Gap junction eiwit Connexin-43 is een directe transcriptionele regulator van N-cadherin in vivo

Embryo manipulatie

Volwassen X. laevis blijven op 17 °C en wordt gebruikt volgens de voorschriften van de Biologische Service-Unit van de University College London, die met het BRITSE Home Office richtsnoeren die zijn vastgesteld in de Wet Dieren 1986 als described45. X. laevis embryo ‘ s werden verkregen en geënsceneerd zoals eerder beschreven 46,47. Om specifiek de neurale kam te richten, werden de embryo ‘ s ingespoten in de dierlijke ventrale blastomeren bij het acht-celstadium aan één kant voor alle experimenten, behalve wanneer embryonale lysaten werden gebruikt. In dit geval werden embryo ‘s geïnjecteerd in beide dierlijke zijden van twee-cel Stadium embryo’ s. Microinjecties van Embryo ‘ s werden uitgevoerd volgens 48. Indien nodig werden fluoresceïne-dextran (FDX; Invitrogen, D1821, 20 ng) of rhodamine-dextran (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng) als verklikstoffen gebruikt. Oligomorpholinos tegen X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘-TTCCTAAGGCACTCAGTCACCCAT-3’, Cx43MO2; 8-24 ng, 5 ‘- AAAAAATGGTTTTCTTGGTCGA-3′) en BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′ – AACCGGGTTTAAAGGCTCCT-3′) werden gesynthetiseerd en geleverd door Gene Tools LLC. Equimolaire concentraties van standaard controle morfolino (CTLMO: 3′-ATATTAACATTGACTCCATTCTCC-5’) werden gebruikt. De hoeveelheden morfolino ‘s komen overeen met de hoeveelheden die aan één zijde van embryo’ s in het achtcellige stadium werden geïnjecteerd, terwijl de andere zijde als interne controle werd gebruikt. Wanneer de embryo ‘ s voor inzameling van embryonale lysaten werden gebruikt, werden zij in twee-celstadium in zowel dierlijke blastomeren ingespoten en werden het dubbele van de genoemde dosering gebruikt. Om de efficiëntie van cx43mos op endogene cx43 mRNA te testen, voerden we western blot analyse uit. Beide cx43mos verlaagden efficiënt het eiwitgehalte van de endogene cx43fl en Cx43iso (Fig. 3a, b). Om de BTF3MO-efficiëntie te valideren, hebben we de btf3-eiwitexpressie, die verlaagde BTF3-niveaus in BTF3MO-cellen vertoonde in vergelijking met CTLMO (aanvullende Fig. 3a).

in situ hybridisatie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 49, 50. Kort, embryo ‘ s werden gefixeerd in MEMPFA, gevolgd door overnight hybridisatie met digoxigenine-geëtiketteerde sondes, geïncubeerd met een AP antilichaam en AP activiteit werd ontwikkeld gebruikend NBT/BCP substraten. Digoxigenine-geëtiketteerde RNA-sondes werden voorbereid voor foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22), en sox1054, sox954. C3 (1 µg/ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) en twist (0,7 µg / ml) werden gebruikt om neurale crest-inductie te beoordelen, twist (0.7 µg/ml) voor neurale crestmigratie, n-cadherine (1 µg/mL) voor het bepalen van expressieniveaus en btf3 (0,7 µg / mL) expressiepatroon. De immunostaining van de gehele berg werd uitgevoerd zoals eerder beschreven 55 met behulp van cx43 antilichaam (1:1000, Sigma, C6219). Kort, embryo ‘s werden gefixeerd in MEPMFA en’ s nachts geïncubeerd met het antilichaam bij de beschreven verdunning.

dierenkap explantaten werden ontleed uit Xenopus blastulas (Stadium 8) met behulp van een standaardtechniek 48,56 en bereid voor in situ-hybridisatie zoals hierboven beschreven. Voor dierlijke GLB-analyses, werd 500 pg mRNA ingespoten in de dierlijke kant van de twee blastomeren van tweecellige Stadium embryo ‘ s. De analyse van ISH werd uitgevoerd op 20-25 embryo ‘ s per voorwaarde voor elk onafhankelijk experiment.

neurale crestmanipulatie en beeldvorming

neurale cresttransplantaties werden uitgevoerd zoals eerder gerapporteerd 57. Kort, werden de neurale die kam van Stadium 18 fluorescently geëtiketteerde embryo ‘s wordt genomen ontleed met wenkbrauwmessen en geënt in ongelabelde gastheerembryo’ s. Voor in vitro experimenten, craniale neurale crest explantaten werden ontleed in Stadium 18 met behulp van een standaard technique58,59 en verguld op fibronectine (Sigma, F1141) gecoate gerechten zoals eerder beschreven 53. Voor eencellige analyses, werden de neurale kamcellen kort in Ca2+/Mg2+-vrije danilchick medium53 gescheiden. Voor elke voorwaarde, werden tien embryo ‘ s getransplanteerd met fluorescente geëtiketteerd NC geanalyseerd per experiment.

Immunostaining werd uitgevoerd op neurale kamexplantaten zoals eerder beschreven 54 met anti-N-cadherine (1:50, rat IgG, kloon MNCD2, DSHB), anti-E-cadherine (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. Beeldvorming van in vitro neurale crestmigratie werd uitgevoerd met behulp van time-lapse cinematografie zoals eerder beschreven 53,60. Kort, neurale kam cellen werden gekweekt in plastic of glas petrischaaltjes bedekt met fibronectin, en time-lapse microcopie werd gestart na een uur van in vitro cultuur. Voor celmotiliteit en migratie werden samengestelde microscopen (ofwel een Eclipse 80i Nikon microscoop met een Hamamatsu digitale camera of een Dmrxa2 Leica microscoop met een Hamamatsu digitale camera gecontroleerd door eenvoudige PCI-programma) uitgerust met gemotoriseerde stadia en een 10×/0,30 na droge lens gebruikt. NC-culturen werden bereid zoals hierboven beschreven. Beelden werden elke 5 minuten verkregen gedurende een periode van 12 uur. voor celmorfologie beeldvorming, werd een TCS SP8 microscoop gebruikt met een 63 × /0.90 NA water immersion objective lenzen en gecontroleerd door LAS–AF software. Vaste cellen werden afgebeeld met behulp van een 63 × /1.4 na–olie-immersiedoelstelling en een Leica TCS SPE confocale microscoop gecontroleerd door LAS-AF software.

voor construct localisatie of endogene IF niveaus werden 10-15 NCC ‘ s geanalyseerd voor elke conditie per experiment.

celmigratie en celmorfologie analyse

Chemotaxis assay werd uitgevoerd volgens een standaardprocedure61 met heparine acryl parels (Sigma, H5263) gecoat met 1 µg/mL gezuiverde humane stromale cel-afgeleide factor-1 (Sigma, SRP3276). Celmotiliteit en chemotaxis werden geanalyseerd met behulp van ImageJ (https://imagej.nih.gov) analysetools, zoals eerder beschreven 53,60. Kort, elke individuele cel werd handmatig gevolgd met behulp van de handmatige Tracking plugin van ImageJ, de gegevens werden verzameld en geanalyseerd met behulp van de Chemotaxis plugin van ImageJ. De celmorfologie werd beoordeeld door gebruik te maken van de circulariteitsindex (complete circle = 1) en geschat door middel van ImageJ-analysetools. Celdispersie werd geanalyseerd met behulp van Delaunay triangulatie algoritme (ImageJ Plugins) en werd uitgezet als gemiddelde explant driehoek gebied, zoals beschreven voor54. Cel uitstulpende gebied werd geanalyseerd in neurale kam cellen aan de rand van een explantaat het meten van de ontgroeiende gebied dat afkomstig is van twee opeenvolgende termijnen met 4 minuten tijdsinterval; deze twee opeenvolgende frames werden afgetrokken om de nieuwe area12 genereren. Voor analyse van cel chemotaxis en celdispersie 10-15 explantaten werden geanalyseerd per voorwaarde voor elk onafhankelijk experiment. Voor celmotiliteit, celmorfologie en celuitsteeksels werden 15-25 NCC ‘ s geanalyseerd per conditie per experiment.

Moleculaire Biologie, plasmiden en reagentia

voor cDNA-synthese werd totaal RNA geïsoleerd uit 10-15 embryo-stadia 23-24 of 10-15 dierkapjes fase 8 van X. laevis per toestand voor elk onafhankelijk experiment en werden drie technische replica ‘ s gebruikt binnen elk experiment25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) als template. Volledige lengte cx43 (cx43fl, aa 1-379), cx43 carboxy terminaal afgekapt construct (cx43trunc, aa 1-212) en cx43-20k construct (cx43tail, aa 213-379) werden gekloond in 5 ‘Hamhi/3’ Xhoi van pCS2+ of pCS2-EGFP vectoren. De pcs2-EGFP vector werd vriendelijk geleverd door Dr.Masa Tada. De induceerbare constructie van Cx43Tail werd voorbereid door de cx43-20kTail (aa 219-379) te versmelten met het ligandbindend domein van de menselijke GR (aa 512-777). Cx43-20k werd gekloond in 5 ‘Ecori/3’ Aci en GR in 5 ‘Aci / 3’ Xhoi van pCS2+ en PCS2-EGFP. BTF3 constructies werden gesynthetiseerd met behulp van de X. laevis sequentie van cDNA kloon (UniGene ID XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) werd gekloond in 5 ‘Ecori/3’ Xhoi van pCS2+ of PCS2-EGFP. BTF3 schrapping construct ontbreekt het NLS gebied RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) werd gekloond in 5 ‘Hamhi/3’ Clai van pCS2+. Voor de bifc experimenten (Fig. 4b, c), Cx43Tail en Cx43Trunc werden gekloond in 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi van pCS2-VC155. BTF3FL werd gekloond in 5 ‘Bamhi/3’ Bamhi van pCS2-VN9m. BiFC vectoren werden vriendelijk verstrekt door Prof James C. Smith. Alle constructsequenties worden geverifieerd door geautomatiseerde DNA-sequencing (Source Biosciences, UK). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg / embryo, 63).

alle analyses op fluorescente constructies werden beoordeeld door het normaliseren naar de achtergrondfluorescentie en indien nodig naar de totale celoppervlaktefluorescentie.

de volgende reagentia werden gebruikt: flufenamic zuur (50 µM voor de NC explantatie incubatie −100µM voor embryo behandeling, Sigma, F9005), meclofenamic zuur (50 µM voor de NC explantatie incubatie −100µM voor embryo behandeling, Sigma, M4531), actinomycin D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) en ethanol-opgeloste dexamethasone (10 µM) werd toegevoegd aan het kweekmedium in de stadia 14-15 en gehandhaafd tot op neural crest trekkende embryonale stadia (stadium 23). Om de mogelijke lekkage van induceerbare chimera ‘s te controleren, werd een broer of zus batch embryo’ s gekweekt zonder dexamethason en verwerkt voor in situ hybridisatie. Voor koppelingstest (testing gap junction channel activity) werden 10-15 NCC ‘ s geanalyseerd per conditie per experiment.

Immunoprecipitatie, fractionering en western blotting

voor elke aandoening werden per experiment 10-15 embryo ‘ s gebruikt voor de bereiding van embryo-lysaten. Hele embryo ‘ s werden bereid voor western blot na homogenisatie in lysis buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) met toegevoegde proteaseremmers (Roche, 11836153001) en fosfataseremmers (Roche, 04906837001)54,64. Voor western blots werden de volgende antilichamen gebruikt: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); in het kort werden de cellen gesuspendeerd in lysis-buffer en gedurende 5 minuten bij 20.000×g bij 4 °C gecentrifugeerd, het supernatans werd teruggewonnen en het volume werd aangepast met verdunningsbuffer. Parels werden geëquilibreerd in verdunningsbuffer en gemengd met het geresuspendeerde cellysaat. De mix werd magnetisch gezuiverd en voorbereid voor western blot. Nucleaire fractie isolatie van X. laevis embryo ‘ s werd uitgevoerd met behulp van differentiële centrifugatie protocollen met modifications64,65. Kort, Stadium 18 X. laevis embryo lysaten met behulp van een 22 G naald en 20 µL homogenisatiebuffer (HB: 250 mM sucrose, 20 mM Hepes, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, fosfatase en proteaseremmers) per embryo. Alle monsters werden gedurende 5 minuten bij 250×g gecentrifugeerd om embryo-puin te verwijderen. Na het verzamelen van het supernatant, werd het verdeeld over drie verschillende buizen en gesponnen met drie verschillende snelheden (400×g, 600×g) gedurende 5 minuten om de celkernen te isoleren. De postnucleaire supernatants werden bewaard voor verdere verwerking. De nucleaire pellets werden opnieuw gewassen in buffer HG en gecentrifugeerd met de juiste snelheid (400×g, 600×g). Nucleaire pellets werden vervolgens geresuspendeerd in 40 µL 10% glycerol / 0,1% SDS / 1% Triton-X in HB. De juiste hoeveelheid monsterbuffer werd aan elk monster toegevoegd en de monsters werden verwerkt voor acrylamidegelelektroforese en western blot analyse. Om ladingsfouten te voorkomen, werd hetzelfde membraan na het strippen tegen de beladingscontrole uitgewist zoals voor 54,64 beschreven.

Western blot-gegevens werden geanalyseerd met behulp van ImageJ-analysetools. Beeldintensiteiten werden genormaliseerd en de verhouding van het eiwit van belang tot de belastingcontrole (d.w.z., Mapk of α-tubuline) werd berekend, werden de gemiddelde verhoudingen uitgezet. Niet-gekropte vlekken zijn opgenomen als aanvullende cijfers (aanvullende vijgen. 5–7).

celculturen

HeLa-cellen (collecties van micro-organismen en celcultuur van het Leibniz Instituut, Dsmz, Duitsland) werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (Life Technologies, CA, USA) bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 10% CO2 en getransfecteerd zoals aangegeven met Rotifect (Carl Roth, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant.

Xenopus embryonale fibroblasten (XTC, een geschenk van Ana Losada) werden gekweekt in 67% DMEM/H2O aangevuld met 10% foetaal kalfsserum bij 25 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en getransfecteerd zoals aangegeven met Viafect (Promega, USA). Plasmiden voor transfectie waren zoals aangegeven en 10-20 Hela of XTC cellen werden geanalyseerd voor elke voorwaarde per experiment.

voor siRNA-experimenten werd een combinatie van drie siRNA ‘ s gericht tegen BTF3 getransfecteerd zoals hierboven beschreven. Een standaard siRNA (scrambled siRNA van Sigma) werd gebruikt als controle. Catalogusnummer voor deze commerciële siRNA tegen BTF3 zijn: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. De cellen werden verzameld 48 h na transfectie en verwerkt voor qPCR, Westelijke vlek, of Immunohistochemestry experimenten. Zoals beschreven in de respectieve secties.

alle cellijnen werden getest op besmetting met mycoplasma.

Immunohistochemestry en phalloidin kleuring

voor eiwitdetectie werden zoogdiercellen of neurale kamexplantaten gedurende 10 minuten gefixeerd in 4% formaldehyde in 0,2% PBS-T (PBS + 0,2% Triton X-100) en gedurende 1 uur Geblokkeerd met 10% NGS. Primaire antilichamen werden geïncubeerd bij 4 °C bij 10% NGS. De volgende antilichamen werden gebruikt: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml anti-n-cadherine (Mncd2 Ontwikkelingsstudies Hybridoma Bank) en 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) bij 10% NGS en geïncubeerd bij 4 °C. explantaten werden 3 keer gewassen met PBS + 0,2% Tween-20 en geïncubeerd bij 4 °C met secundair antilichaam, verdund bij 1:350 bij 10% NGS. DAPI werd verdund op 1: 1000 en gemengd met de secundaire antilichamen.

massaspectrometrie

voor co-immunoprecipitatie van de VLAGGED cx43tail voor massaspectrometrische analyse werden cellen lyseerd en lysaten werden ‘ s nachts geïncubeerd met anti-HA en geëquilibreerde high affinity parels bij 4 °C, werden de immunoprecipitaten gewassen en geëluteerd 27. Vervolgens werd bij zure elutie met 0,1 m glycine pH 2,5, de pH van de eluaten aangepast aan pH 8,0 met 0,5 m Tris. Voor eiwitdigestie werden Monsters ‘ s nachts geïncubeerd met 2 µg trypsine (trypsine Gold, Promega, USA) gevolgd door toevoeging van 0.1 µg Lys-C (Roche, Duitsland) en incubatie voor extra 6 h. de peptiden werden ontzouten op C-18 reversed phase stage tips (Nest Group, USA), gedroogd in vacuüm en bewaard bij -20 °C tot analyse. Gedroogde peptidenmengsels werden teruggewonnen in 3 µl 30% mierenzuur en verdund met water tot 23 µl. Vijf µl van de digest werden geïnjecteerd op een Nano-LC-systeem (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, USA) en peptiden werden gescheiden door reversed phase chromatografie op C-18-kolommen die in eigen huis werden bereid (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 µm, Dr.Maisch, Duitsland, Picofrit-kolommen, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) in een lineaire gradiënt van 100% eluent A (0,1% mierenzuur) tot 55% eluent B (60% actenitril, 0,1% mierenzuur) in 120 min. Het LC-systeem werd opgezet als geventileerde kolom en het monster werd geladen en ontzouten met een debiet van 400 nl / min en de scheiding werd uitgevoerd met een debiet van 200 nl/min. Het nano-LC-systeem werd gekoppeld aan de massaspectrometer (Q-Exactive HF, Thermoswetenschappelijk, Duitsland) die in data-afhankelijke modus werd gebruikt. Data interpretatie werd uitgevoerd met Mascot V2. 2 (Matrixscience, UK) en Progenesis LC–MS V4.1 (Nonlinear Dynamics, UK). De gegevensinterpretatie werd uitgevoerd met MaxQuant V1. 6. 1.0 en Perseus V1.6.1.3 (MPI van Biochemie, Duitsland).

Coupling assay

Gap junction intracellulaire communicatie werd getest met behulp van een kleurstofkoppeling assay. Hier werd de fluorescerende kleurstof Calcein-AM (Sigma, 17783) gebruikt. Een neurale kam bevolking ontleed uit niet uitgeworpen embryo ‘ s werd geïncubeerd met de kleurstof Calcein-AM voor ongeveer 10 min of totdat de kleurstof werd geladen in alle cellen. Een andere neurale crest populatie van embryo ‘ s geïnjecteerd met een nucleaire marker (nRFP mRNA injecties, zie hierboven) werd afzonderlijk ontleed. Nadat de twee populaties werden gescheiden in afwezigheid van calcium en magnesium, werden ze gemengd en geïncubeerd gedurende 1 uur bij 14 °C in een reageerbuis. Na milde centrifuge, de neurale kam explantaten werden gesneden in gelijke grootte stukken en gekweekt zoals hierboven beschreven en vervolgens gefilmd. Om de kanaalactiviteit van gap junctions te testen, gap junction blockers; meclofenamic zuur (Sigma, M4531) en flufenamic zuur (Sigma, F9005) werden gebruikt. Celcommunicatie werd beoordeeld door de verhouding te schatten van het aantal cellen dat zowel tracers, de nucleaire marker en Calceïne toont tot het totale aantal cellen dat de nucleaire marker heeft.

statistische analyse

de schatting van de steekproefomvang werd gedaan door eerder gepubliceerde werkzaamheden te volgen en er werd geen specifieke statistische methode gebruikt. Experimenten werden niet gerandomiseerd en als gevolg van de aard van de experimenten, de auteurs waren niet verblind voor toewijzing tijdens zowel experimenten en resultaten analyse. Alleen levensvatbare embryo ‘ s en explantaten werden geanalyseerd. Mis-geïnjecteerde embryo ‘ s werden niet opgenomen voor in situ hybridisatie experimenten. De juiste injectie werd bepaald door injectie van lineaire verklikstoffen. Onze experimentele parameters werden willekeurig gemeten zodra ze levensvatbaar waren en goed geïnjecteerde embryo ‘ s werden geselecteerd.

vergelijking van percentages werd uitgevoerd met behulp van contingency tables66. Normaliteit van datasets werd getest met behulp van Kolmogorov-Smirnov ‘s test, d’ Agostino en Pearson ‘s test en Shapiro-Wilk’ s test met behulp van Prism6 (GraphPad). Datasets na normale distributie werden vergeleken met de T – test van de Student (two-tailed, ongelijke varianties) of ANOVA met de meervoudige vergelijkingen van Dunnett na de test met behulp van Excel of Prism6 (GraphPad). Datasets die geen normale distributie volgden werden vergeleken met behulp van Mann Whitney ‘s test of een niet-parametrische ANOVA (Kruskal Wallis met Dunn’ s multiple comparison post-test) met behulp van Excel of Prism6. Kruisvergelijkingen werden alleen uitgevoerd als de totale p-waarde van de ANOVA lager was dan 0,05. In alle figuur legends N = aantal onafhankelijke experimenten; n = totale steekproefgrootte.

X. laevis n-cadherin partial promotor identification

om de basispromotor van Xenopus n-cad te identificeren hebben we de volgende strategie gebruikt. Het basale promotorgebied van kippen – en zoogdiern-cadheringenen is beschreven in de 5 ‘- UTR-regio ‘ s,binnen de positie -3000 tot -1 bp met betrekking tot de vertaalinitiatiesite41, 67. Door gebruik te maken van de X. laevis Genome Project resource (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) hebben we een gebied van 2800 bp geïdentificeerd in de 5’-UTR van het X. laevis n-cadherin gen (aanvullende Fig. 4). Omdat onze gegevens aangeven dat Cx43Tail, BTF-3 en Pol II een complex vormen, gebruiken we ElemeNT tool68 om te zoeken naar potentieel actieve Tata-dozen in de regio die we geïsoleerd hebben. Onze in silico analyse onthullen een Tata box rijke regio tussen de posities -166 tot -618 bp, ten opzichte van de vertaling start site (aanvullende Fig. 4). Tenslotte ontwerpen we overlappende primers om fragmenten van 200 bp in dit gebied te versterken. Primers sequenties worden vermeld in de Spaander sectie en hun bindende gebieden worden gemarkeerd in aanvullende Fig. 4.

chromatine immunoprecipitatie (ChIP)

voor chromatine immunoprecipitatie (ChiP) hebben we een standaardprocedure gevolgd voor X. laevis embryos69, 70. Voor elk onafhankelijk experiment gebruikten we twee technische replica ‘s en 250-300 Xenopus embryo’ s per aandoening. Kort, neurula stadia X. laevis embryo ‘ s werden bevestigd voor 15 min en 3 µg van Pol II antilichaam (Diagenode, C15100055) of GFP ChIP rang antilichaam (Abcam, ab290) werden gebruikt. Voor DNA-extractie volgden we een standaardprotocol 69,70. Met behulp van de element analyse resource, zochten we naar vermeende Tata dozen in de X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGAGACAACG-3 ‘

en hun relatieve bindingsplaatsen zijn weergegeven in aanvullende Fig. 4b. de Spaanderexperimenten werden gekwantificeerd als volgt: genormaliseerde Verhouding van bandintensiteit voor elke voorwaarde werd het gemiddeld en de vouwverhoging respect de IgG controle werd berekend en uitgezet als vouwverrijking. Band intensiteit werd geregistreerd met behulp van ImageJ Gels analyse plugin. Niet-gekropte gels worden weergegeven in aanvullende Fig. 7c, d.