Genoombrede analyse van condensinbinding in Caenorhabditis elegans

Condensinen I en II delen de twee SMC-subeenheden MIX-1 en SMC-4, en worden onderscheiden door drie niet-SMC-subeenheden (figuur 1A). Condensin IDC verschilt van condensin I door slechts één subeenheid, de SMC-4 variant DPY-27. Wij gebruikten één of twee verschillende antilichamen tegen elke condensin-subeenheid voor Spaander-seq en identificeerden die bindende plaatsen gemeenschappelijk in veelvoudige antilichamen en biologische replicaten (aanvullend dossier 1: Lijst S1). Antilichaamvalidatie en verwachte Co-immunoprecipitatieinteracties van het condensin holocomplex worden weergegeven in aanvullend bestand 2. Paarsgewijze correlatie van mediane ChIP-verrijking scores geclusterde condensin I-IDC en II subeenheden afzonderlijk, bevestiging van de verdeling van individuele subeenheden tussen de drie condensin types (figuur 1B).

bindingspatronen met hoge resolutie van de drie condensinecomplexen zijn vergelijkbaar

C. elegans condensin I en II hebben gedeeltelijk overlappende maar verschillende chromosomale lokalisaties in mitose en meiosis, en condensin IDC is specifiek gericht op X . Daarom verwachtten wij om verschillende Spaander-seq patronen voor condensin I, IDC en II te vinden. in plaats daarvan, waren de bindende patronen van condensin I, IDC en II subeenheden over het algemeen gelijkaardig (figuur 1C). Deze gelijkenis was niet te wijten aan kruisreactiviteit van antilichamen, omdat het HCP-6-antilichaam, dat geen kruisreactiviteit vertoont en geen subeenheid van condensine I-IDC immunoprecipiteert , uitgebreide Co-lokalisatie vertoonde met subeenheden van condensine I-IDC (zie HCP-6 in Figuur 1C). Bovendien, als de overlap van condensin II te wijten was aan kruisreactiviteit met condensin IDC, zouden we een verrijking van condensin II bindingsplaatsen op de X hebben verwacht, wat niet het geval was (figuur 1D). Vergeleken met condensin II, hadden de subeenheden van condensin IDC consequent hogere Spaanderscores op X, die een verschil in chromosomale Vereniging van de twee condensincomplexen voorstellen zoals gevangen door Spaander (nota verschillende schalen op X en chromosoom I in Figuur 1C). Aangezien wij Spaander-seq in gemengde stadiumembryo’s uitvoerden, waren de meeste cellen (meer dan 95% geschat door 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bevlekken) in interfase. Het gebrek aan condensin I subeenheden op autosomes (figuur 1C en aanvullend dossier 3: Figuur S1A) en de vorige observatie die condensin I lokaliseert aan mitotic chromosomen na kernenvelopanalyse suggereren dat het grootste deel van het Spaander-seq signaal van interphase is. Ter ondersteuning van dit, werd condensin II getoond om nucleair te zijn tijdens interphase, en toonde een meer gelijke verdeling van bandplaatsen over alle chromosomen (figuur 1D).

KLE-2, HCP-6 en CAPG-2 zijn condensin II-specifiek en vertegenwoordigen dus condensin II-binding. Condensin I en IDC delen alle drie niet-SMC subeenheden, dus hierna verwijzen wij naar het Spaander-seq signaal van DPY-26, DPY-28 en CAPG-1 vanaf condensin I-IDC. Om ons te concentreren op de locaties die als complex gebonden zijn, hebben we het Chipsignaal van de condensin-type specifieke CAP-subeenheden gemiddeld. Naast het gebruik van gemiddelde gegevens, hebben we geverifieerd dat elke analyse waar was met enkele subeenheden, en we presenteren HCP-6 en DPY-28 in aanvullende cijfers. Wij identificeerden een reeks van hoge vertrouwenscondensin I-IDC en II bindende plaatsen door slechts die spaander-seq pieken te selecteren die over twee of meer niet-SMC subeenheden consistent waren (figuur 1D). Zoals eerder opgemerkt, kwam 97% van condensin I-IDC band op het chromosoom van X voor . Condensin II werd eveneens verdeeld tussen autosomes en X. Condensin II gebonden aan sterkere condensin I-IDC plaatsen op het chromosoom van X (figuur 1E en aanvullend dossier 3: figuur S1B).

Condensinbindingsplaatsen worden verrijkt bij actieve promotors

om de gebieden te identificeren waar condensinen bij voorkeur binden, hebben we condensinbindingsplaatsen geanalyseerd met betrekking tot verschillende genomische annotaties. De bindingsplaatsen van Condensin werden beduidend verrijkt bij promotors, dichtbij tRNA genen, en niet-coderende RNAs (figuur 2A, aanvullend dossier 4: Figuur S2). Om de mogelijkheid te elimineren dat condensin-gebonden tRNA-genen alleen voorkomen bij promotors, verwijderden we tRNA-genen die binnen 1 kb van een transcriptie start site (TSS) waren en bepaalden we dat de overlapping van tRNA-en condensinbindingsplaatsen significant bleef (23% en 6% van tRNA ‘ s overlapten met condensin I-IDC-en II-locaties, respectievelijk, P = 0,0002). De condensinbinding bij tRNA genen suggereert dat tfiiic-gemedieerde condensin rekrutering tussen C. elegans en gist kan worden behouden .

de Condensinplaatsen worden verrijkt bij promotors en tRNAs, en het binden correleert positief met transcriptie. (A) verrijking of uitputting van condensinbindingsplaatsen bij diverse genomische annotaties worden gegeven. Willekeurige verrijking en p-waarden werden berekend door een permutatietest waarbij de condensinpieken 10.000 keer willekeurig werden verdeeld. Voor zowel condensin I-IDC als II is er een significante verrijking van bindingsplaatsen bij 1 kb promotors en in de buurt van niet-coderende RNAs (P = 0.0002), depletie binnen genlichamen (transcriptie startplaats (TSS) naar transcriptie eindplaats (tes)) (P = 0,0002), en geen significante verrijking of depletie bij de 3′ van genen (p > 0,05). (B) Het Condensinchipsignaal wordt uitgelijnd op de tsss van de tot expressie gebrachte genen (bovenste 25% op RNA-niveau, vaste lijnen) en niet tot expressie gebrachte genen (onderste 25% op RNA-niveau, gestippelde lijnen). De omringende stippen vertegenwoordigen het 95% betrouwbaarheidsniveau. Als controle wordt het signaal van de immunoglobuline G (IgG) ChIP bij de TSSs in grijs uitgezet. (C) de Spearman-rang correlatiecoëfficiënt tussen de mediane Chipscore bij 500 BP-promotors en het RNA-niveau bij de respectieve genen wordt voor het gehele genoom en het X-chromosoom gegeven. Er is een lichte positieve correlatie tussen condensinbinding en transcriptie. (D) de mediane Chipscore binnen 500 bp stroomopwaarts van de TSS wordt uitgezet tegen het RNA-niveau van elk gen. Condensin promotorgebonden genen (gedefinieerd door overlapping met een condensin-site binnen 1 kb van de TSS) worden gemarkeerd in oranje (condensin I-IDC) en blauw (condensin II). (E) GC-inhoud van 50 BP-vensters is uitgezet over condensin I-IDC en II bindende toppen. Als een controle, de GC inhoud meer dan 1500 willekeurige coördinaten werd bepaald en uitgezet op dezelfde manier als de werkelijke condensin toppen. Het gemiddelde GC-gehalte is hoog rond de piek van condensinbinding.

de Binding was het hoogst binnen 500 bp van de TSS (aanvullend dossier 5: Figuur S3A) en 45% van condensin I-IDC en 62% van condensin II pieken werden gelokaliseerd bij promotors. De condensinbinding bij promotors correleerde positief met de transcriptionele activiteit van het downstreamgen (figuur 2B,C), maar niet alle actieve promotors werden gebonden (figuur 2D). Genontologie term analyse van gebonden promotors toonde een lichte (1,3-voudige) maar significante (p = 3,5 e-17) verrijking voor genen met embryo-ontwikkelingsfunctie (aanvullend dossier 6: tabel S2). Ongeveer 20% van de sterk tot expressie gebrachte genen (bovenste kwartiel door RNA-niveau) had een condensin II-bindingsplaats binnen 1 kb, en ongeveer 70% van de x-chromosoomgenen had een condensin I-IDC-bindingsplaats binnen 1 kb. Daarom, hoewel transcriptionele activiteit belangrijk is, is het niet voldoende om de specificiteit van condensinbinding bij bepaalde promotors te verklaren.

we merkten dat alle condensinbindingsplaatsen een opvallende verrijking van GC-inhoud vertoonden in vergelijking met omringende regio ‘ s en willekeurige coördinaten (figuur 2E). In C. elegans, is de inhoud van GC van chromosoompromotors van X hoger dan dat van autosomalpromotors . Het is mogelijk dat de hogere inhoud van GC een de opeenvolgingseigenschap van DNA voor condensinband is, en de promotors van X geëvolueerd om hogere inhoud van GC te bevatten om condensin IDC band te steunen.

bindingsplaatsen van Condensine vallen significant samen met een subset van transcriptiefactoren

om aanvullende factoren te bepalen die condensinegebonden promotors onderscheiden, hebben we condensine-en TF-bindingsplaatsen vergeleken en een subset van TFs gevonden die aan dezelfde promotors als condensinen gebonden was (figuur 3A). Eerdere studies toonden aan dat veelvoudige TFs aan een reeks van plaatsen van de hoge bezettingsbinding (heet) binden . Er was een overlapping van respectievelijk 5% en 22% van condensin I-IDC-en condensin II-sites met hete locaties (P = 0,0002). De Betekenis van overlapping met TFs bleef hetzelfde wanneer HOT sites werden geëlimineerd uit de analyse (aanvullend bestand 5: Figuur S3B). Percentages van overlapping voor elke TF afhankelijk van het aantal bindingsplaatsen, en worden getoond in aanvullend dossier 5: Figuur S3C. onder individuele TFs, vonden wij dat 69% van condensin II plaatsen en 53% van LIN-13 plaatsen overlapten met elkaar, makend LIN-13 de hoogste TF die beduidend met condensin II overlapten.

Condensin II binding overlapt met transcriptiefactoren niet-willekeurig, en expressie analyse suggereert een repressieve functie voor condensin II. (A) Transcriptiefactorplaatsen uit modENCODE worden gerangschikt door de vouwverrijking van overlapping met condensin binding sites. Vouwverrijking wordt bepaald als de verhouding van percentageoverlapping in waargenomen versus gemiddelde van willekeurige distributies van condensinplaatsen 10.000 keer over het genoom. De resultaten wijzen erop dat condensinbinding niet willekeurig is met betrekking tot TF-bindingsplaatsen. (B) Venn-diagrammen tonen de overlap van condensin II-bindingsplaatsen met LIN-13 (modencode_3342, embryo ‘s) en LIN-35 (modENCODE_3925, late embryo’ s) (boven), met alleen LIN-13 (linksonder) en met alleen LIN-35 (rechtsonder). Het aandeel van overlapping tussen condensin II en LIN-13 en LIN-35 is hoger bij plaatsen die door beide proteã nen worden bezet. De gegeven overlapping geeft het aantal condensin II-pieken weer die overlappen met de respectieve Lin-13-en LIN-35-locaties. (C) De gemiddelde Spaander-seq verrijking van condensin II, LIN-13 en LIN-35 wordt uitgezet over de top van elke condensin II piek. Condensin II bindingsplaatsen zijn verdeeld in vier groepen. De bovenste groep bestaat uit condensin II bindingsplaatsen die overlappen met LIN-13 en LIN-35, de tweede overlapt met LIN-13 alleen, de derde met LIN-35 alleen en de laatste groep overlapt niet met LIN-13 of LIN-35. De pieken zijn in afnemende volgorde op basis van hun ChIP verrijking. Een groot aantal condensin II plaatsen tonen hoge LIN-13, maar niet LIN-35, bindend. De Condensin II-band is sterker op plaatsen die door zowel LIN-13 als LIN-35 worden gebonden. (D) differentiële expressieanalyse (RNA-seq) in kle-2 null heterozygote versus homozygote larvale stadium 2/3 (L2/L3) larven. De verhoudingen van genen gebonden of ongebonden door KLE-2 met verhoging of daling van transcript niveau in homozygote mutant worden getoond. Transcript niveaus van proportioneel meer genen toename in kle-2 mutant. TF, transcriptiefactor.

Lin-13 heeft een retinoblastoma proteïne (pRb) interactiemotief en functioneert in vulvalontwikkeling met de enkele PRB homolog LIN-35 in C. elegans . In D. melanogaster wordt de binding van subeenheid dcapd3 van condensin II aan chromatine verminderd bij PRB-mutatie . Als LIN-13 In C. elegans condensin II via LIN-35 rekruteert, dan moeten die Lin-13 sites die ook gebonden zijn door LIN-35 (576) meer overlappen met condensin II dan die Lin-13 sites die niet gebonden zijn door LIN-35 (1.033). De overlap van LIN-13-en LIN-35-co-bezette locaties met condensin II-locaties was slechts iets hoger dan die van LIN-13-locaties zonder LIN-35, respectievelijk 60% en 50% (figuur 3B). Omgekeerd was de overlapping van LIN-35 met condensin II groter op die locaties die ook door LIN-13 gebonden waren (45%) dan op ongebonden locaties (9%). Dit suggereert dat de potentiële interactie tussen LIN-13 en condensin II meestal LIN-35 onafhankelijk is. LIN-35 functies binnen een geconserveerd multi-eiwit complex genaamd DRM in C. elegans (hDREAM in mensen) dat ook EFL-1 en DPL-1 bevat . De 555 DRM-bindingsplaatsen die gebonden waren door LIN-13 vertoonden een grotere overlap met condensin II (63%) in vergelijking met 787 DRM-locaties die niet gebonden waren door LIN-13 (13%). We verdeelden de condensin II-sites in vier groepen volgens de overlapping van de bindingsplaats met LIN-13 en LIN-35 (figuur 3C). Deze groepering gaf aan dat een groot aantal condensin II-sites een hoge LIN-13-binding vertonen, maar niet LIN-35, wat suggereert dat als pRb-gemedieerde condensin II-rekrutering wordt behouden in C. elegans, LIN-35 kan afhangen van de aanwezigheid van LIN-13 voor condensin II-rekrutering.

Condensin II-mutatie veroorzaakt transcriptionele defecten die wijzen op een repressieve functie

in gist en D. melanogaster, condensin is betrokken bij transcriptionele onderdrukking . Één recente studie in D. melanogaster wees erop dat de subeenheid condensin II CAPD3 voor transcriptional activering van een cluster van antimicrobial peptide genen wordt vereist . Om de rol van condensin II in de transcriptieregulatie te begrijpen, voerden wij RNA-seq in kle-2 null mutant L2/L3 larven uit. Maternally geladen KLE-2 staat Kle-2 null mutant (ok1151 allel) toe om tot steriele volwassenen op te groeien. We vergeleken genexpressie in heterozygote en homozygote kle-2 mutanten in L2 / L3 larven voordat de kiemlijn zich verspreidde, en dus bijna volledig interfasekkernen bevatten. Differentiële expressieanalyse met behulp van DESeq2 identificeerde 356 genen waarvan de expressie significant verschillend was in homozygote in vergelijking met heterozygote larven (fout-discovery rate < 5%; deseq2 resultaten worden weergegeven in aanvullend bestand 7: tabel S3). De meerderheid van differentieel tot expressie gebrachte genen nam eerder toe (70%) dan af (30%) in expressie. De termanalyse van de ontologie van het gen onthulde geen bepaalde groep genen die door de kle-2-mutatie werden beà nvloed. Gelijkaardig aan gepubliceerde gegevens voor condensin IDC, was er geen directe correlatie tussen Kle-2 band en veranderingen in genuitdrukking. Belangrijk, onder de 46 differentieel tot expressie gebrachte en KLE-2-gebonden genen, nam 83% in expressie toe in vergelijking met 67% van 310 genen die niet KLE-2 gebonden waren (figuur 3D), wat suggereert dat het directe effect van condensin II-binding grotendeels repressief is.

Histonmodificaties geassocieerd met open chromatine correleren positief met condensinbinding

om de chromatinecontext van condensinbinding te begrijpen, analyseerden we de relatie tussen condensinbindingsplaatsen en chromatineeigenschappen in kaart gebracht door modENCODE . We hebben een algemene positieve correlatie waargenomen tussen condensinbinding en merken van actief chromatine. In gist correleert het aantal bindingsplaatsen van condensin door de celcyclus direct met chromosoomlengte. Het nummer van C. de bindingsplaatsen van elegans condensin II waren niet evenredig met de chromosoomlengte (figuur 4A), maar waren positief gecorreleerd met de lengte van chromosomen geassocieerd met actieve histonmarkeringen (figuur 4B). Het chromosoom van X was een uitzondering, misschien toe te schrijven aan de mechanismen van de dosiscompensatie die zijn chromatin veranderen . Condensin I-IDC en II band over het genoom correleerde positief met open chromatin merken zoals H3K27ac en negatief met heterochromatin merken zoals H3K27me3 en H3K9me3 (figuur 4C en aanvullend dossier 8: figuur S4). Deze correlatie was op het domein-brede niveau (zoals geanalyseerd in 1 kb windows), omdat we geen specifieke Histon modificatie die piekte op condensin sites in een ‘metagene’ type analyse (gegevens niet weergegeven). In immunofluorescentiestudies overlapten de centromeer-eiwitten met de binding van condensine II in mitotische cellen . Wij hebben geen positieve correlatie tussen Cenp-A en condensin II Spaander-seq signalen in gemengde stadiumembryo ‘ s waargenomen, die voorstellen dat, in interfasekkernen (de meeste kernen in gemengde stadiumembryo cellen), er geen overlapping is. Alternatief, aangezien CENP-A aan slechts een kleine deelverzameling van de positieve gebieden van CENP-A in het genoom per cel bindt, zou de overlapping van cenp-A met condensin II slechts in enige cellen duidelijk kunnen zijn. Om te begrijpen welke chromatinefactoren het beste condensinbinding voorspellen, gebruikten we een machine-learning benadering. In C. elegans, wordt h4k20me1 hoogst verrijkt over het chromosoom van X door DCC, en zo was H4K20me1 de meest discriminerende factor voor condensin IDC-band (figuur 4D). Voor condensin II, zijn de hoogst voorspellende chromatin eigenschappen H3K27ac en CBP, beide markers van actieve versterkers, die suggereren dat de condensinbinding bij actieve versterkers wordt verrijkt . Van de 201 condensin II-bindingsplaatsen Die 2 kb verwijderd waren van een geannoteerde TSS, overlapten er 58 met een CBP-bindingsplaats (P = 0,0002).

chromatine factoren geassocieerd met open chromatine en versterkers positief correleren met condensine binding. (A) het aantal condensin II-pieken wordt uitgezet ten opzichte van de lineaire lengte van elk chromosoom. (B) het aantal condensin II-pieken wordt uitgezet tegen de lengte van het chromosoom dat door h4k8ac-en H4K16Ac-pieken wordt gedekt. Een trendlijn op autosomale gegevens wijst op een positieve correlatie (R2 = 0,9). (C) Condensin die binnen 1 kb aaneengesloten vensters over het chromosoom van X (Links) en autosomen (rechts) positief correleren met actieve tekens (bijvoorbeeld, H3K27ac, H2A.Z) en negatief correleren met repressieve tekens (bijvoorbeeld, H3K27me3, H3K9me3). (D) een ensemble classifier (random forests) werd geleerd om condensin binding over het genoom te voorspellen. De top 20 features (van 92 totaal features, extra bestand 1: tabel S1) met het hoogste voorspellende vermogen zijn uitgezet voor condensin I-IDC (links) en condensin II (rechts) met de belangrijkste feature bovenaan. De kenmerken worden gerangschikt op basis van de gemiddelde afname in nauwkeurigheid, die het verschil beschrijft tussen het foutenpercentage van de werkelijke classificatie en het foutenpercentage na permuting van de eigenschap, gemiddeld over alle classifiers (bomen).

DNA-sequentiemotieven verrijkt op condensinbindingsplaatsen vertonen specifieke kenmerken

hoewel condensin II gebonden is aan de condensin I-IDC-locaties op de X, kon condensin I-IDC niet binden aan de meeste autosomale condensin II-bindingsplaatsen (figuur 1D). Om de specificiteit van condensin IDC en II rekrutering te begrijpen, zochten we naar DNA sequentiekenmerken die condensin II en condensin IDC binding onderscheiden. De vorige studies hebben aangetoond dat condensin IDC eerst aan ongeveer 100 plaatsen wordt aangeworven, en dan naar andere chromosomale plaatsen uitspreidt . Een 10 bp DNA sequentie motief werd verrijkt op de condensin IDC recruitment sites (figuur 5A) en mutatie van het motief afgeschaft condensin IDC recruitment op extrachromosomale arrays , wat aangeeft dat de condensin IDC DNA sequentie motief een belangrijke rol speelt in condensin IDC recruitment.

we vonden een GCGC-bevattend DNA-sequentiemotief dat werd verrijkt onder condensin II-bindingsplaatsen (figuur 5A). Het is interessant om op te merken dat zowel het condensin II als het condensin IDC-motief de gcgc-kern bevatten, maar het condensin IDC-motief werd aan één kant uitgebreid door AGGG, wat suggereert dat X-specificiteit van condensin IDC-rekrutering wordt bereikt door cofactoren die AGGG herkennen. Zo, gelijkend op andere TFS (bijvoorbeeld), werden slechts een deel van de potentiële De opeenvolgingsmotieven van DNA gebonden door condensin II. andere factoren zoals chromatin toegankelijkheid en onbekende co-factoren kunnen bij bindende specificiteit worden betrokken. Inderdaad, als we die motieven Namen die in een venster van 2 kb aanzienlijk verrijkt waren voor een actief Histon teken, zoals H4K16ac, steeg het percentage van de motieven die gebonden waren van 11% naar 29%. Bovendien, gelijkaardig aan condensin IDC-motief, dat meer geclusterd is op de gebonden plaatsen , vonden wij dat 1 kb genomic vensters die meer dan één condensin II-motief bevatten ongeveer 2,5-voudig waarschijnlijker waren om door condensin II te worden gebonden, in vergelijking met die met slechts één motief. Daarom helpen motif clustering en open chromatin context bij het specificeren van de selectie van de motieven die gebonden zijn.

chromosomale rekrutering van condensin IDC en condensin II impliceert zowel gedeelde als afzonderlijke regelgevers. (A) Motieflogo ‘ s van 10 BP DNA-sequentiemotieven die op de hoogste condensinplaatsen zijn verrijkt, worden getoond. (B) overlapping tussen bindingsplaatsen van condensin I-IDC, condensin II en SCC-2 wordt getoond. Getallen onder elke factor geven het totale aantal bindingsplaatsen aan. Overlappende getallen zijn gebaseerd op het aantal SCC-2 pieken. (C) University of California Santa Cruz (UCSC) browserweergave die SCC-2 Spaander-seq signaal voorbeeldt, dat meestal beperkt is tot promotors. D) SCC-2 en condensin II binden op een welomschreven condensin IDC wervingslocatie op de X (rex-1). (E) in SDC-2 null mutant (TY1072), condensin I-IDC (DPY-26), condensin II (HCP-6, KLE-2) en SCC-2 binding is verminderd bij rex-2 (linker paneel), maar blijft grotendeels gelijk op autosomen (rechter paneel). F) Kaderdiagram van de verhouding van de Spaanverrijking in SDC-2-mutant versus wildtype binnen de bindingspieken van SCC-2. De verbindingsplaatsen worden geclassificeerd zoals zijnd op autosomes, op X met lage SDC-2 band en hoge SDC-2 band. G) qPCR-analyse van DPY-27-ChIP-verrijking in embryo ‘ s geïsoleerd van volwassenen die vector (controle) en PQN-85 RNAi kregen. De spaanverrijking wordt uitgedrukt in verhouding tot de negatieve controleplaats. Foutbalken zijn de standaardafwijkingen van drie tot vijf biologische replicaten. ChIP, chromatin immunoprecipitation; DCC, dosering compensatie complex.

niet alle condensin II bindingsplaatsen hebben het motief. Op die condensin II plaatsen zonder het motief, kunnen andere factoren verantwoordelijk zijn voor de binding. Het lage percentage condensin II-locaties (27%) met een motief kan ook worden verklaard door de mogelijke verspreiding van condensin II na rekrutering. Locaties van verspreiding worden niet verwacht om het motief te bevatten. Voor condensin IDC bijvoorbeeld bevat een hoog percentage potentiële wervingslocaties (56%) het motief, maar geen verspreidingsplaatsen (8%) . Er is een systematische analyse nodig van de wervingscapaciteit van de aangewezen condensin II-locaties om eventuele verspreiding aan te pakken.

SDC-2 is vereist voor de binding van condensin I-IDC, condensin II en de cohesin-lader aan X-chromosomale DCC-rekruteringsplaatsen

in metazoanen worden eiwitten die betrokken zijn bij de recruitment van condensin tot chromosomen niet goed begrepen. In gist overlapt de condensinbinding met die van cohesin-loading complexe Scc2 / 4, die condensinassociatie met chromosomen verhoogt . Om te testen of de overlapping met Scc2 / 4 wordt bewaard tussen gist en C. elegans, voerden wij Spaander-seq analyse van SCC-2 (ook als PQN-85 wordt bekend) uit en vonden dat opmerkelijke 95% van SCC-2 plaatsen met condensin I-IDC op X overlapt, en 60% met condensin II genoom-breed (figuur 5B). De overlapping bleef gelijk wanneer hete gebieden werden uitgesloten (aanvullend dossier 9: figuur S5A). Niet alle condensinplaatsen overlappen met SCC-2, wat suggereert dat, in tegenstelling tot gist, condensin niet afhankelijk is van SCC-2 voor binding . SCC-2 binding was hoger bij promotors, en positief gecorreleerd met transcriptie (aanvullend bestand 9: figuur S5B). Een GAGA-bevattende DNA-sequentiemotief was aanwezig in 58% van SCC-2 bindingsplaatsen (aanvullend dossier 9: figuur S5C). In tegenstelling tot Drosophila Nipped-B , en vergelijkbaar met S. cerevisiae Scc2 , was de SCC-2 binding niet hoog binnen getranscribeerde regio ‘ s, maar bleef Intergeen (figuur 5C).

bijna volledige overlapping (96%) van condensine II-bindingsplaatsen met condensine I-IDC op het X-chromosoom ondersteunt het bestaan van gemeenschappelijke mechanismen voor chromosomale binding van verschillende condensinen. Aangezien condensin II en SCC-2 gebonden aan condensin IDC recruitment sites op de X (figuur 5D en aanvullend bestand 9: Figuur S5D), veronderstelden we dat condensin IDC recruiters ook condensin II en SCC-2 werven. Hermafrodiet-specifieke rekrutering van condensin IDC aan het chromosoom van X wordt bereikt door SDC-2, SDC-3 en DPY-30 . Wij voerden HCP-6 en KLE-2 (condensin II), DPY-26 (condensin I-IDC) en SCC-2 Spaander-seq in null mutant embryo ‘ s van SDC-2 uit. In de SDC-2-mutant werden DPY-26, HCP-6, KLE-2 en SCC-2-binding afgeschaft op een X-specifieke condensin IDC-wervingsplaats (rex-2) (Figuur 5E). Het is onduidelijk waarom de binding van HCP-6 en KLE-2 bij rex-2 verminderd was in plaats van op een autosomale condensinplaats te lijken. De band van SCC-2 aan autosomes en chromosoomplaatsen van X die onafhankelijk van SDC-2 zijn bleef gelijkaardig in de mutant van SDC-2 in vergelijking met plaatsen die door SDC-2 werden gebonden (figuur 5F). Onze resultaten suggereren dat SDC-2, de hermafrodiet-specifieke TF die condensin IDC aan het chromosoom van X werft, ook condensin II en de cohesin Laden complexe subeenheid SCC-2 aan dezelfde plaatsen werft (aanvullend dossier 10: figuur S6). Uit eerdere genetische studies is gebleken dat een nulmutatie van sdc-2 geen embryonale letaliteit bij mannetjes veroorzaakt, dus de functie van condensin II en SCC-2 rekrutering door SDC-2 is niet essentieel voor algemene chromosoomcondensatie en segregatie . Het is mogelijk dat SCC-2 en condensin II rekrutering door SDC-2 een hermafrodiet-specifieke gen regulerende functie heeft.

om te testen of SCC-2 een effect heeft op de chromosomale associatie van condensin IDC op de wervingslocatie, voerden we kwantitatieve PCR-analyse uit van DPY-27-ChIP in controle Versus SCC-2-neerhalingsembryo ‘ s. Door RNAi te voeden, konden we de niveaus van SCC-2 met ongeveer 80% neerhalen (aanvullend dossier 9: figuur S5E). Bij het neerhalen van SCC-2, zagen wij geen significante verandering in DPY-27 die bij rex-1 of rex-2 binden (figuur 5G). Consistent toonde immunofluorescentieanalyse van de condensine I-en II-binding op meiotische chromosomen geen significant verschil tussen wild type-en scc-2-mutanten .