadden tellingen ≤ 10 (aanvullend dossier 3: Tabel A3). Samengevat lijkt het bepalen van het neutrofielgehalte in urinesedimenten via proteomica minstens zo nauwkeurig als de le-test om ontsteking in de urinewegen te diagnosticeren. Het meet de som van abundanties van 35 eiwitten verrijkt met neutrofielen en kan minder gevoelig zijn voor vals-positieve resultaten in vergelijking met de le-test.

het gehalte aan erytrocyteneiwit dient als diagnostische indicator voor vasculaire schade

vasculaire schade in de urinewegen, typisch geassocieerd met ontsteking, wordt bepaald met dipsticktesten voor hemoglobine en microscopische telling van rode bloedcellen in conventionele urineanalyse. Gezien de hoge verrijking van verschillende proteã nen in erytrocyten, waren wij in staat om een proteomic benadering gelijkwaardig aan conventionele tests voor hematuria te ontwikkelen. Samengevat abundanties van 32 rode bloedcellen eiwitten, waaronder hemoglobine subeenheden, band 3 anion transport eiwit, band 7 integraal membraaneiwit, en koolzuuranhydrase-1, ten opzichte van het totale eiwitgehalte in elk UP monster werden bepaald, weergegeven door de groene staaf segmenten van de plot weergegeven in Figuur 2. Deze eiwithoeveelheden worden vermeld als ERY-scores in (aanvullend dossier 3: Tabel A3) voor elk monster. Er was geen bewijs voor een goede correlatie van NAD-scores of Le-assayresultaten met ERY-scores, wat erop wijst dat, zelfs in de gevallen van detectie van een pathogeen (aangetoond door de kleuring van de horizontale balk aan de onderkant van de grafiek in Figuur 2), neutrofielinfiltratie van de urinewegen niet altijd significante hematurie en weefselschade met zich meebrengt. Door de drempelwaarden voor hematurie op 2+ voor de peilstok test en 4,5% voor de ERY score te stellen, was er overeenstemming onder 81% van alle gevallen. Voor de 21 gevallen waarin de scores niet overeenkwamen, werden microscopische rode bloedceltellingen beoordeeld. Gebruikend een telling groter dan 10 cellen per hoog machtsveld (HPF) als bewijsmateriaal van hematuria, vonden wij dat in twee derde van de gevallen de microscopische analyse met proteomic gegevens overeenkwam. We concluderen dat de proteomic ERY scores een goede kwantitatieve schatting van hematurie in urine.

urinemonsters verrijkt met eiwitten die betrokken zijn bij complementactiviteiten en coagulatie

we merkten op dat de hclpo-analyse toegepast op alle proteoomprofielen in de urine 21 eiwitten bevatte met functionele rollen in coagulatiewegen en / of het complementsysteem (aanvullend dossier 4: Figuur A1). De grondgedachte voor het meten van eiwitabundanties met betrekking tot deze inflammatoire routes gezamenlijk was ook gebaseerd op rapporten van uitgebreide functionele interacties . We identificeerden 42 eiwitten geassocieerd met complementsysteem activiteiten en coagulatie (CAC) waarvan de som van abundanties zijn opgenomen als de CAC score voor elke UP monster in (aanvullend dossier 3: Tabel A3). Het complementsysteem draagt bij aan de acute faserespons en aangeboren immuniteit, en de verschillende componenten zijn pro – of anti-inflammatoir. Een centrale component is complementcomponent C3. C3 rijpt in de opsonine C3b en de anafylactoïde C3A en wordt uitgescheiden in het bloedplasma en de urinewegen na productie in renale tubulaire cellen . C3 speelt een rol bij infectie van de bovenste urinewegen en de opname in en rust van UPEC in uro-epitheliale cellen, mogelijk geassocieerd met het klinische probleem van recidiverende UTI ‘ s . Hoewel de hoeveelheden proteã nen verbonden aan complementactiviteiten en coagulatie niet als hoge neutrofielproteã nen waren, genereerde de hclso-analyse twee steekproefclusters, aangrenzend in de boom en met een totaal aantal van 12 steekproeven, gekenmerkt door relatief hoge overvloed van dergelijke proteã nen (de CAC-clusters in Figuur 1). CAC clusters onthulde een laag aantal gevallen met een ID voor een pathogeen (3 van 12). CAC-scores werden uitgezet in Figuur 2 afgebeeld door de rode staafsegmenten van elk monster (kolom). Hoge totale hoeveelheden CAC-eiwitten correleerden niet goed met hoge hoeveelheden neutrofieleiwitten, wat suggereert dat ontstekingsactiviteiten gemedieerd door het complementsysteem (bijv. C3 en C4) en coagulatie (bijv. fibrinogeen) afzonderlijk kunnen worden gereguleerd bij pathogeen invasie of andere spanningen waaraan de urinewegen bij patiënten werden blootgesteld. Hoge CAC-en ERY-eiwithoeveelheden werden vaker waargenomen om in tandem voor te komen. Veel coagulatie-en complementeiwitten zijn inderdaad overvloedig aanwezig in bloedplasma. Deze lichaamsvloeistof lekt in de urinewegen lumen bij vasculaire schade. In klinische laboratoria worden zelden urineanalysetests toegepast die gelijkwaardig zijn aan de meting van Cac-scores.

precipitatie van urinezuur zouten en geassocieerde urine sediment proteomische profielen

visuele inspectie van de 12 UP monsters in de CAC clusters toonde aan dat negen urinemonsters zeer troebel waren en tien urinekorrels relatief groot met een roze tot lichtbruine kleuring. Deze kenmerken zijn in verband gebracht met hoge verzadigingsniveaus van urinezuur en precipitatie van urinezuur zouten, vooral bij een pH lager dan 6, in de urine. Precipitatie van urinezuur kan een precursor toestand van urinesteenvorming . Het is redelijk om aan te nemen dat de troebele verschijningen van de steekproeven hebben bijgedragen aan het verkeerd identificeren van de precipitaten als bacteriën tijdens de microscopie. Er was slechts één klinisch verslag beschikbaar waarin het optreden van nierstenen werd gemeld (GV_64). Hoewel het proteomic profiel voor deze patiënt geen deel uitmaakte van de CAC cluster, verklaarden de visuele eigenschappen van de steekproef ook troebelheid en een roze-aan lichtbruine kleur van de urinepellet. Wij veronderstellen dat de proteã nen vrij overvloedig in de oplosbare fractie van urine aan het zoutprecipitaten binden en daarom tot verschillende proteã ne abundantiepatronen in de respectieve omhoog steekproeven bijdragen. In sommige CAC-clustermonsters waren eiwitten die over het algemeen oplosbaar zijn in urine en die normaal weinig aanwezig zijn in urinekorrels in overvloed toegenomen ten opzichte van een controle zonder aanwijzingen voor UTI en zoutprecipitaten (LG_21). Voorbeelden van dergelijke proteã nen zijn IgG γ-keten, AMBP (bikunin), en fibrinogeen γ-keten, zoals getoond in Figuur 4. De proteã NEN defensin-1 en de subeenheden HBA1 en HBD van hemoglobine waren het sterkst verhoogd in overvloed in vergelijking met gegevens voor LG_21. Hoewel bekend is dat de meeste eiwitten in Figuur 4 verhoogd zijn in urine en plasma als gevolg van lokaal letsel en bijdragen aan de acute faserespons, toonden deze gegevens een hoge kwantitatieve variabiliteit. Pathologische betekenis, met name letsel in de urinewegen, kan niet worden afgeleid uit deze gegevens. Proteomic profielen werden onlangs gemeld voor de urinesteenmatrix . Onder de vaakst waargenomen proteã nen in de steenmatrijs waren IgG zware kettingen, fibrinogeensubeenheden, S100-A8, lysozyme C, en LTF, proteã nen ook getoond in de plot van Figuur 4. Verdere onderzoeken zijn nodig om de waarde van proteomic analyse te evalueren om biomarkers van urinesteekproeven te identificeren die urinezoutprecipitaten bevatten, B.V. om het risico van niersteenvorming te beoordelen.

aanwezigheid van geselecteerde eiwitten in monsters met bewijs van zoutprecipitatie in de urine. Omhoog steekproeven beginnend met nm_ (geen microben) toonden geen bewijsmateriaal van bacteriële kolonisatie, maar de urinesedimenten hadden een visuele verschijning die urinezuur zout precipitaten voorstellen en waren aanwezig in twee CAC clusters. LG_21 (Lactobacillus) vertegenwoordigde de afwezigheid van ontsteking. De patiënt geassocieerd met monster GV_64 (G. vaginalis) werd gediagnosticeerd met nierstenen. Naast de proteã nen die in de legende van Figuur 3 worden beschreven, zijn andere de complementcomponent C3 (C3), ceruloplasmine (CP), plasminogeen activator inhibitor-3 (PAI-3), AMBP (bikunin), hemoglobine δ-subeenheid (HBD) en immunoglobuline γ-keten (IG gamma). Elk van deze proteã nen zijn betrokken bij de scherpe faserespons, die typisch door weefselverwonding en ziekteverwekkerinvasie wordt geïnitieerd. De steekproefprofielen tonen hoge veranderlijkheid van eiwithoeveelheden, hoewel de verschillende scherpe faseproteã nen vergeleken met controle LG_21 in sommige steekproeven werden verhoogd.

urethrale kolonisatie door commensale bacteriën die geen gastheerimmuunrespons

veroorzaken. zeer parallelle DNA-sequentietechnologieën hebben aangetoond dat urine niet volledig steriel is, en de notie van een urinair microbioom is geëvolueerd als een interessant onderzoeksonderwerp . Het is waarschijnlijk dat externe delen van de urethra, vooral bij vrouwen, worden gekoloniseerd met bacteriën uit perineale en vaginale bronnen. Het is ook duidelijk dat suboptimale inzameling van schone-vangst urine van vrouwelijke patiënten kan resulteren in de besmetting van urine met eiwitten en commensale bacteriën uit de vaginale holte. De hier gepresenteerde gegevens kunnen worden verklaard door, maar maken geen onderscheid tussen de twee bovengenoemde scenario ‘ s. Ongeveer 25% van de proteoomprofielen in de urine die in deze studie werden verkregen, werden verrijkt met eiwitten die in een fysiologisch normaal milieu in de urine worden uitgescheiden (bijv. uromoduline en cytokeratines) of overvloedig worden geproduceerd door epitheliale cellen die worden afgevoerd door mucosale oppervlakken langs de urine-en vaginale traktaten. De hclso-analyse identificeerde vier clusters( figuur 1), één grote cluster met 15 UP-monsters, afgeleid van vrouwelijke patiënten met slechts twee uitzonderingen. De profielen geopenbaard hoge overvloed van cytoskelet eiwitten (bijv., α-actins en annexins), desmosomal eiwitten (bijv., desmoplakin en periplakin), en cornified cel envelop eiwitten (bijv., cytokeratins, cornulin, en kleine proline-rijke eiwitten 3). De proteã nen die tot de eerste twee categorieën behoren zijn aanwezig in de meeste celtypes met inbegrip van urothelial cellen , terwijl gestratificeerd plaveiselepitheel in de urethrale meatus wordt gevestigd en het vaginale kanaal proteã nen van elk van deze categorieën overvloedig produceert . Microscopisch onderzoek van urinesedimenten bevestigde de verhoogde plaveiselepitheliale celinhoud met scores ≥ 2+ voor de meeste monsters aanwezig in de vier clusters( aanvullend dossier 3: Tabel A3), hierna aangeduid als uromoduline en plaveiselepitheliale celclusters met vaginale bacteriën (USEV). Uromoduline , een eiwit dat bijdraagt aan de water/elektrolytenbalans in de urinewegen, was ook overvloedig aanwezig in de monsters van de USEV-cluster. Vaginale bacteriën (Lactobacillus en G. vaginalis) werden geïdentificeerd uit 22 van de 30 monsters, en bacteriën waren afwezig in 5 van deze monsters. Proteomic gegevens bevestigden een zeer laag niveau van ontsteking voor de usev clusters in 74% van de gevallen volgens nad scores zoals duidelijk uit de posities van de steekproeven in de grafiek van Figuur 2. Een representatief profiel van de USEV-cluster is LG-23, met een NAD-score van 20% en een lage abundantie van ontstekingsgeassocieerde eiwitten, met uitzondering van defensin-1 en s100a8 (Figuur 3). Vergeleken met de profielen voor SA_112 en PM_20, waren alle proteã nen die tot ontsteking bijdragen minder overvloedig in LG_23. G. vaginalis kan een opportunistische ziekteverwekker zijn in de urine-en vaginale traktaten. Clustering van de gastheerproteïneprofielen in de USEV-clusters, geselecteerd voor de IDs van Lactobacillus, G. vaginalis, of beide soorten, wees op het ontbreken van een sterke immuunrespons op deze bacteriesoorten. We concluderen dat de proteomic analyse diagnostische waarde heeft door bewijs te leveren van de afwezigheid van een infectie in het urogenitale kanaal van vrouwen.

urethrale kolonisatie door opportunistische pathogenen

de USEV-clusters omvatten drie gevallen waarin veel voorkomende pathogenen in de urinewegen werden geïdentificeerd, UPEC en K. pneumoniae. De twee gevallen (EC_13 en KP_55) vertoonden lage NAD-en ERY-scores, wat overeenkwam met de afwezigheid van neutrofiel-veroorzaakte ontsteking en vasculaire schade. De relatieve overvloed van de proteã nen die in Figuur 3 voor deze twee gevallen worden getoond en hun gelijkenis met het patroon dat Voor LG_23 wordt waargenomen steunde het begrip dat de immune reacties kenmerkend voor UTI niet op kolonisatie door de bacteriën werden opgewekt. Of de gevallen asymptomatische bacteriurie (ASB) vertegenwoordigen, kan niet worden beoordeeld vanwege een gebrek aan kennis over moleculaire immuunresponsen voor ASB. Samengevat, steunen deze gegevens het begrip dat de proteomic profielen gevallen van urethrale kolonisatie door uropathogenen zonder activering van het ingeboren immuunsysteem kunnen identificeren.

Vaginale contaminatie met bewijs van urogenitale infecties

de hclso-analyse genereerde een UP monstercluster dat we vaginale contaminatie (VCO) cluster noemden, weergegeven in Figuur 1. De VCO-clusterprofielen kenmerkten hoge abundanties van cytoskeletal, desmosomal en cornified proteã nen van de celenvelop, maar lage of gematigde hoeveelheden uromodulin, die suggereren dat vaginale eiwitinhoud in deze steekproeven werd verhoogd. De VCO-score, een kwantitatieve verhouding van vijf eiwitten uitgedrukt in cervicovaginaal epitheliaal weefsel met een relatief hoge specificiteit volgens de TiGER database vergeleken met uromoduline, werd berekend. Deze proteã nen waren cornifelin, cornulin, serpin B3, galectine-7, en proteoglycaan mucine-5B. Neutrofielspecifieke pro-inflammatoire moleculen zoals het eiwit S100-A12 en het lysozym (LYZ) en eiwitten die indicatief zijn voor of reageren op vasculaire schade (respectievelijk hba1 en fibrinogeen-β) waren meer aanwezig in de VCO-cluster dan in de USEv-cluster, zoals in Figuur 3 voor KP_10 is aangetoond in vergelijking met LG_23. De VCO cluster bevatte 14 Monsters, alle behalve één afgeleid van vrouwelijke patiënten, waarvan de helft geassocieerd was met een ID voor een uropathogeen. In vijf monsters werd G. vaginalis of Lactobacillus geïdentificeerd. Klinisch bewijs suggereert vaginale bloedingen voor de patiënt met betrekking tot monster KP_10, ter ondersteuning van de diagnose van een urogenitale of vaginale infectie met K. pneumoniae. De VCO-scores zijn opgenomen in aanvullend dossier 3: Tabel A3. Een Wilcoxon rank sum-test die de VCO-scores van de VCO-en USEV-clusters vergelijkt, leverde een p-waarde op van 0,017, wat suggereert dat de score nuttig is om no Of minor te onderscheiden van belangrijke vaginale contaminatie in urinemonsters. Er kunnen geen duidelijke beoordelingen worden gemaakt met betrekking tot het nut van de VCO score om een UTI te onderscheiden van vaginale infectie.

Proteomic analyse van urine sedimenten identificeert microben met gevoeligheid en specificiteit niveaus vergelijkbaar met die van urine cultuur

we identificeerden bacteriën uit 76 UP monsters, en Candida albicans uit een UP monster (63% van alle geanalyseerde gevallen). In slechts 55 gevallen werden urinekweken uitgevoerd, waarvan 44% ten minste één pathogeen identificeerde, 24% commensale organismen en 17% Geen microbiële groei vertoonde (aanvullend dossier 3: Tabel A3). In de context van de identificatie van pathogenen waren de proteomische gegevens en UC-resultaten niet altijd met elkaar in overeenstemming (Tabel 1). Verschillende redenen lijken bij te dragen aan de meningsverschillen. De uitdagingen om metaproteomic gegevens te interpreteren die op de geà dentificeerde microbiële proteã nen worden gebaseerd volgen. Ten eerste kunnen eiwit-ID ‘ s voor minder voorkomende uropathogenen worden gemist vanwege de afwezigheid van hun eiwitsequenties uit de gezochte database. Bacteriële species vertegenwoordigd in de database werden geà dentificeerd via proteomic analyse (K. pneumoniae en E. faecalis) in twee gevallen, maar de UC gegevens suggereerden de aanwezigheid van de fylogenetic dichte species Enterobacter aerogenes en E. faecium, respectievelijk. Ten tweede, zijn de microbiële organismen huidig in lage overvloed in urine moeilijker om in aanwezigheid van hoogst overvloedige microben te identificeren, vooral als de microbiële species uitgebreide opeenvolgingsidentiteit onder orthologe proteã nen delen. De ec_85-en kp_11-profielen in (aanvullend bestand 5: Dataset A1) illustreren dit probleem, en hebben in het bijzonder betrekking op de Enterobacteriaceae-familie die de meerderheid van alle UTI ‘ s veroorzaken. Onnauwkeurige genomische annotaties, bijv. ontbrekende genen, voor één species (huidig in de omhoog steekproef) resulteren in de identificatie van orthologe proteã nen correct geannoteerd in het genoom van een verwante species (maar afwezig in de omhoog steekproef). De kleine tryptic peptides worden geà dentificeerd in een Jachtgeweer proteomic analyse, die onjuiste eiwittoewijzingen door het onderzoekalgoritme waarschijnlijker in gevallen van hoogst opeenvolgingsidentiteit maakt. Ten derde, kan ID van bacteriën huidig in lage tellingen in urine, minder dan ~ 10.000 cellen / mL, gecombineerd met een hoge gastheer proteomic achtergrond worden gemist omdat gastheer en microbiële proteã nen niet afzonderlijk worden onderzocht door LC-MS/MS lage CFU tellingen voor bacteriële organismen volgens UC gegevens toonde een lagere match rate met proteomic IDs dan hoge CFU tellingen (aanvullend dossier 3: Tabel A3). In tegenstelling, hebben proteomic identificaties van microben de voordelen dat zij cultuur-onafhankelijk zijn en dat zij informatie over virulentie, antibiotische weerstand, ondervonden spanning, en de groeistaat voor de geà dentificeerde ziekteverwekkers verstrekken. Twee voorbeelden van dergelijke uitgebreide gegevens worden gegeven in (aanvullend bestand 5: Dataset A1). In één dataset (EC_85) werden eiwitten van UPEC, G. vaginalis en Lactobacillus geprofileerd. In de andere dataset (KP_11) was de oorzaak van de UTI K. pneumoniae. Tabel 1 geeft een overzicht van de vergelijking van de nitriet-test, waarbij Enterobacteriaceae in urine worden geïdentificeerd op basis van hun vermogen om nitraten te verminderen, en UC-resultaten met de proteomische gegevens. 90% van de positieve nitriet tests had inderdaad betrekking op gevallen van bacteriurie met UPEC of K. pneumoniae als de veroorzaker, en werden onveranderlijk geïdentificeerd met de proteomic en UC methoden ook. In tegenstelling tot de proteomic analyse bleken nitriet tests niet gevoelig genoeg te zijn om Enterobacteriaceae in tien gevallen te identificeren. De nitriet tests waren niet positief in 21 gevallen waar de ID van proteomic analyses G. vaginalis was. Betreffende verschillen in pathogeen ID ‘ s via proteomic Versus methodes van UC, werden β-hemolytic streptokokken geà dentificeerd door experimenten van UC in drie gevallen terwijl proteomic gegevens aanwezigheid van G. vaginalis suggereerden. Zoals blijkt uit Tabel 1 waren de aantallen overeenkomende ID ‘ s voor UPEC en in mindere mate K. pneumoniae hoog. Samengevat, toonde de proteomic methode hogere gevoeligheid dan de nitriet test en gevoeligheid en specificiteit niveaus vergelijkbaar met UC. De hoge gastheer proteomic achtergrond in een urinesteekproef vermindert de gevoeligheid voor microbiële identificatie.