een kritische kijk op conservatieve mutaties

Abstract

door de oppervlaktesamenstelling van een set proteïne 3D-structuren te analyseren, aangevuld met voorspelde informatie over de oppervlaktesamenstelling voor homologe eiwitten, hebben we significante aanwijzingen gevonden voor een laagsamenstelling van eiwitstructuren. In de binnenste en buitenste delen van eiwitten is er een netto negatieve lading, terwijl het midden een netto positieve lading heeft. Bovendien blijkt uit onze bevindingen dat het concept van conservatieve mutatie substantieel moet worden herzien, zo werden er zeer verschillende ruimtelijke Voorkeuren gevonden voor glutaminezuur en asparaginezuur. De alanine-screening die vaak wordt gebruikt in eiwittechnische projecten omvat de vervanging van residuen door alanine, gebaseerd op de veronderstelling dat alanine een `neutraal’ residu is. Echter, alanine heeft een hoge negatieve correlatie met alle behalve de apolaire residuen. Daarom stellen wij voor om bijvoorbeeld serine te gebruiken als vervanging voor de residuen die negatief gecorreleerd zijn met alanine.

Inleiding

na het vouwen van een peptideketen in een 3D-eiwitstructuur worden sommige residuen overgebracht van een polaire omgeving naar een meer apolaire omgeving in het binnenste van het gevouwen eiwit. Deze overdracht wordt gedreven door de thermodynamische eigenschappen van de aminozuren en het oplosmiddel. Door moleculaire evolutie heeft de natuur voor geschikte functie en stabiliteit van de resulterende proteã ne geselecteerd. Voor kleine tot middelgrote eiwitten – in de gevouwen structuur—zijn slechts enkele residuen volledig begraven ( Chothia, 1976 ; Miller et al., 1987; Petersen et al., 1998), terwijl de meeste residuen slechts gedeeltelijk begraven zijn. De variatie in oplosmiddeltoegankelijkheid is afhankelijk van de eigenschappen van het betrokken residu en wordt weerspiegeld in de aminozuursamenstelling in de gehele eiwitstructuur. Deze verschillen in het oplosmiddeltoegankelijkheidsprofiel hebben brede toepassingen in diverse structuurvoorspellingsmethoden gevonden (Holbrook et al., 1990; Rost and Sander, 1994; Thompson and Goldstein, 1996 ). Ook het gebruik van omgevingsspecifieke substitutiematrices (Donnelly et al., 1994 ; Wako and Blundell, 1994) zijn waardevol gebleken. De sequentiële omgeving van aminozuren is eerder onderzocht (Vonderviszt et al., 1986) en het gebruik ervan is gevonden in bijvoorbeeld lusvoorspelling (Wojcik et al., 1999) en secundaire structuurvoorspelling (Chou en Fasman, 1978 ; Chandonia en Karplus, 1999; Jones, 1999 ). Er werd geen significante correlatie gevonden tussen residuen, sequentiële neighbour preference.De ruimtelijke buurt rond individuele residuen is ook eerder onderzocht (Burley en Petsko, 1985 ; Bryant en Amzel, 1987 ; Miyazawa en Jernigan, 1993; Petersen et al., 1999 ). Verder zijn ruimtelijke contacten bestudeerd om contactmogelijkheden voor de verschillende aminozuurinteracties af te leiden ( Brocchieri en Karlin, 1995 ; Miyazawa en Jernigan, 1996 , 1999 ). De gemeenschappelijke strategie bestaat erin het aantal contacten binnen een bepaalde afstand te bestuderen. De literatuur lijkt echter verstoken van onderzoek naar onafhankelijke contacten en ook van rapporten waarin gebruik wordt gemaakt van de ingebedde informatie over de oplosmiddeltoegankelijkheid van de betrokken residuen.

er is een tweestatenvoorspelling van oplosmiddeltoegankelijkheidscorrelatie tussen hydrofobiciteit, neiging tot begraven contact en de locatie in het voorspellingsvenster gemeld ( Mucchielli-Giorgi et al., 1999 ). Er wordt echter geen correlatie tussen afzonderlijke residudistributies beschreven.

het is belangrijk onderscheid te kunnen maken tussen correct gevouwen en verkeerd gevouwen modelstructuren. Er is op gewezen dat potentiële op energie gebaseerde methoden geen goed onderscheid maken tussen gevouwen en verkeerd gevouwen structuren. Echter, structurele kenmerken zoals begraven pooloppervlak (Overington et al., 1992) en aantal polaire contacten (Bryant en Amzel, 1987; Golovanov et al., 1999) zijn waardevol gebleken.

in de proteïne-engineering wordt het concept van conservatieve mutaties vaak gebruikt. Het algemene idee is dat een vervanging van een aminozuur door een ander aminozuur met vergelijkbare fysisch-chemische eigenschappen de stabiliteit en functie van het eiwit niet zal beïnvloeden. Het onderhavige document toont aan dat de ruimtelijke voorkeuren voor soortgelijke residuen in eiwitstructuren onder vergelijkbare omstandigheden dramatisch kunnen verschillen (in deze context oplosmiddeltoegankelijkheid).

de resultaten van de neighbour-analyse zullen waardevol zijn voor modelvalidatie, als hulpmiddel voor structuurvoorspelling en vooral als leidraad bij het zoeken naar stabiliteitsverhogende mutaties.

methoden

de gebruikte sequenties zijn een subset van de 25% sequence identity set van niet-homologe structuren (Hobohm et al., 1992 ; Hobohm and Sander, 1994) afgeleid van de eiwitstructuur databank PDB (Bernstein et al., 1977 ). Slechts één keten eiwitopeenvolgingen werden gebruikt. De resulterende dataset bestond uit 336 single-chain sequenties met een maximale pairwise sequentie-identiteit van 25%. De subset werd uitgebreid door het gebruik van de bijbehorende hssp-bestanden (Dodge et al., 1998 ). De totale gegevensverzameling bevatte 8379 uitgelijnde sequenties en 1 415 986 residuen. Dit komt overeen met 6,7% van alle residuen in versie 34 van SWISS-PROT (Bairoch en Apweiler, 1997 ). De lengte van de sequenties lag tussen 64 en 1017 residuen. De resolutie van de gebruikte Röntgenstructuren varieerde tussen 1,0 en 3,0 Å, met een gemiddelde van 2,0 Å. Verder, bevatte de subset 31 structuren die door NMR worden opgelost. Echter, alle waterstof-atoom coördinaten werden weggegooid. Om een mogelijke bias te controleren die door het gebruik van de homologe opeenvolgingen wordt geà ntroduceerd werd de volledige analyse gedaan met en zonder de uitgelijnde opeenvolgingen. Er werden geen significante verschillen waargenomen, hoewel de geringere omvang van de kleinere van de twee datasets, zoals verwacht, tot meer ruis leidde.

de ruimtelijke buren van elk residu werden bepaald op basis van de toegankelijkheid van het oplosmiddel en de ruimtelijke afstand. Het oplosmiddel toegankelijkheid werd genomen uit de respectieve HSSP-bestanden (Dodge et al., 1998 ). Voor elk oppervlakteresidu werden de naburige oppervlakteresiduen gegroepeerd naar hun Afstand tot het betrokken residu. De afstand tussen twee residuen werd berekend als de kortste afstand tussen de verzameling van alle mogelijke paren atomen in de twee residuen. We gaan ervan uit dat de uitlijning in het hssp-bestand impliceert dat buren in de hoofdreeks ook buren in de uitgelijnde reeksen zijn en dat de oplosmiddeltoegankelijkheid behouden blijft ( Andrade et al., 1998; Goldman et al., 1998 ). Het verwachte aantal buurinteracties tussen residuen van type i en j wordt berekend door

waarbij xi en xj de fractie van aminozuur i en j in de dataset zijn voor het afstandsbereik d en bij een oplosmiddeltoegankelijkheid groter dan de cut-off ACC en N0 het totale aantal waargenomen buurcontacten is. De score, Sij / d, ACC, wordt berekend door

dit geeft een negatieve score voor achtergestelde buurparen en een positieve score voor favoriete interacties. De score waarde Sij/d, ACC kan worden omgezet in een schijnbare thermodynamische parameter door vermenigvuldiging met RT .

de netto lading in elke laag van het eiwit werd berekend. Asparaginezuur en glutaminezuur worden als negatief geladen beschouwd en arginine en lysine als positief geladen. Histidine wordt ofwel beschouwd als niet geladen of positief geladen. De relatieve netto last, Δ qrel, definiëren wij als

waarbij Npositief het aantal positieve residuen is, Nnegatief het aantal negatieve residuen en Ntotaal het totale aantal residuen in die specifieke laag.

The PDB identification codes for the structures used are 1ptx, 2bbi, 1hcp, 1iml, 1cdq, 1vcc, 1nkl, 1tiv, 2abd, 2hts, 1tpg, 1fbr, 1pco, 1who, 1beo, 2ncm, 1fim, 1tlk, 1xer, 1onc, 1rga, 1erw, 1fd2, 1put, 1fkj, 1jpc, 1thx, 1jer, 1ccr, 1wad, 2tgi, 1pls, 1neu, 4rhn, 1rmd, 1hce, 1hfh, 1tam, 2pf1, 1bip, 1whi, 1yua, 1bp2, 1zia, 4fgf, 7rsa, 1bw4, 2vil, 1eal, 1rie, 1doi, 3chy, 1cpq, 1msc, 1mut, 1rcb, 1lzr, 1htp, 1lid, 1lis, 1lit, 1kuh, 1nfn, 1irl, 1poc, 2tbd, 1cof, 1pms, 1rsy, 1snc, 1eca, 1jvr, 2end, 1anu, 5nul, 1fil, 1jon, 1lcl, 1itg, 1tfe, 1maz, 1pkp, 1lba, 1vsd, 2fal, 1ash, 1def, 2hbg, 1div, 1gds, 1grj, 1i1b, 1ilk, 1rcy, 1sra, 1ulp, 1mbd, 1aep, 1jcv, 2gdm, 1phr, 1rbu, 1esl, 1hlb, 1mup, 1vhh, 1gpr, 1btv, 1cyw, 1klo, 1l68, 3dfr, 2cpl, 1sfe, 1huw, 5p21, 1ha1, 1wba, 1lki, 2fha, 1prr, 2fcr, 1amm, 1cid, 1hbq, 1cdy, 2stv, 153l, 1rec, 1xnb, 2sas, 1gky, 1knb, 1ryt, 1zxq, 1har, 1cex, 1chd, 2tct, 2ull, 1gen, 1iae, 1nox, 1rnl, 2gsq, 1cfb, 1dyr, 1nsj, 2hft, 1fua, 2eng, 1thv, 1hxn, 2abk, 9pap, 1lbu, 3cla, 1vid, 2ayh, 2dtr, 1gpc, 1dts, 1jud, 1emk, 1ois, 1akz, 1sgt, 1ad2, 1nfp, 1din, 1lrv, 1dhr, 1bec, 1lbd, 1dpb, 1jul, 1mrj, 1fib, 1hcz, 1mml, 1vin, 1dja, 2cba, 3dni, 1lxa, 1arb, 1rgs, 1tys, 3tgl, 1ako, 1eny, 1ndh, 2dri, 1xjo, 1drw, 1kxu, 2prk, 1cnv, 1tfr, 1ytw, 1iol, 2ebn, 1tml, 1han, 1xsm, 1pbn, 1amp, 1ryc, 1bia, 1vpt, 1csn, 2ora, 1ctt, 1bco, 1fnc, 1gym, 1pda, 1cpo, 1esc, 2reb, 1mla, 1sig, 8abp, 1ghr, 1iow, 2ctc, 1gca, 1sbp, 1ede, 1pgs, 2cmd, 1anv, 1gsa, 1tag, 1dsn, 2acq, 1cvl, 1tca, 2abh, 2pia, 1pot, 1vdc, 1axn, 1msk, 1hmy, 2bgu, 1ldm, 1dxy, 1ceo, 1nif, 1arv, 1xel, 1uxy, 1rpa, 2lbp, 3pte, 1uby, 1fkx, 1pax, 3bcl, 1air, 1mpp, 2mnr, 1eur, 1cem, 1fnf, 1pea, 1omp, 2chr, 1pud, 1kaz, 1mxa, 1edg, 2sil, 1ivd, 1pbe, 1svb, 1ars, 1oyc, 1inp, 1oxa, 1eft, 1phg, 1cpt, 1iso, 1qpg, 2amg, 1uae, 1gnd, 2dkb, 1gpl, 1csh, 4enl, 1pmi, 1lgr, 1nhp, 1gcb, 1bp1, 1geo, 2bnh, 3grs, 1gln, 1gai, 2pgd, 2cae, 2aaa, 1byb, 1smd, 2myr, 3cox, 1dpe, 1pkm, 1ayl, 1crl, 1ctn, 1clc, 1tyv, 2cas, 1ecl, 1oxy, 1vnc, 1gal, 1dlc, 1sly, 1dar, 1gof, 1bgw, 1aa6, 1vom, 8acn, 1kit, 1taq, 1gpb, 1qba, 1alo en 1kcw.

resultaten en discussie

de verdeling van geladen residuen in verschillende lagen van de proteïne 3D-structuur en de totale netto lading zijn weergegeven in Figuur 1 . In de binnenste en buitenste delen van eiwitten is er een netto negatieve lading, terwijl het midden een netto positieve lading heeft. Deze schijnbare drie lagen structuur met wisselende lading bloot de negatief geladen buitenste laag aan het oplosmiddel is interessant. Een dergelijke organisatie zorgt voor een zekere mate van radiale ladingsneutralisatie en kan mogelijk bijdragen tot een strakke verpakking van het eiwit. Ook deze ladingsorganisatie van de oppervlaktelaag kan belangrijke elektrostatische geleiding bieden tijdens het vouwen. Omgekeerd zal het veranderen van pH naar zure of alkalische omstandigheden waarbij subgroepen van de titreerbare residuen niet worden geladen, de verpakking van residuen aan het oppervlak van het eiwit destabiliseren. Begraven, zure aminozuren kunnen worden gevonden in verschillende eiwitstructuren en deze residuen spelen belangrijke functionele rollen in, bijvoorbeeld, trypsine (McGrath et al., 1992), ribonuclease T1 ( Giletto and Pace, 1999) en thioredoxin (Dyson et al., 1997; Bhavnani et al., 2000 ). De gerapporteerde drie lagen structuur wordt waargenomen zowel met als zonder de uitgelijnde sequentie en wordt daarom niet veroorzaakt door een bias geïntroduceerd door het behoud van de begraven, geladen groepen binnen een eiwit familie.

de ruimtelijke buren rond elk type residu werden berekend zonder onderscheid te maken naar de toegankelijkheid van oplosmiddelen. Met de opmerkelijke uitzonderingen van tryptofaan en cysteïne, werden aminozuren niet vaak waargenomen als ruimtelijke buren van identieke residu types. Deze ontwikkeling was niet afhankelijk van de keuze van de afstandsgrens (resultaten niet getoond). De verschillen in verdeling waren opmerkelijk klein tussen de verschillende aminozuren voor een cut-off van 8 Å, wat erop wijst dat 8 Å een voldoende grote afstand is om de verdeling onafhankelijk te maken van de aard van het centrale residu. Deze observatie leidde tot het gebruik van 8 Å als de grootste afstand tussen buren onderzocht in detail.

Figuur 2 toont de scorewaarden voor alle aminozuurbuurparen met tryptofaan, glycine, alanine, proline, serine, histidine, lysine en asparaginezuur voor buurparen met een oplosmiddeltoegankelijkheid van ten minste 20%. De resultaten voor de andere aminozuren zijn beschikbaar op onze homepage ( http://www.bio.auc.dk/ ). Er zijn ook scorewaarden berekend voor andere cut-offs voor de toegankelijkheid van oplosmiddelen. Het aromatische residu tryptofaan is een van de slechts twee residu ‘ s met een duidelijke voorkeur voor contacten met hetzelfde residutype (het andere is cysteïne). Ook interacties met de andere aromatische residuen hebben de voorkeur. Interessant is dat de interacties tussen tryptofaan en de twee zure residuen (asparaginezuur en glutaminezuur) verschillend lijken. Terwijl tryptofaan en glutaminezuur minder vaak worden waargenomen dan verwacht, wordt het tegenovergestelde waargenomen voor tryptofaan en asparaginezuur. Glycine toont de typische negatieve score voor interacties met hetzelfde residutype. Ook lijkt glycine geen buren te hebben in de nabije ruimtelijke omgeving (≤3,5 Å). Deze ondervertegenwoordiging van Buren in de buurt is nog duidelijker voor proline. We interpreteren deze ondervertegenwoordiging als een teken van de voorkeur voor lus die Proline-residuen hebben. Het gebrek aan interactie met alle andere aminozuren in zijn nabijheid wijst op de meeste contacten die met oplosbare molecules zijn. Echter, proline heeft een overvloed aan contacten op een grotere afstand (4-5 Å). Histidine is interessant omdat het tekenen vertoont van zijn aromatische eigenschappen, door de voorkeur voor contacten met aromatische residuen (~3,5 Å), en zijn polariseerbare karakter, door voorkeurscontacten met negatief geladen residuen (~3 Å). Het basisch aminozuur lysine heeft zoals verwacht een duidelijke negatieve score voor contacten met andere lysines. De gunstige elektrostatische interacties met de zure aminozuren zijn duidelijk.

enkele van de interessantste paarinteracties zijn weergegeven in Figuur 3 . Figuur 3A toont het zoutbrugpaar lysine-asparaginezuur. De sterke over-representatie gezien bij 3 Å scheiding is consistent met het klassieke zout brug concept. De over-representatie van lysine–asparaginezuur paren in de meest aan oplosmiddelen blootgestelde lagen waargenomen bij 5,5 tot 6 Å is onverwacht. We stellen voor dat ladingsnetwerken op het eiwitoppervlak deze observatie kunnen veroorzaken. In Figuur 3B wordt het resultaat voor het glutaminezuur–asparaginezuur paar getoond. Het meest voor de hand liggende kenmerk is de verwachte ondervertegenwoordiging van dit paar. Echter, dicht bij het eiwitoppervlak lijkt dezelfde beperking niet aanwezig te zijn. Ook hier stellen we voor dat bovengrondse ladingsnetwerken bijdragen aan deze observatie. In de figuren 3C en D worden de aminozuurparen tryptofaan–glutaminezuur en tryptofaan–asparaginezuur weergegeven. De algemene overtuiging dat een glutaminezuur aan asparaginezuur mutatie conservatief is, is in strijd met de getoonde waarnemingen. Het tryptofaan-glutaminezuur paar is sterk ondervertegenwoordigd in de sterk oplosmiddelhoudende lagen van de eiwitten. Verrassend genoeg kan hetzelfde niet worden gezegd voor het tryptofaan–asparaginezuur paar, waar een over-representatie wordt waargenomen voor het 3,5 tot 6 Å afstand interval. Soortgelijke, maar minder uitgesproken, waarnemingen werden gedaan voor de tyrosine–glutaminezuur en tyrosine-asparaginezuur paren. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de paren fenylalanine–glutaminezuur en fenylalanine–asparaginezuur. Het enige verschil tussen glutaminezuur en asparaginezuur is de lengte van de zijketen. Gemeenschappelijk voor zowel tryptofaan als tyrosine is hun polariseerbaarheid, in tegenstelling tot fenylalanine. Wij geloven dat op het oppervlak gelokaliseerde tryptofanen die betrokken zijn bij het definiëren van eiwitfunctionaliteit gepolariseerd worden door hun lokale elektrostatische omgeving. Hoewel we geen kwantitatieve verklaring kunnen geven, is het aannemelijk dat de verschillen tussen de verschillende ketenlengte van glutaminezuur en asparaginezuur de voorkeur geven aan de nabijheid van tryptofaan. Er is aangetoond dat asparaginezuur de neiging heeft om gunstige interacties te hebben tussen de zijketencarbonylgroep en de backbone-carbonylgroep ( Deane et al., 1999), resulterend in een ringachtige structuur. Vergelijkbare conformaties zijn niet waargenomen voor glutaminezuur. In de figuren 3E en F worden de histidine-asparaginezuur – en serine-histidineparen weergegeven. Aangezien deze drie residuen de residu ‘ s op de actieve plaats van een breed scala van hydrolasen vormen, hebben zij een bijzonder belang. Er is een oververtegenwoordiging van histidine-asparaginezuur paren in de hoogst oplosbare toegankelijke gebieden. De afstand is groter dan de typische afstand waargenomen in actieve site spleten. De kleine, maar significante oververtegenwoordiging in het 3 Å-bereik komt echter overeen met de klassieke afstanden tussen histidine en asparaginezuur in hydrolasen. Figuur 3E toont de duidelijke voorkeur voor contacten tussen begraven histidines en asparaginezuur. Wij geloven dat deze eigenschap een belangrijk deel van de moleculaire evolutie van de novo katalytische plaatsen is. Het opslaan van mogelijke katalytische ‘triads’ in niet-functionele omgevingen maakt het aantal aminozuursubstituties dat nodig is om de site te activeren kleiner.

het meest opvallende kenmerk in Figuur 3F is de duidelijke ondervertegenwoordiging van serine-histidineparen in sterk aan oplosmiddelen blootgestelde omgevingen. Een zwakke oververtegenwoordiging van het serine–histidinepaar wordt waargenomen bij 3 Å in de minder oplosmiddelvrije gebieden. Aldus wordt de aanwezigheid van de katalytische triade blijkbaar hoofdzakelijk bepaald door de voorkeur van het histidine–asparaginezuur paar hoewel het serine–histidine paar gelijkaardige, maar veel zwakkere, tendensen openbaart.

de aminozuursamenstelling van elke oplosmiddeltoegankelijkheidslaag werd bepaald. Zoals verwacht zijn de begraven delen van de proteã nen samengesteld uit een hogere hoeveelheid apolaire residuen dan de meer aan oplosmiddelen blootgestelde lagen. De correlatie tussen de aminozuursamenstelling werd berekend uit de gegevens van de samenstelling van de individuele structurele lagen. De aminozuren die gelijkaardige voorkeuren voor oplosmiddelcontact en lokale omgeving hebben worden verwacht om een hoge positieve correlatie wegens gelijkaardige tendensen in hun distributie te tonen. Daarom zullen aminozuren die een negatieve correlatie vertonen verschillende voorkeuren hebben voor de lokale omgeving en daarom niet compatibel worden geacht, dat wil zeggen dat een enkele plaatsmutatie van dit type op deze locatie niet wordt aanbevolen. Aangezien de apolaire residuen overvloedig aanwezig zijn in de kern en een geleidelijke afname vertonen naarmate de oplosmiddeltoegankelijkheid in het algemeen toeneemt, is de correlatie tussen de apolaire residuen positief (Figuur 4 ). In tegenstelling, zijn de polaire residuen overvloediger in de hoogst blootgestelde delen en vandaar negatief gecorreleerd met de apolaire residuen. Histidine en threonine gedragen zich duidelijk anders. Ze vertonen positieve correlatie met elkaar, maar weinig correlatie met een van de andere kolommen, met uitzondering van arginine en glycine. Dit wordt veroorzaakt door het lage voorkomen van histidine en threonine in zowel de begraven als hoogst blootgestelde gebieden en hun vrij hoog voorkomen in de medium blootgestelde lagen. Histidine heeft een positieve correlatie met twee aromatische residuen, tryptofaan en tyrosine, en met de zwakke polaire threonine en polaire arginine. Opnieuw interpreteren we dit als een teken van zowel de aromatische eigenschappen als de ladingseigenschappen van histidine. De zwak polaire residu ‘s hebben niet dezelfde duidelijke overeenkomst in verdeling als de polaire en apolaire residu’ s. Proline en serine lijken nauwer verwant te zijn aan de polaire residuen. Het zwak polaire residu alanine heeft een positieve correlatie met de apolaire residu ‘ s. We stellen voor dat mutaties tussen residu ‘ s met een hoge positieve correlatie een grote kans hebben om de thermodynamische stabiliteit van de 3D-structuur te behouden. Dit geldt met name voor opgeladen residuen. In tegenstelling, zijn de residuen met een hoge graad van negatieve correlatie typisch residuen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen, die niet kunnen worden uitgewisseld zonder de fysische chemie van de proteã ne te veranderen. De niet-gecorreleerde residuen omvatten residuen met een speciale rol in de structuur, bijvoorbeeld sommige residuen die vaak bij katalyse betrokken zijn. Wij geloven dat de observatie dat proline zich in onze studie op dezelfde manier gedraagt als Polaire residu ‘s gerelateerd is aan de structurele rol van proline residu’ s en zijn voorkeur voor lussen en bochten. De alanine-screening die vaak wordt gebruikt in eiwittechnische projecten omvat de vervanging van residuen door alanine, gebaseerd op de veronderstelling dat alanine een `neutraal’ residu is. Echter, onze gegevens tonen aan dat alanine een hoge negatieve correlatie heeft met alle behalve de apolaire residuen. Daarom stellen wij voor om bijvoorbeeld serine te gebruiken als vervanging voor de residuen die negatief gecorreleerd zijn met alanine.

in het advies van de auteurs geeft dit document belangrijke nieuwe informatie over de structuurstructuur van eiwitten. De eiwitoppervlakte zou als multi-layered structurele eigenschap van de proteã ne moeten worden gezien, waar elke laag zijn specifieke samenstelling en resulterende kenmerken heeft. Deze eenvoudige belangrijke observatie wij geloven zal van significant belang zijn voor vele eiwit engineering strategieën die gericht zijn op modificatie van oplosmiddel blootgestelde residuen.

P. H. J. bedankt de Onderzoeksraad van Noorwegen voor financiële steun (NFR-116316/410). S. B. P. spreekt zijn dankbaarheid uit voor de financiële steun van Obelsk Familiefond en Mål-2.