Getting CLARITY: Hydrogel process creates transparent brain
CLARITY process: interview met Stanford bioengineer en psychiater Karl Deisseroth. Lengte: 3:58
“het bestuderen van intacte systemen met dit soort moleculaire resolutie en wereldwijde reikwijdte – in staat zijn om de fijne details en het grote plaatje te zien op hetzelfde moment — is een belangrijke onvervulde doel in de biologie, en een doel dat duidelijkheid begint aan te pakken,” Deisseroth zei.”Deze prestatie van chemical engineering belooft de manier waarop we de anatomie van de hersenen bestuderen en hoe ziekte het verandert te veranderen,” zei Thomas Insel, MD, directeur van het National Institute of Mental Health. “De diepgaande studie van ons belangrijkste driedimensionale orgaan zal niet langer beperkt worden door tweedimensionale methoden.”
Intact volwassen muizenhersenen voor en na het tweedaagse CLARITY process. In de afbeelding rechts zijn de fijne hersenstructuren vaag te zien als de gebieden van onscherpte boven de woorden “getal”, “onontgonnen”, “continent” en ” strekt zich uit.”
het onderzoek in deze studie werd hoofdzakelijk uitgevoerd op een muishersenen, maar de onderzoekers hebben duidelijkheid op zebravis en op bewaarde menselijke hersenensteekproeven met gelijkaardige resultaten gebruikt, die een weg voor toekomstige studies van menselijke steekproeven en andere organismen vestigen.”CLARITY promises to revolutionize our understanding of how local and global changes in brain structure and activity translate into behavior,” said Paul Frankland, PhD, a senior scientist in neurosciences and mental health at the Hospital for Sick Children Research Institute in Toronto, who was not involved in the research. Frankland ‘ s collega, senior wetenschapper Sheena Josselyn, PhD, voegde eraan toe dat het proces de hersenen van “een mysterieuze zwarte doos” kan veranderen in iets in wezen transparant.
een ondoorgrondelijke plaats
de heuvel van ingewikkelde grijze materie en bedrading van de hersenen is een complexe en ondoorgrondelijke plaats. Neurowetenschappers hebben moeite om zijn Circuits volledig te begrijpen in hun zoektocht om te begrijpen hoe de hersenen werken, en waarom, soms, het niet.
Karl Deisseroth
duidelijkheid is het resultaat van een onderzoek in het laboratorium van Deisseroth om de ondoorzichtige elementen — met name de lipiden — uit een brein te halen en toch de belangrijke kenmerken volledig intact te houden. De lipiden zijn vette molecules die door de hersenen en het lichaam worden gevonden. Vooral in de hersenen helpen ze celmembranen te vormen en geven ze de hersenen een groot deel van zijn structuur. De lipiden vormen een dubbele uitdaging voor biologische studie, nochtans, omdat zij de hersenen grotendeels ondoordringbaar zowel aan chemische producten als aan licht maken.Neurowetenschappers hadden graag de lipiden willen extraheren om de fijne structuur van de hersenen te onthullen zonder te snijden of te snijden, maar voor één belangrijke hapering: het verwijderen van deze structureel belangrijke moleculen zorgt ervoor dat het resterende weefsel uit elkaar valt.Eerdere onderzoeken waren gericht op het automatiseren van de slicing/sectioning-benadering, of op het behandelen van de hersenen met organische moleculen die alleen de penetratie van licht vergemakkelijken, maar niet van macromoleculaire sondes. Met alle duidelijkheid heeft het team van Deisseroth een fundamenteel andere aanpak gekozen.”We maakten gebruik van chemische technologie om biologisch weefsel te transformeren in een nieuwe staat die intact is, maar optisch transparant en doorlaatbaar voor macromoleculen,” zei Chung, de eerste auteur van het artikel.
deze nieuwe vorm wordt gecreëerd door de lipiden van de hersenen te vervangen door een hydrogel. De hydrogel wordt gebouwd vanuit de hersenen zelf in een proces conceptueel vergelijkbaar met verstening, met behulp van wat aanvankelijk een waterige suspensie van korte, individuele moleculen bekend als hydrogel monomeren. De intacte, postmortem hersenen zijn ondergedompeld in de hydrogel oplossing, en de monomeren vullen het weefsel. Dan, wanneer” thermisch getriggerd, ” of iets verwarmd tot ongeveer lichaamstemperatuur, de monomeren beginnen te stollen in lange moleculaire ketens bekend als polymeren, het vormen van een gaas door de hersenen. Dit gaas houdt alles bij elkaar, maar, belangrijker, het bindt niet aan de lipiden.
met het weefsel op deze manier geschut, is het team in staat om krachtig en snel lipiden te extraheren door middel van een proces dat elektroforese wordt genoemd. Wat overblijft is een 3-D, transparant brein met al zijn belangrijke structuren – neuronen, axonen, dendrieten, synapsen, eiwitten, nucleïnezuren enzovoort – intact en op zijn plaats.
het gaat beter
duidelijkheid gaat beter. In het behoud van de volledige continuïteit van neuronale structuren, staat de duidelijkheid niet alleen het traceren van individuele neurale verbindingen over lange afstanden door de hersenen toe, maar verstrekt ook een manier om rijke, moleculaire informatie te verzamelen die de functie van een cel beschrijft die met andere methodes niet mogelijk is.”We dachten dat als we de lipiden niet-destructief konden verwijderen, we in staat zouden zijn om zowel licht als macromoleculen diep in het weefsel te laten doordringen, waardoor niet alleen 3D-beeldvorming mogelijk was, maar ook 3-D moleculaire analyse van de intacte hersenen,” zei Deisseroth, die het D. H. Chen-leerstoel bekleedt.
door gebruik te maken van fluorescerende antilichamen waarvan bekend is dat ze zichzelf alleen aan specifieke eiwitten opsporen en hechten, toonde het team van Deisseroth aan dat het specifieke structuren kan richten binnen de CLARITY-modified — of “clarified” — muizenhersenen en die structuren en alleen die structuren kan laten oplichten onder verlichting. De onderzoekers kunnen neurale circuits traceren door het hele brein of diep de nuances van lokale circuitbedrading verkennen. Zij kunnen de relaties tussen cellen zien en subcellulaire structuren onderzoeken. Ze kunnen zelfs kijken naar chemische relaties van eiwitcomplexen, nucleïnezuren en neurotransmitters.
een driedimensionale weergave van geklaarde hersenen van onderaf (ventrale helft). Een fly-through video van knaagdier hersenen is hier beschikbaar.
“in staat zijn om de moleculaire structuur van verschillende cellen en hun contacten te bepalen door middel van antilichaamkleuring is een kernvermogen van duidelijkheid, los van de optische transparantie, die ons in staat stelt om relaties tussen hersencomponenten op fundamenteel nieuwe manieren te visualiseren,” zei Deisseroth, die een van de 15 experts is op het “dream team” dat doelen in kaart zal brengen voor het $100 miljoen hersenonderzoek initiatief aangekondigd op 2 April door President Obama.
en met nog een ander belangrijk vermogen vanuit een onderzoeksstandpunt, zijn onderzoekers nu in staat om de geklaarde hersenen te verwijderen, de fluorescerende antilichamen uit te spoelen en het kleuringsproces opnieuw te herhalen met behulp van verschillende antilichamen om verschillende moleculaire doelwitten in dezelfde hersenen te verkennen. Deze kleuring / ontkleuring proces kan meerdere keren worden herhaald, de auteurs toonden, en de verschillende datasets op elkaar afgestemd.
het openen van de deur
de duidelijkheid heeft het mogelijk gemaakt om zeer gedetailleerde, fijnstructurele analyses uit te voeren op intacte hersenen-zelfs menselijke weefsels die al vele jaren bewaard zijn gebleven, toonde het team aan. Het transformeren van menselijke hersenen in transparante-maar-stabiele specimens met toegankelijke bedrading en moleculair detail kan een beter begrip van de structurele onderbouwing van hersenenfunctie en ziekte opleveren.
driedimensionale weergave van gekleurde hippocampus met fluorescerende expressie neuronen (groen), verbindende interneuronen (rood) en ondersteunende glia (blauw).
naast het onmiddellijke en schijnbare voordeel voor de neurowetenschappen, waarschuwde Deisseroth dat duidelijkheid ons vermogen om met de gegevens om te gaan, heeft vergroot. “Het omzetten van enorme hoeveelheden data in nuttig inzicht stelt immense computationele uitdagingen die moeten worden aangepakt. We zullen moeten ontwikkelen verbeterde computationele benaderingen van beeldsegmentatie, 3-D beeldregistratie, geautomatiseerde tracing en beeldverwerving, ” zei hij.Deze druk zal inderdaad toenemen naarmate de duidelijkheid een dieper begrip van grootschalige intacte biologische systemen en organen, misschien zelfs hele organismen, kan beginnen te ondersteunen.
” van bijzonder belang voor toekomstige studie zijn intrasystem relaties, niet alleen in de zoogdierhersenen, maar ook in andere weefsels of ziekten waarvoor volledige kennis alleen mogelijk is wanneer een grondige analyse van afzonderlijke, intacte systemen kan worden uitgevoerd, ” zei Deisseroth. “Duidelijkheid kan van toepassing zijn op elk biologisch systeem, en het zal interessant zijn om te zien hoe andere takken van de biologie het kunnen gebruiken.”
andere coauteurs zijn bachelorstudent Jenelle Wallace; graduate studentsSung-Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin en Logan Grosenick; assistenten Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak en Charu Ramakrishnan; postdoctorale wetenschappers Aaron Andalman, PhD, en Tom Davidson, PhD; voormalig student Hannah Bernstein; en voormalig wetenschapper Viviana Gradinaru.Het onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Mental Health (grant MH099647); de National Science Foundation; De Simons Foundation; De President en provoost van Stanford University; de Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby en Yu stichtingen; het DARPA reparatie programma; en het Burroughs Wellcome fonds.Stanford ‘ s Department of Bioengineering ondersteunde ook het werk. De afdeling wordt gezamenlijk beheerd door de School Of Engineering en de School Of Medicine.
